羊水過少孕婦胎盤和胎膜中AQP9和HGF表達(dá)及意義

郭金蓮 劉 婭 王秀美 盧 紅

南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院(226600)

羊水過少是臨床常見妊娠并發(fā)癥之一[1-2]。羊水過少一方面導(dǎo)致剖宮產(chǎn)率升高，另一方面早產(chǎn)兒及新生兒窒息發(fā)生率及圍生兒死亡率增加[3]。水通道蛋白(AQPs)是一類促進(jìn)水轉(zhuǎn)運(yùn)的低分子跨膜蛋白。研究表明[4]在正常妊娠胎盤和胎膜組織中存有7種水通道蛋白表達(dá)，其中AQP9不僅對水、尿素、甘油具有通透性，而且還是氨、腺嘌呤、尿嘧啶及5-FU的通道。AQP9參與妊娠期高血壓的病理過程，可能通過線粒體裂殖和觸發(fā)細(xì)胞凋亡過程有關(guān)[5]，與羊水量異常關(guān)系尚不明確。在胎盤間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的滋養(yǎng)細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白稱為肝細(xì)胞生長因子(HGF)[6-7]，對胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均有重要調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)生理性血管重鑄，在胎盤發(fā)生、成熟和絨毛血管網(wǎng)建立并刺激細(xì)胞分離、增值、遷徙起重要作用[8]；是母嬰預(yù)后的重要保護(hù)因素，通過抑制滋養(yǎng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、減少氧自由基聚集來改善胎盤環(huán)境，并刺激肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的DNA合成而減少新生兒呼吸窘迫綜合征的發(fā)生[9-10]。但目前鮮見HGF與羊水量異常的研究報(bào)道。本研究通過檢測羊水過少產(chǎn)婦胎盤和胎膜AQP9和HGF表達(dá)，探討羊水過少的病因及發(fā)病機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集2018年8月—2020年10月本院收治的孕婦130例臨床資料，其中65例出現(xiàn)羊水過少(病例組)，另外65名例羊水正常(對照組)。孕婦年齡22～36歲，孕周37～40周。兩組孕婦均無繼發(fā)性疾病、宮內(nèi)感染、吸煙、飲酒、胎兒發(fā)育異常、急性絨毛膜羊膜炎、胎膜早破、所用藥物包括血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑、非甾體抗炎藥等。排除超聲證實(shí)胎兒異常、胎膜早破、小于胎齡或生長受限胎兒的妊娠；可能影響正常羊水量的其他母體或胎兒疾病，如妊娠或妊娠前糖尿病、高血壓疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病等。分娩前實(shí)時(shí)B超并計(jì)算羊水指數(shù)(AFI)，AFI≤5.0cm定義為羊水過少，5.0～18.0cm為羊水正常。

1.2 AQP9、HGF mRNA水平測定

胎盤、胎膜組織Trizol分離總RNA。使用隨機(jī)引物和 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/ml，F(xiàn)ermentas，Hanover，MD)從2mg RNA合成第一鏈cDNA。用于cDNA合成的反應(yīng)混合物由2ml RNA(1mg/ml)和1ml oligo(dT)18引物(0.5mg/ml)和9ml DEPC水組成。70℃ 5min，冰中快速冷卻1min，添加：反應(yīng)緩沖液4ml，dNTP混合物2ml，Rnase抑制劑(20U/ml)1ml，25℃ 5min。加入200U M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1ml。將反應(yīng)混合物保持在以下循環(huán)條件的熱循環(huán)儀中(25℃ 10min，42℃60 min，70℃10 min)。合成的cDNA儲存在20℃。使用PRISM 7500序列檢測系統(tǒng)行PCR擴(kuò)增。AQP9、HGF、GAPDH由上海生工科技合成，序列：AQP9正向引物：5'-TGCGATCGATCGTAGCTAGCTAGC TAGTCGATCGATCG-3'，反向引物：5'-TGCTAGTCGATCGTAGTCGTAGCTAGCTAG TCGTAGCTAGCTGTGTG-3'；HGF正向引物：5'-TGCTGATCGATGCTAGCGCGTAGCTAGTCG ATCGATGCC-3'，反向引物：5'-TGTCGATCGATGCTAGCTAGCTAGCTGATCGATCGATCGAT CGTAGC-3'；GAPDH正向引物：5'-TGTCGATCGTAGCTAGCTAGTCGATCGATCGATGCTAGC TC-3'，反向引物：5'-TGTCAGTCGATCGATGCTAGCTAGTCGATCGATCGATGCTAGC-3'。AQP9、HGF標(biāo)準(zhǔn)化為內(nèi)部對照GAPDH的含量(-ΔΔCq)。每個(gè)樣品3次重復(fù)分析，計(jì)算平均表達(dá)水平。PCR反應(yīng)總體積為25ml，每孔含有1.25ml TaqMan引物和探針(AQP或b-肌動蛋白)、12.5ml TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI)、5ml cDNA模板和6.25ml DEPC H2O。DNA聚合酶的活化在95℃下10 min，然后40個(gè)循環(huán)，95℃下變性15s和在60℃下退火/延伸1 min。測定均一式3份進(jìn)行。

