超聲彈性成像聯(lián)合多基因檢測(cè)對(duì)細(xì)胞學(xué)結(jié)果不確定甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別診斷價(jià)值

施麗丹 強(qiáng)旭釗

文獻(xiàn)[1-2］報(bào)道, 甲狀腺惡性結(jié)節(jié)發(fā)生率約占所有甲狀腺結(jié)節(jié)的1%～5%, 且有20%～30%的結(jié)節(jié)細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查無法準(zhǔn)確定性診斷, 及時(shí)準(zhǔn)確地對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性進(jìn)行鑒別診斷有助于為臨床治療提供指導(dǎo)。超聲彈性成像是臨床鑒別良惡性腫瘤的常用方法, 已廣泛用于乳腺、肝臟及甲狀腺良惡性病變的診斷。研究[3］表明, 超聲彈性成像雖然能為甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別診斷提供重要參考, 但也具有較高的漏誤診率。近年來, 臨床對(duì)甲狀腺癌基因的研究[4］發(fā)現(xiàn)其存在基因突變情況, 故提出采用多基因檢測(cè)方法鑒別診斷甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性。但基因突變和融合是一個(gè)較為漫長(zhǎng)的過程, 發(fā)病早期很可能無法檢出, 且良性結(jié)節(jié)也存在基因突變和融合的可能, 從而影響診斷準(zhǔn)確率?；诖? 本研究旨在探討超聲彈性成像聯(lián)合多基因檢測(cè)在細(xì)胞學(xué)結(jié)果不確定甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別診斷中的價(jià)值。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2019年5月至2020年6月我院收治的124例細(xì)胞學(xué)結(jié)果不確定甲狀腺結(jié)節(jié)患者, 男45例, 女79例, 年齡24～68歲, 平均（45.21±3.52）歲；單發(fā)結(jié)節(jié)112例, 多發(fā)結(jié)節(jié)12例, 共計(jì)136個(gè)結(jié)節(jié), 結(jié)節(jié)最大徑6.0～46.0 mm, 平均（26.32±5.85）mm；其中BethesdaⅢ類29個(gè), Ⅳ類48個(gè), Ⅴ類59個(gè)；91個(gè)惡性結(jié)節(jié), 包括微小乳頭狀癌24個(gè), 經(jīng)典型乳頭狀癌58個(gè), 濾泡變異型乳頭狀癌9個(gè)；45個(gè)良性結(jié)節(jié), 包括甲狀腺濾泡狀腺瘤18個(gè), 結(jié)節(jié)性甲狀腺腫12個(gè), 乳頭狀增生15個(gè)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①甲狀腺結(jié)節(jié)最大徑＞5.0 mm；②均經(jīng)病理結(jié)果證實(shí), 細(xì)胞學(xué)病理結(jié)果為BethesdaⅢ、Ⅳ、Ⅴ類；③臨床資料完整；④均為首次接受甲狀腺結(jié)節(jié)手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①單純囊性甲狀腺結(jié)節(jié)；②細(xì)胞學(xué)病理結(jié)果為BethesdaⅠ、Ⅱ、Ⅵ類；③合并其他惡性腫瘤。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn), 所有患者均知情同意。

二、儀器與方法

1.超聲彈性成像檢查：使用邁瑞Resona 7彩色多普勒超聲診斷儀, L11-3U線陣探頭, 頻率5.6～10.0 MHz。患者取仰臥位, 充分暴露頸后, 先行二維超聲觀察結(jié)節(jié)大小、形態(tài)、回聲、邊界、實(shí)質(zhì)背景回聲、鈣化等情況, 保存圖像；然后切換至超聲彈性成像模式, 感興趣區(qū)設(shè)置需大于病灶并包括病灶周圍部分正常組織, 探頭置于病變部位微小振動(dòng)1～2次/s, 獲得穩(wěn)定圖像后保留縱向和橫向的彈性成像圖。參考周超等[5］提出的改良5分法對(duì)病灶進(jìn)行彈性成像評(píng)分：1分, 病灶均為綠色；2分, 病灶核心為藍(lán)色, 周邊為綠色；3分, 病變區(qū)域綠色和藍(lán)色占比相等；4分, 病灶基本為藍(lán)色或內(nèi)部夾雜綠色, 綠色少量；5分, 病灶均為藍(lán)色；本研究將4～5分判定為惡性, 1～3分判定為良性。以上操作均由同一具有10年工作經(jīng)驗(yàn)的超聲醫(yī)師完成。

