單分子生物檢測(cè)方法及應(yīng)用研究進(jìn)展

周文超 ，李政昊,2?，武 杰,2

（1. 中國(guó)科學(xué)院 長(zhǎng)春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所 應(yīng)用光學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 吉林 長(zhǎng)春 130033；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049）

? 共同第一作者

1 引 言

單分子是探索生物性質(zhì)過程的最小單元。對(duì)單分子的研究有助于發(fā)現(xiàn)生物系統(tǒng)中時(shí)間和空間的異質(zhì)性，以及觀測(cè)生物分子的潛在機(jī)制。單生物分子主要包括蛋白質(zhì)、核酸、病毒和生物小分子等，高靈敏度檢測(cè)可以量化單個(gè)生物分子，在臨床診斷和探索潛在疾病等應(yīng)用上，起到至關(guān)重要的作用。目前被廣泛使用的單分子檢測(cè)方法包括表面等離子體共振(SPR)，光波導(dǎo)光柵(OWG)，生物層干涉法(BLI)，酶聯(lián)免疫法(ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和質(zhì)譜分析法等，用于定量檢測(cè)患者樣本中的生物分子水平，檢測(cè)結(jié)果對(duì)評(píng)估患者的健康狀況和規(guī)劃治療方案非常重要。然而，血液、唾液或其他生物體液中許多潛在、起到?jīng)Q定性作用的蛋白質(zhì)、核酸或生物標(biāo)志物的濃度遠(yuǎn)低于當(dāng)前方法的檢測(cè)限，因此需要開發(fā)檢測(cè)限更低的技術(shù)。具有在臨床樣本中測(cè)量低濃度生物標(biāo)志物的能力，就可以通過無創(chuàng)或微創(chuàng)的方式提前發(fā)現(xiàn)疾病。因此，需要超靈敏的分析技術(shù)來檢測(cè)和分析當(dāng)前無法檢測(cè)到的重要生物標(biāo)志物。

單分子生物檢測(cè)技術(shù)在低濃度蛋白、核酸和其他生物相關(guān)分子的超靈敏分析方面具有巨大的應(yīng)用潛力。與傳統(tǒng)方法檢測(cè)生物分子整體平均值不同，單分子檢測(cè)方法可以測(cè)量到單個(gè)生物分子層次。核酸作為生命的基本分子之一，具有儲(chǔ)存、傳遞和表達(dá)遺傳信息的能力，也與各種臨床疾病密切相關(guān)，已成為臨床診斷和治療的重要依據(jù)。在核酸檢測(cè)方面，該技術(shù)準(zhǔn)確性高，可以直接識(shí)別堿基，實(shí)現(xiàn)核酸的長(zhǎng)讀取，從而發(fā)現(xiàn)新發(fā)致病結(jié)構(gòu)變異。蛋白質(zhì)分子在生物體中執(zhí)行許多重要的任務(wù)，包括代謝催化、DNA 轉(zhuǎn)錄和復(fù)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和分子運(yùn)輸?shù)?。在蛋白質(zhì)與多肽檢測(cè)方面，單分子生物傳感器除了具有高靈敏度、特異性和選擇性外，顯示的分析時(shí)間更短，這使得臨床環(huán)境和新的藥物研發(fā)中的矩陣高通量分析成為可能。除了蛋白質(zhì)和核酸，單分子檢測(cè)還可以應(yīng)用于在代謝途徑、臨床診斷和藥物中發(fā)揮不同作用的小分子，發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞中的個(gè)體異常，量化人體中含量極低的生物小分子，對(duì)解決生命科學(xué)中許多長(zhǎng)期存在的問題具有十分重大的意義。