1.3 AQP9、HGF蛋白水平測定

免疫組織化學(xué)染色。將胎盤胎膜組織室溫4%多聚甲醛溶液中固定24h，石蠟包埋，連續(xù)切片(厚度4μM)。將切片在0.3%過氧化氫的甲醇中孵育15 min，與1.5%非免疫山羊血清孵育15 min。與抗 AQP9、HGF多克隆兔抗體4℃過夜，以 1:100 稀釋，生物素化山羊抗-兔抗體作為二抗，室溫孵育 30 min。鏈霉親和素過氧化物酶標(biāo)記20 min，二氨基聯(lián)苯胺用作色原體 10 min。在程序的每個(gè)步驟后用 PBS 洗滌切片，Mayer蘇木精復(fù)染、脫水并安裝在二苯乙烯二甲苯二丁酯中。適當(dāng)?shù)年栃院完幮詫φ蛰d玻片平行染色。人腎組織用作陽性對照(免疫染色在不存在一抗的情況下與PBS一起孵育)。AQPs陽性細(xì)胞在顯微鏡下(Olympus-FM10)顯示細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜呈黃褐色染色。對AQP9、HGF染色的強(qiáng)度評分：陰性染色0，弱陽性1，中度積極2，強(qiáng)烈肯定3。染色百分比評分：免疫反應(yīng)性細(xì)胞0%為0，≤5%為1，5%～50%為2，51%～80%為3，> 80%為4。IHC分?jǐn)?shù)乘以染色強(qiáng)度百分比，0～4分為陰性表達(dá)，6～12分為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

兩組一般臨床資料比較無差異(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般情況比較

2.2 胎盤組織中AQP9 mRNA、HGF mRNA表達(dá)

病例組胎盤組織中AQP9 mRNA(1.64±1.74)、HGF mRNA(1.53±1.52)表達(dá)水平降低(5.32±0.37、4.69±0.42)(t=13.147、15.641，均P=0.000)；胎盤組織中AQP9(1.36±0.60分)、HGF蛋白表達(dá)評分(2.14±0.46分)低于對照組(5.32±0.29分、5.42±0.61分)(t=16.653、17.835，均P=0.000)；胎盤組織中AQP9、HGF蛋白陽性率低于對照組(P<0.05)。見表2、圖1(封三)。

表2 兩組胎盤組織AQP9、HGF蛋白陽性率比較[例(%)]

2.3 胎膜組織中AQP9mRNA、HGF mRNA表達(dá)

病例組胎膜組織中AQP9 mRNA(1.52±1.23)、HGF mRNA(1.85±1.22)表達(dá)低于對照組(5.26±0.42、4.42±0.39)(t=16.143、12.583，均P=0.000)；胎膜組織中AQP9(1.85±0.32分)、HGF(2.03±0.21分)表達(dá)評分低于對照組(5.03±0.319分、5.10±0.35分)(t=21.468、22.467，均P=0.000)；胎膜組織中AQP9、HGF蛋白陽性率低于對照組(P<0.05)。見表3。圖2(封三)。

