低深度全基因組測序技術(shù)診斷先天性心臟病胎兒染色體變異病因價(jià)值

陳 曉 張愉萍

廣西壯族自治區(qū)玉林市婦幼保健院(537000)

先天性心臟病(CHD)導(dǎo)致的心臟/胸腔內(nèi)血管形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能異常，為人類常見出生缺陷[1]，在新生兒中發(fā)病率為0.7%～1.1%[2]。2011年我國圍產(chǎn)期CHD發(fā)生率為40.95/萬，為我國排名首位的出生缺陷類型[3]，也是導(dǎo)致新生兒死亡的重要原因之一。CHD發(fā)生原因尚未完全闡明，其中染色體非整倍體異常、染色體拷貝數(shù)變異、單基因突變、表觀遺傳等遺傳因素在CHD發(fā)病中有重要意義[4-5]。低深度全基因組測序(CNV-Seq)通過生物信息分析，可以發(fā)現(xiàn)樣本存在的拷貝數(shù)變異(CNVs)[6]。具有檢測范圍廣、高通量、操作簡便、兼容性好、可檢測低比例嵌合等優(yōu)點(diǎn)，可作為一線產(chǎn)前診斷技術(shù)應(yīng)用于臨床。本研究以收治的高危孕婦為研究對象，評價(jià)CNV-Seq技術(shù)診斷先天性心臟病胎兒的臨床效果。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇本院2021年1月—2022年1月產(chǎn)前診斷中心就診的有高危指證孕婦80例臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)2位超聲醫(yī)師行胎兒超聲心動(dòng)圖檢查確診胎兒患有CHD；孕單胎妊娠，經(jīng)遺傳咨詢自愿接受染色體核型分析及CNV-Seq分析。排除標(biāo)準(zhǔn)：僅行染色體核型分析或僅行CNV-Seq分析。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批，孕婦均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1羊水獲取孕婦孕16～24周時(shí)超聲引導(dǎo)下以21GPTC-B穿刺針經(jīng)腹腔穿刺抽取羊水；孕≥24周時(shí)在超聲引導(dǎo)下，經(jīng)腹臍靜脈穿刺抽取臍帶血，分別行CNV-Seq技術(shù)及染色體核型分析。

1.2.2染色體核型分析將抽取的羊水或臍血無菌離心收集細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)10～14d至細(xì)胞生長狀態(tài)良好；加入秋水仙堿，搜集細(xì)胞常規(guī)制片、G顯帶、鏡下觀察30個(gè)細(xì)胞的分裂相，分析細(xì)胞染色體核型，異常核型或嵌合型，計(jì)數(shù)50個(gè)以上分裂相。

1.2.3CNV-Seq技術(shù)采用貝瑞和康公司的ILLUMINATION NEXTSEQ CN500 測序儀及配套試劑盒，按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程行DNA提取、文庫構(gòu)建、文庫稀釋變性、測序、結(jié)果分析。結(jié)果判讀參考DGV、ISCA、OMIM、DECIPHER等數(shù)據(jù)庫，根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)指南將測序結(jié)果分為良性CNVs、意義不明確的CNVs、致病性CNVs。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析

80例高危指證孕婦年齡(28.6±4.8)歲(20～45歲)，孕周(26.5±1.9)周(20～31周)；67例接受羊膜腔穿刺，13例接受臍靜脈穿刺。80例CHD胎兒中檢出8例染色體核型異常，檢出率為10.0%。異常類型分別為21-三體綜合征4例、18-三體綜合征3例、46，XX，der(6)(q16q22)1例；超聲結(jié)果為法洛四聯(lián)癥2例(21-三體綜合征)、室間隔缺損5例(18-三體綜合征/21-三體綜合征)、左心發(fā)育不良1例(11長臂缺失)。余72例CHD胎兒染色體核型檢測結(jié)果未見異常。

2.2 CNV-Seq技術(shù)檢測分析

80例CHD胎兒CNV-Seq檢測結(jié)果顯示，染色體核型分析異常8例，均為CNV-Seq檢出與染色體核型分析結(jié)果一致的致病性CNVs。其中1例胎兒染色體核型為46，XX，der(6)(q16q22)，CNV-Seq結(jié)果為6q16.1q22.33處有長29Mb拷貝數(shù)缺失，涉及POPDC3、SIMI、FOXO3基因等。染色體核型分析結(jié)果正常的72例胎兒中，CNV-Seq檢出4例致病性CNVs，檢出率為5.6%；1例VOUS，檢出率為1.4%。

