子宮內膜異位癥不孕患者著床窗口期內膜組織中MDM4、miR-144-3p表達及其意義

苗紅艷 王飛剛 韋彩霞 宋瑞香

河南省三門峽市中心醫(yī)院(472000)

子宮內膜異位癥(EMS)與不孕關系密切，有25%～47%的EMS患者出現不孕癥狀，且不孕患者中較多患者發(fā)生EMS[1]。需尋找密切相關的生物指標，用于疾病的治療和預后評估。鼠雙微體4(MDM4)又稱MDMX，是p53的重要調控因子。有研究顯示，惡性腫瘤中MDM4對p53的表達有抑制作用[2]；張麗莉等[3]研究顯示，MDM4與絨毛外細胞滋養(yǎng)層細胞的遷移和侵襲有關。而既往研究顯示，絨毛外細胞滋養(yǎng)層細胞侵襲能力不足與不孕存在一定關系[4]。前期研究中微小RNA-144-3p(miR-144-3p)與MDM4可能存在靶向調節(jié)關系。因此，本研究探究EMS不孕及輸卵管因素不孕患者子宮內膜組織中miR-144-3p、MDM4表達水平及意義。

1 對象和方法

1.1 研究對象

收集本院2019年10月—2021年8月資料齊全的EMS不孕患者62例為EMS組，輸卵管因素不孕患者59例為對照組。EMS診斷主要符合《子宮內膜異位癥的診斷與治療規(guī)范》[7]依據有痛經、慢性盆腔痛、性交痛等疼痛且不孕；B超檢查影像為附件區(qū)無回聲包塊，內有強光點；婦科檢查子宮為后位、活動度差，宮骶韌帶、子宮直腸陷凹或后穹隆觸痛結節(jié)，可同時存在附件囊性、不活動包塊；血清CA125水平輕中度升高。輸卵管因素不孕診斷：宮腹腔鏡觀察宮腔、輸卵管開口情況及兩側輸卵管行通液、輸卵管通暢度，輸卵管扭曲36例、輸卵管積液阻塞16例、傘端閉鎖7例；EMS患者卵巢儲備功能正常，月經規(guī)律，無不規(guī)則陰道流血；③性生活正常，未避孕而不孕1年以上。排除有EMS手術病史，合并臟器功能異常及惡性腫瘤，6個月內有妊娠史、哺乳史及刮宮手術史。研究獲本院臨床倫理委員會批準且患者簽署知情同意書。

1.2 樣品采集

研究對象自月經周期第9天起采用B超監(jiān)測卵泡生長狀況，當卵泡直徑達14 mm時行宮腔鏡檢查并行子宮內膜活檢，獲得卵泡期子宮內膜組織。繼續(xù)監(jiān)測，每天尿LH試紙檢測2次，當LH試紙出現雙線，同時B超檢查見排卵征象后的5 d行子宮內膜活檢，獲得著床窗口期子宮內膜組織。將獲得的子宮內膜組織部分置于液氮中凍存，用于mRNA檢測；部分置于10%的甲醛溶液中固定，用于MDM4蛋白檢測。

1.3 子宮內膜組織MDM4mRNA、miR-144-3p表達水平檢測

采用實時熒光定量-聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)法檢測組織MDM4 mRNA、miR-144-3p表達水平。RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)提取子宮內膜組織總RNA，Nano Drop2000微量分光光度計(美國Thermo公司)檢測RNA濃度。取RNA，使用反轉錄試劑盒(北京凱詩源生物科技有限公司)反轉錄為cDNA。采用ABI 7500型RT-qPCR儀(美國ABI公司)擴增，擴增條件：95℃預變性10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共45個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算子宮內膜組織MDM4 mRNA、miR-144-3p相對表達量，U6、GAPDH分別為miR-144-3p、MDM4的內參基因，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 MDM4蛋白檢測

采用免疫組織化學法[試劑盒購自西寶生物科技(上海)股份有限公司]檢測子宮內膜組織MDM4蛋白表達水平。陽性率評分：陽性細胞>75%記4分，51%～75%記3分，26%～50%記2分，5%～25%記1分，<5%記0分；染色強度評分：棕褐色記3分，棕黃色記2分，淡黃色記1分，無著色記0分。以陽性率評分和染色強度評分乘積為免疫組織化學染色最終評分，0～2分為陰性，>2分為陽性。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 一般資料