2 發(fā)展、分類及應(yīng)用

霍爾于1956 年用透射電子顯微鏡（EM）拍攝到第一張單生物分子圖像，包括脫氧核糖核酸（DNA）分子和膠原蛋白等生物分子，對(duì)細(xì)胞潛在過程的生物學(xué)機(jī)制研究有了實(shí)質(zhì)性的突破[1]。1961 年，斯坦福醫(yī)學(xué)院的Rotman 教授第一次實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)，他將含有β-半乳糖苷酶和熒光底物的混合溶液噴在硅油上，在油中產(chǎn)生液滴，每個(gè)液滴中含有0 個(gè)或1 個(gè)酶分子，經(jīng)過數(shù)小時(shí)的等待，能夠通過觀察發(fā)出熒光的液滴來檢測(cè)和測(cè)量出單個(gè)酶分子的存在[2]。隨后，研究人員將膜片鉗用于單分子的相關(guān)研究，為離子通道蛋白檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)[3]。早在1976 年，Hirschfeld開始進(jìn)行光學(xué)單分子檢測(cè)的相關(guān)研究，使用異硫氰酸熒光素的80～100 個(gè)分子對(duì)20 000 kDa 聚乙烯亞胺進(jìn)行標(biāo)記，然后將這種高熒光聚合物與γ-球蛋白結(jié)合，使用全內(nèi)反射顯微鏡，用高強(qiáng)度激光檢測(cè)單個(gè)蛋白質(zhì)分子。在完全光漂白之前最大化熒光信號(hào)（當(dāng)時(shí)的探測(cè)器性能較現(xiàn)在的集成探測(cè)器略差，這樣做可以盡可能多地收集光子），根據(jù)已知的分子濃度進(jìn)行檢測(cè)，觀察熒光檢測(cè)的預(yù)計(jì)數(shù)量[4]。這次實(shí)驗(yàn)非常重要，因?yàn)樗鞘状尾皇褂妹傅膯畏肿訙y(cè)量，也是第一個(gè)使用全內(nèi)反射進(jìn)行單分子檢測(cè)的研究。1988 年，Gelles 等人通過對(duì)計(jì)算機(jī)圖像進(jìn)行數(shù)字化處理，發(fā)現(xiàn)塑料珠可以在其中心的驅(qū)動(dòng)蛋白馬達(dá)驅(qū)動(dòng)下，實(shí)現(xiàn)精度為納米尺度的旋轉(zhuǎn)[5]。在1990年，Orrit 和Bernard 首次檢測(cè)到一個(gè)并五苯分子的熒光信號(hào)[6]。此后，隨著熒光探針和超分辨率顯微鏡的發(fā)展，科學(xué)家們解決了許多復(fù)雜生物系統(tǒng)、多相催化、生物分子相互作用、酶系統(tǒng)和實(shí)時(shí)構(gòu)象變化等長(zhǎng)期存在的問題。1997 年首次將表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）技術(shù)應(yīng)用于單分子檢測(cè)，為化學(xué)分析提供了一種前所未有的高含量、超靈敏的光學(xué)方法[7]。1998 年，謝曉亮團(tuán)隊(duì)首次利用熒光顯微鏡實(shí)時(shí)觀察到單個(gè)酶蛋白分子的催化循環(huán)過程。這項(xiàng)研究成果成為單分子酶學(xué)的里程碑，成為單分子DNA 測(cè)序技術(shù)的核心技術(shù)[8]。Vgelstein 與Kinzter 于1999 年發(fā)表了采用數(shù)字PCR(digital PCR)方法定量檢測(cè)結(jié)腸癌患者糞便中的微量K-RAS 基因突變的成果[9]。2006 年，首臺(tái)數(shù)字式單分子免疫陣列蛋白分析儀Simoa HD1 面世。該檢測(cè)平臺(tái)由光纖微陣列技術(shù)和單分子檢測(cè)技術(shù)構(gòu)成，可進(jìn)行單分子酶分析。2012 年，紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室的研究人員將Pacific Biosciences 單分子測(cè)序技術(shù)與Illumina 公司的傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，用于修正單分子測(cè)序中的錯(cuò)誤，結(jié)果表明該方法顯著提高了測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性[10]。布羅德研究所張鋒團(tuán)隊(duì)于2017 年研發(fā)出一種全新的CRISPR 應(yīng)用工具（SHERLOCK 系統(tǒng)）。該CRISPR 系統(tǒng)對(duì)于RNA 和DNA 的檢測(cè)靈敏度均可達(dá)單分子級(jí)[11]。

2.1 納米孔的單分子生物檢測(cè)