2.多基因檢測(cè)：采用二代測(cè)序方法進(jìn)行多基因檢測(cè)?；颊呷⊙雠P位, 充分暴露頸后, 消毒、鋪巾, 于超聲引導(dǎo)下進(jìn)行穿刺, 多發(fā)結(jié)節(jié)穿刺目標(biāo)為超聲提示最可疑結(jié)節(jié), 將22 G一次性PTC穿刺針?biāo)椭聊繕?biāo)結(jié)節(jié)中心, 拔除針芯, 向不同方向提插5～6次后取出穿刺針, 將提取的標(biāo)本放入細(xì)胞保存液中待檢, 獲取組織RNA和DNA后對(duì)其進(jìn)行質(zhì)檢, 建立測(cè)序文庫(kù), 采用Life TechnologyTM（美國(guó)）的S5測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè), 包括DNA突變和RNA融合。惡性判定標(biāo)準(zhǔn)[6］：①具有惡性特征性點(diǎn)突變；②具有基因融合；③非特異性突變。良性判定標(biāo)準(zhǔn)：①無突變及融合；②具有良性特征點(diǎn)突變；③非特異性突變頻率＜30%。

3.兩種方法聯(lián)合診斷標(biāo)準(zhǔn)：兩種方法檢查結(jié)果均為良性判為良性；兩種方法中任一種檢查結(jié)果為惡性判定惡性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件, 計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或率表示, 采用χ2檢驗(yàn)。采用四格表分析兩種方法檢查結(jié)果與病理結(jié)果的一致性, 計(jì)算Kappa值。繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析超聲彈性成像、多基因檢測(cè)及兩者聯(lián)合對(duì)細(xì)胞學(xué)結(jié)果不確定甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別診斷價(jià)值, 曲線下面積（AUC）比較行Z檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、超聲彈性成像、多基因檢測(cè)單獨(dú)及聯(lián)合檢查結(jié)果

超聲彈性成像、多基因檢測(cè)單獨(dú)及聯(lián)合檢查結(jié)果見表1。

表1 超聲彈性成像、多基因檢測(cè)單獨(dú)及聯(lián)合診斷甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性情況 個(gè)

1.超聲彈性成像準(zhǔn)確檢出71個(gè)甲狀腺惡性結(jié)節(jié), 彈性成像評(píng)分4分者28個(gè), 5分者43個(gè)；檢出26個(gè)甲狀腺良性結(jié)節(jié), 彈性成像評(píng)分1分者6個(gè), 2分者8個(gè), 3分者12個(gè)。見圖1。超聲彈性成像診斷甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的敏感性78.02%, 特異性57.78%。

圖1 肝臟原發(fā)惡性黑色素瘤伴轉(zhuǎn)移超聲造影圖

圖1 細(xì)胞學(xué)結(jié)果不確定甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)的超聲彈性成像圖

2.多基因檢測(cè)準(zhǔn)確檢出78個(gè)甲狀腺惡性結(jié)節(jié), 其中BRAFV600E點(diǎn)突變49個(gè)、NRAS點(diǎn)突變13個(gè)、KRAS點(diǎn)突變8個(gè)、CCDC6/RET融合4個(gè)、STRN/SLK融合2個(gè)、ETV6/NTRK3融 合 和PAX8/PPARG融合各1個(gè)；檢出33個(gè)甲狀腺良性結(jié)節(jié), EZH1者13個(gè)、SPOP和ZHF148各10個(gè)。多基因檢測(cè)診斷甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的敏感性85.71%, 特異性73.33%。

3.超聲彈性成像聯(lián)合多基因檢測(cè)準(zhǔn)確檢出87個(gè)甲狀腺惡性結(jié)節(jié)和40個(gè)甲狀腺良性結(jié)節(jié), 診斷敏感性95.60%, 特異性88.89%。

二、一致性分析

124例甲狀腺結(jié)節(jié)患者多基因檢測(cè)結(jié)果與病理結(jié)果的一致性Kappa值為0.587（P＜0.05）, 超聲彈性成像檢查結(jié)果與病理結(jié)果的一致性Kappa值為0.356（P＜0.001）, 兩種方法聯(lián)合與病理結(jié)果的一致性Kappa值為0.850（P＜0.001）。見表1。

三、ROC曲線分析

ROC曲線分析顯示, 超聲彈性成像、多基因檢測(cè)及兩者聯(lián)合鑒別診斷細(xì)胞學(xué)結(jié)果不確定甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的AUC分別為0.651（95%可信區(qū)間0.571～0.730）、0.804（95%可信區(qū)間0.738～0.869）、0.896（95%可信區(qū)間0.845～0.947）。多基因檢測(cè)的AUC與超聲彈性成像和兩者聯(lián)合比較, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.907、2.190,P=0.002、0.028）；超聲彈性成像的AUC與兩者聯(lián)合比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=5.046,P＜0.001）。見圖2。

圖2 肝臟原發(fā)惡性黑色素瘤伴轉(zhuǎn)移增強(qiáng)CT圖

圖2 超聲彈性成像、多基因檢測(cè)及兩者聯(lián)合診斷細(xì)胞學(xué)結(jié)果不確定甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的ROC曲線圖