2.3 檢測異常核型CNVs構(gòu)成情況

檢出發(fā)生較多的致病CNVs種類、超聲及妊娠結(jié)局10例分布見表1。

表1 檢出例數(shù)較多的CNVs種類超聲及妊娠結(jié)局

續(xù)表

2.4 不同方法胎兒異常核型檢出情況

本研究超聲胎兒結(jié)構(gòu)異常和合并其他異常(胎兒軟指標(biāo)異常、羊水量異常、宮內(nèi)FGR等)，CNV-Seq技術(shù)異常檢出率分別為7.5%(6例)、11.2%(9例)，總檢出22.5%(18例)；核型分析異常檢出率分別為6.3%(5例)、3.8%(3例)，總檢出10.0%(8例)。兩種技術(shù)異常核型總檢出率有差異(χ2=20.0948，P<0.0001)。

2.5 不同高危指征孕婦胎兒異常核型檢出情況

80份胎兒細(xì)胞檢出異常核型18例，異常檢出率為22.5%；臨床意義未明的拷貝數(shù)變異62例，根據(jù)孤立的心臟結(jié)構(gòu)異常和合并其他指征進(jìn)行分組，不同高危指征孕婦異常核型檢出情況見表2。

表2 各高危指征孕婦胎兒核型異常檢出情況[例(%)]

2.6 妊娠結(jié)局及追蹤隨訪情況

80例孕婦中，失訪2例(2.5%)；終止妊娠44例(55.0%)，其中染色體異常18例，合并結(jié)構(gòu)畸形27例；36例(45%)出生，其中2例嬰幼兒為先天性CHD(2例核型、CNV-Seq正常但超聲診斷1例為胎兒室間隔缺損、主動(dòng)脈騎跨、肺動(dòng)脈稍小，不排除法洛氏四聯(lián)征；1例U型血管環(huán))。其余均存活至今未見明顯不良預(yù)后。

3 討論

在生物體胚胎發(fā)育過程中心臟為較早生成、發(fā)育的器官之一。人類心臟在胚胎發(fā)育的第3周即開始出現(xiàn)[7]，原始心源性細(xì)胞在相關(guān)基因調(diào)控下，發(fā)生遷移、分化、精確組合[8]，逐步發(fā)育成具備完整功能的心臟。在胚胎發(fā)育過程中，外界環(huán)境變化或內(nèi)在遺傳物質(zhì)變異，可影響心臟發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[9]，形成心臟先天性發(fā)育不良。產(chǎn)前超聲影像學(xué)檢查為發(fā)現(xiàn)胎兒CHD的重要手段，但超聲診斷能力有限，無法確定胎兒的心臟缺血僅為獨(dú)立表型或?yàn)槟尘C合征的表型之一[10]。對CHD胎兒行遺傳學(xué)檢測，可輔助診斷綜合征型CHD，對胎兒的長期預(yù)后做出判斷。

在遺傳學(xué)發(fā)展早期，臨床多采用染色體核型分析進(jìn)行遺傳學(xué)檢測[11]，可觀察染色體數(shù)目及顯微結(jié)構(gòu)改變。目前臨床廣泛采用的CNV-Seq技術(shù)可在全基因組水平上對染色體缺失/重復(fù)進(jìn)行檢測[12]。對比核型分析、X-失活分析、基因靶向分析，CNV-Seq具有最高的異常檢出率和最低的漏診率，可作為發(fā)育遲緩/智力低下、自閉癥癥候群、多發(fā)性先天性異常者的細(xì)胞遺傳學(xué)檢測方法[6]。

在本研究中，80例CHD胎兒分別行染色體核型分析及CNV-Seq分析。結(jié)果表明，染色體核型分析異常染色體檢出率為10.0%，CNV-Seq技術(shù)染色體拷貝數(shù)異常的檢出率為15.0%，有明確臨床致病意義的檢出率為13.8%。染色體核型分析正常的72例CHD胎兒中，CNV-Seq檢出3例染色體拷貝數(shù)微缺失，檢出率增加了4.2%。此3例染色體拷貝數(shù)微缺失均檢出致病基因。表明致病性CNVs檢出率可能與CHD類型不一，與研究對象的臨床多樣性、微陣列平臺(tái)探針大小不一等有關(guān)。均說明CNV-Seq分析可提高致病性CNVs的檢出率[13-14]。本次研究結(jié)果也證實(shí)了CHD的遺傳學(xué)病因，除染色體數(shù)量、結(jié)構(gòu)異常外，還存在染色體微缺失微重復(fù)。

綜上所述，CHD的發(fā)生與基因異常有關(guān)。與傳統(tǒng)的染色體核型分析相比，對CHD胎兒進(jìn)行CNV-Seq遺傳致病因素檢測，不僅能檢測出CHD胎兒常規(guī)的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常等遺傳學(xué)病因外，還可以檢測到更為精準(zhǔn)的染色體片段微缺失微重復(fù)信息，以彌補(bǔ)染色體核型分析在產(chǎn)前臨床咨詢中評估胎兒預(yù)后的不足，可為遺傳學(xué)咨詢，輔助孕婦做出引產(chǎn)或繼續(xù)妊娠決策提供依據(jù)。