在過去的幾十年里，基于納米孔的檢測(cè)方法在許多學(xué)科和領(lǐng)域起到關(guān)鍵作用，包括生物醫(yī)學(xué)、納米尺度化學(xué)、生物物理學(xué)等。納米孔單分子生物檢測(cè)傳感器由一個(gè)直徑在1～100 nm 之間的孔，嵌入到或形成于兩個(gè)含有電解質(zhì)溶液的腔室的絕緣膜中，在外加電場(chǎng)作用下，離子自由流過納米孔，形成穩(wěn)態(tài)離子電流。在檢測(cè)過程中，帶電分子（核酸、多肽、蛋白質(zhì)、聚合物分子等）阻塞納米孔，導(dǎo)致孔隙離子電流下降，分子通過納米孔后，電流會(huì)恢復(fù)正常，分子在納米孔中通過產(chǎn)生的電信號(hào)可傳達(dá)出生物分子的尺寸、濃度、結(jié)構(gòu)等信息。待測(cè)生物分子的尺寸與納米孔尺寸越接近，從孔隙通過產(chǎn)生的離子電流信號(hào)波動(dòng)越明顯[4]。納米孔單分子傳感器每次只通過一個(gè)待測(cè)分子，表現(xiàn)出對(duì)單一個(gè)體的極強(qiáng)靈敏度。此外，納米孔檢測(cè)技術(shù)具有重復(fù)性高、操作簡(jiǎn)單、成本低、有助于理解單分子行為等優(yōu)點(diǎn)。納米孔包括生物納米孔與固態(tài)納米孔兩類，都可進(jìn)行單分子層次的生物檢測(cè)。

2.1.1 生物納米孔

生物納米孔的優(yōu)點(diǎn)是具有良好的三維結(jié)構(gòu)和高復(fù)現(xiàn)性。常用的生物納米孔包括α 溶血素[12]、恥垢分枝桿菌孔蛋白A(MspA)[13]、氣溶素(AeL)[14]、Fragaceatoxinc (frac)納米孔[15]等，也可由雙層膜中的生物合成或固相合成的小肽（小于100 個(gè)氨基酸的肽）產(chǎn)生，研究人員還通過軟件設(shè)計(jì)出由DNA鏈構(gòu)成的DNA 折紙納米孔，可以控制納米孔結(jié)構(gòu)尺寸[16]。生物納米孔也稱為跨膜蛋白通道，第一個(gè)用于單生物分子檢測(cè)的納米孔是α 溶血素。其孔通道寬度只可以通過單鏈DNA，雙鏈DNA尺寸過大無法通過，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)單鏈DNA 的檢測(cè)[17]。隨著研究的深入，生物納米孔也用于癌癥生物標(biāo)志物、對(duì)映異構(gòu)體、miRNA、多肽與蛋白質(zhì)等分子的傳感。弗吉尼亞大學(xué)相關(guān)研究團(tuán)隊(duì)研發(fā)了一種基于光譜的單分子納米孔用于表征水溶性肽。這項(xiàng)技術(shù)的基礎(chǔ)原理是利用生物蛋白的納米孔分解不同大小的分子，利用Au25(SG)18團(tuán)簇來改善聚乙二醇(PEG)的檢測(cè)結(jié)果，增加多肽對(duì)孔的開啟和關(guān)閉率（如圖1所示）。同時(shí)，溶劑/溶液的pH 值對(duì)提高多肽的活性也有重要作用，在單分子檢測(cè)中表現(xiàn)出相應(yīng)的信號(hào)波動(dòng)[18]。

圖1 （a）陰離子Au25(SG)18 團(tuán)簇增強(qiáng)納米孔檢測(cè)示意圖及（b）相應(yīng)的電流強(qiáng)度[18]Fig. 1 (a) Schematic diagram of the anionic Au25(SG)18 cluster-enhanced nanopore detection and (b) it"s corresponding current traces[18]

2.1.2 固態(tài)納米孔

固態(tài)納米孔較生物納米孔表現(xiàn)出更強(qiáng)的魯棒性，制備方法可與傳統(tǒng)半導(dǎo)體制造工藝兼容，也可以與微流體及光學(xué)檢測(cè)方法集成?？刂破淇紫稁缀涡螤?，使其與生物分子相匹配。在電解質(zhì)中施加電壓，使帶電的生物分子在電泳力作用下通過納米孔，可以提高易位過程中產(chǎn)生的離子電流閾值，并最大限度地提高信噪比[19]。