討 論

超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查是目前臨床鑒別診斷甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的常用方法, 但仍有部分結(jié)節(jié)的性質(zhì)無法明確診斷, 臨床稱其為細(xì)胞學(xué)結(jié)果不確定的甲狀腺結(jié)節(jié)[7］。根據(jù)Bethesda分類可將此類細(xì)胞學(xué)結(jié)果不確定的結(jié)節(jié)分為3種[8］：①Ⅲ類, 指性質(zhì)未明確的細(xì)胞非典型病變或?yàn)V泡性病變；②Ⅳ類, 指濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤；③Ⅴ類, 指可疑惡性腫瘤。研究[9］表明, 上述3類結(jié)節(jié)惡性幾率約為3.00%～99.00%, 術(shù)前如何準(zhǔn)確診斷BethesdaⅢ、Ⅳ、Ⅴ類甲狀腺結(jié)節(jié)一直是臨床研究的重點(diǎn)。

超聲彈性成像是通過在外力壓迫下使組織發(fā)生形變來量化組織彈性[10］。組織彈性取決于細(xì)胞、細(xì)胞膜、血管外基質(zhì)、微血管等結(jié)構(gòu), 而腫瘤、炎癥能通過改變組織成分和結(jié)構(gòu)增加實(shí)質(zhì)硬度[11］。本研究超聲彈性成像準(zhǔn)確檢出甲狀腺惡性結(jié)節(jié)71個(gè), 良性結(jié)節(jié)26個(gè)；惡性結(jié)節(jié)中彈性成像評(píng)分4分者28個(gè), 5分者43個(gè)；良性結(jié)節(jié)中彈性成像評(píng)分1分者6個(gè), 2分者8個(gè), 3分者12個(gè), 其與病理結(jié)果的一致性差（Kappa=0.356）。表明超聲彈性成像檢查結(jié)果存在假陽(yáng)性和假陰性情況（假陽(yáng)性19個(gè)、假陰性20個(gè)）。分析原因可能與組織受力不均有關(guān), 當(dāng)頸部皮膚表面凹凸不平或伴有大面積瘢痕或黑斑等時(shí), 探頭加壓易出現(xiàn)受力不均勻的情況, 從而導(dǎo)致假陰性, 一定程度上影響診斷準(zhǔn)確率[12］。另外, 受炎癥因子的影響, 組織成分及其結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生改變, 如引起纖維化或鈣化等, 也可能誤診為惡性結(jié)節(jié), 導(dǎo)致假陽(yáng)性事件[13］。

近年來, 隨著臨床對(duì)甲狀腺癌發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 甲狀腺惡性結(jié)節(jié)患者存在基因突變情況, 如國(guó)內(nèi)應(yīng)用較多的BRAFV600E點(diǎn)突變檢測(cè), 為甲狀腺乳頭狀癌常見基因變異類型, 多見于BethesdaⅥ類結(jié)節(jié)[14］。針對(duì)該基因分析發(fā)現(xiàn), 其在細(xì)胞學(xué)結(jié)果不確定甲狀腺結(jié)節(jié)中存在相對(duì)較少, 本研究共檢出BRAFV600E點(diǎn)突變共49個(gè), 但不能排除其他基因突變情況。因此, 本研究建議行多基因檢測(cè)對(duì)此類甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性進(jìn)行鑒別診斷, 結(jié)果顯示除BRAFV600E點(diǎn)突變外, 還檢 出NRAS點(diǎn) 突 變13個(gè), KRAS點(diǎn) 突 變8個(gè), ETV6/NTRK3點(diǎn)突變1個(gè), CCDC6/RET融合4個(gè), STRN/SLK融合2個(gè), PAX8/PPARG融合1個(gè)；提示上述基因突變或融合能為臨床診斷甲狀腺惡性結(jié)節(jié)提供重要參考。但多基因檢測(cè)同樣也存在假陽(yáng)性和假陰性情況（假陽(yáng)性12個(gè), 假陰性13個(gè)）, 因此本研究進(jìn)一步探討超聲彈性成像與多因基檢測(cè)聯(lián)合應(yīng)用的價(jià)值。

本研究ROC曲線分析顯示, 超聲彈性成像、多基因檢測(cè)及兩者聯(lián)合應(yīng)用鑒別診斷細(xì)胞學(xué)結(jié)果不確定甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的AUC分別為0.651、0.804、0.896；聯(lián)合應(yīng)用的AUC（0.896）高于兩種方法單獨(dú)應(yīng)用, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）, 提示兩者聯(lián)合有利于進(jìn)一步提高診斷效能, 降低假陽(yáng)性和假陰性的情況。分析原因?yàn)閮煞N方法聯(lián)合診斷克服了單一檢查方法各自的不足。

綜上所述, 超聲彈性成像聯(lián)合多基因檢測(cè)在細(xì)胞學(xué)結(jié)果不確定甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別診斷中具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。但本研究為回顧性研究, 納入對(duì)象可能存在選擇偏差, 今后需行多中心大樣本前瞻性研究進(jìn)一步證實(shí)。