表3 兩組胎膜組織中AQP9、HGF蛋白陽性率比較[例(%)]

3 討論

胎兒尿液和胎肺是妊娠中晚期生成羊水的主要來源。AQP9廣泛存在于哺乳動物，由于它們具有不同的胎膜和胎盤，因此AQP水通道可能/在膜內(nèi)吸收或胎盤水轉(zhuǎn)移中調(diào)節(jié)胎兒水流量[11-12]。先前研究發(fā)現(xiàn)，在預(yù)期羊水過多情況下，如由于胎兒血管容量擴(kuò)張或羊食管結(jié)扎導(dǎo)致胎兒吞咽障礙或外源性液體輸注到羊膜腔引起的胎兒多尿，其預(yù)期羊水量增加沒有發(fā)生。相反，胎膜內(nèi)吸收增加了2～3倍，最終導(dǎo)致正常羊水量變化很小或沒有變化[13]。這些研究表明，膜內(nèi)吸收途徑受動態(tài)反饋調(diào)節(jié)，但這些變化的分子機(jī)制尚未完全闡明[14]。研究發(fā)現(xiàn)相對于正常羊水量妊娠，特發(fā)性羊水過多妊娠者羊膜中AQP9表達(dá)增加，因此，本研究推測這種增加的膜內(nèi)流量可能是由AQP9水通道上調(diào)引起的在羊膜中表達(dá)。本文AQP9在羊水過少和正常羊水量孕婦羊膜、絨毛膜和胎盤中均有表達(dá)，與對照組比較，病例組胎盤、胎膜組織中AQP9 mRNA蛋白表達(dá)水平及蛋白陽性率均降低，表明AQP9下調(diào)可能是一種適應(yīng)性反應(yīng)以應(yīng)對羊水過少。胎盤水流在調(diào)節(jié)正常羊水量方面可能同樣重要，因?yàn)榇蟛糠痔核畞碜蕴ケP的母體循環(huán)[15]。AQP9表達(dá)增加與羊膜及胎盤中水、甘油和尿素滲透性增加相吻合。研究表明，AQP9蛋白定位于滋養(yǎng)層細(xì)胞，AQP9可能對調(diào)節(jié)胎盤水流量有影響，當(dāng)發(fā)生羊水過少時(shí)，胎盤中AQP9表達(dá)下調(diào)以增強(qiáng)水和溶質(zhì)從母親到胎兒的運(yùn)輸。

HGF是一種具有血管生成特性的多功能細(xì)胞因子，具有促內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和新生血管生成的作用。這些功能在胎盤形成中具有潛在重要性，其中滋養(yǎng)層、間充質(zhì)和血管內(nèi)皮的增殖和細(xì)胞定向是必需的。有研究[16]表明，HGF基因在鼠和羊胎盤中有表達(dá)，在人類妊娠足月胎膜中也有表達(dá)。在人羊膜中檢測到HGF mRNA和蛋白質(zhì)，在正常足月妊娠的人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了HGF表達(dá)，表明HGF可能在調(diào)節(jié)跨胎膜和胎盤的水通量方面發(fā)揮重要作用。最近，一些研究探討了胎膜中HGF的表達(dá)與羊水異常關(guān)系[17]。轉(zhuǎn)基因HGF基因敲除小鼠后羊水量更低、羊水滲透壓更高。HGF表達(dá)的降低導(dǎo)致羊水減少[18-20]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較,病例組胎盤、胎膜組織中HGF mRNA和蛋白表達(dá)水平及蛋白陽性率明顯降低。使用前列腺素F2a受體(FP)缺陷小鼠建立羊水過少模型，證明發(fā)生羊水過少時(shí)胎膜中的HGF表達(dá)降低，而關(guān)于HGF與羊水過少間分子機(jī)制關(guān)系有待后續(xù)研究。

綜上所述，AQP9、HGF mRNA和蛋白在羊水過少孕婦胎盤及胎膜中表達(dá)降低，提示其可能對母胎液體交換和羊水膜內(nèi)吸收有重要調(diào)控作用。