兩組一般臨床資料比較無差異(P>0.05)。見表2。

表2 兩組一般資料比較

2.2 著床窗口期子宮內膜組織中MDM4、miR-144-3p水平

EMS組著床窗口期子宮內膜組織中MDM4 mRNA水平及蛋白陽性率高于對照組，miR-144-3p水平低于對照組(P<0.05)。見表3、圖1(1212頁)。Pearson法分析，EMS組著床窗口期子宮內膜組織中MDM4 mRNA與miR-144-3p水平呈負相關(r=-0.679，P<0.05)；Spearman法分析，MDM4蛋白與miR-144-3p水平呈負相關(r=-0.502，P<0.05)。

2.3 卵泡期子宮內膜組織中MDM4、miR-144-3p水平

卵泡期子宮內膜組織中miR-144-3p、MDM4 mRNA水平及蛋白陽性率兩組無差異(P>0.05)。見表3。Pearson法分析，EMS組卵泡期子宮內膜組織中MDM4 mRNA與miR-144-3p水平呈負相關(r=-0.359，P<0.05)；Spearman法分析，MDM4蛋白與miR-144-3p水平呈負相關(r=-0.432，P<0.05)。

表3 兩組不同期子宮內膜組織中各指標比較

3 討論

EMS患者以盆腔疼痛、月經失調、不孕等癥狀為主要臨床表現，EMS是引起女性不孕的重要原因之一[5]。本研究結果顯示，EMS不孕患者與輸卵管因素不孕患者痛經癥狀差異不顯著，可能是由于納入樣本量較小及納入病例的偏倚性，本研究納入的EMS不孕患者病情相對較輕，今后將加大樣本量進一步探究。目前關于EMS不孕的發(fā)生機制仍未完全闡明，隨著研究深入，越來越多證據表明，EMS患者在位子宮內膜容受性下降所致的著床失敗是不孕的重要原因[6]。

MDM4作為一個原癌基因在多種腫瘤中高表達，且能調控p53等蛋白表達[7-8]。張惟等[9]研究顯示，MDM4與腎癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力密切相關；Palomares等[10]研究顯示，MDM4及p53基因多態(tài)性與持續(xù)妊娠及可變流產事件相關。miRNA的異常表達可影響細胞增殖、分裂、凋亡、發(fā)育，參與惡性腫瘤形成、發(fā)展及轉移、侵襲等過程，且與EMS及不孕密切相關[11]。miR-144-3p也廣泛參與各類細胞的增殖等過程[12-13]。錢進等[14]研究表明，miR-144可通過調控MDM4的表達來抑制成纖維樣滑膜細胞在炎癥環(huán)境中的增殖。

本研究結果顯示，EMS不孕患者著床窗口期、卵泡期子宮內膜組織中MDM4 mRNA、MDM4蛋白與miR-144-3p水平均呈負相關，與既往文獻中MDM4與miR-144-3p的表達趨勢及調控關系一致，且在EMS不孕患者中進一步驗證了生物信息學分析結果中MDM4與miR-144-3p的靶向關系。此外，本研究結果顯示，EMS不孕患者著床窗口期子宮內膜組織中MDM4表達高于輸卵管因素不孕患者，miR-144-3p低于輸卵管因素不孕患者，而在卵泡期中其表達未見差異。有研究顯示，胚泡著床是一個復雜的生理過程，其著床前及著床過程中，子宮內膜及胚泡均處于動態(tài)發(fā)育過程，而胚泡著床必須子宮內膜與胚泡處于同步發(fā)育且相互配合才能完成[15]。而僅在窗口期時子宮內膜才允許胚泡著床，此時期子宮內膜對胚泡的接受能力即子宮內膜容受性[16]。基于既往文獻推測，EMS患者體內病理因素造成著床窗口期miR-144-3p表達水平下降，而miR-144-3p靶向調節(jié)MDM4，使其蛋白表達增加，MDM4異常表達改變了p53的基因的功能[17]。進一步介導免疫炎癥反應，產生各類細胞因子，影響胚泡著床，導致子宮內膜容受性降低，最終影響不孕的發(fā)生發(fā)展，但其具體生物機制有待進一步通過動物模型和細胞模型驗證。

綜上所述，EMS不孕患者著床窗口期子宮內膜組織中MDM4高表達，miR-144-3p低表達，二者呈負相關。然而本研究中關于MDM4、miR-144-3p與EMS不孕的關系研究仍處于初步階段，僅探索了二者在EMS不孕患者及輸卵管因素不孕患者中的表達情況。隨著今后對EMS不孕患者中MDM4、miR-144-3p異常表達的深入研究，有望能進一步闡明EMS不孕的發(fā)病機制，了解其生物學機制，進而為治療EMS及其不孕癥提供新方法。