在納米孔為主體的檢測(cè)系統(tǒng)中，孔徑無法通過以光傳播的方式進(jìn)行檢測(cè)的納米孔稱為零模波導(dǎo)（ZMWs）。ZMWs 通常由金屬鋁制成，置于透明襯底上，并要降低背景熒光。對(duì)于孔徑小于光波長(zhǎng)的金屬納米孔，即光波無法通過，但生物分子仍能通過的孔隙，將待測(cè)生物分子進(jìn)行熒光標(biāo)記。在一定的光照下，金屬膜上方的熒光分子層被金屬膜屏蔽，因此，只有位于孔底部的熒光團(tuán)能產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)（如圖2 所示，彩圖見期刊電子版）。零模波導(dǎo)多用于DNA 和蛋白質(zhì)生物分子的檢測(cè)以及單分子的生物物理學(xué)研究等[20]。

圖2 不同材料架構(gòu)的零模波導(dǎo)（ZMW）等離子體納米孔[20]。（a）深紫外等離子體增強(qiáng)Al ZMW 單蛋白自身熒光。（b）用于增強(qiáng)單分子探測(cè)的Au-Si 零?；旌喜▽?dǎo)。（c）等離子體納米孔器件結(jié)構(gòu)增強(qiáng)單分子熒光檢測(cè)，該結(jié)構(gòu)由金膜制備的納米孔和獨(dú)立式氮化硅膜制備的納米孔組成。Fig. 2 Various material framework of zero-mode waveguide (ZMW) plasma nanopore[20]. (a)The autofluorescence of Al ZMW monoprotein was enhanced by deep ultraviolet plasma. (b) Au-Si zero-mode hybrid waveguides for enhanced single-molecule detection. (c)The plasma nanopore device structure enhances single-molecule fluorescence detection,which consists of nanopore prepared by gold film and nanopore prepared by independent silicon nitride film.

以ZMWs 為基礎(chǔ)，目前普遍使用金代替鋁，使其產(chǎn)生強(qiáng)的等離子體共振效應(yīng)。等離子體與固態(tài)納米孔檢測(cè)技術(shù)集成，在靈敏度、特異性、陣列檢測(cè)、持續(xù)時(shí)間等方面有所提升。在等離子體納米孔周圍的電磁場(chǎng)起到增強(qiáng)光學(xué)光譜、提高熒光標(biāo)記分析物信號(hào)、實(shí)現(xiàn)分子和離子在傳感器之間熱遷移的作用。高限制的等離子體場(chǎng)可用于增強(qiáng)標(biāo)記了適當(dāng)熒光染料的生物分子的熒光能量（FE）和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）[21]。利用等離子體納米孔技術(shù)對(duì)電磁場(chǎng)進(jìn)行限制，可以對(duì)背景熒光產(chǎn)生很強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)將FE 凈增強(qiáng)10 倍以上。

2.1.3 相關(guān)應(yīng)用

2.1.3.1 核酸檢測(cè)

納米孔核酸檢測(cè)讀取長(zhǎng)度不受限制，小型化納米孔核酸檢測(cè)儀器可用于實(shí)時(shí)檢測(cè)。通過單分子檢測(cè)，直接進(jìn)行核酸讀取，不需要進(jìn)行擴(kuò)增的方法被稱為第三代測(cè)序。納米孔核酸檢測(cè)利用DNA穿過孔時(shí)，產(chǎn)生的電荷變化來識(shí)別不同的核酸[22-23]。對(duì)于臨床樣本，一般利用雜交原理構(gòu)建的生物傳感器的靈敏度和選擇性存在缺陷，由于血清中存在其他各種蛋白和非靶核酸，可導(dǎo)致離子電流阻滯干擾靶信號(hào)等問題[24]。納米孔核酸檢測(cè)的難點(diǎn)之一是控制DNA 鏈通過納米孔的易位速度，時(shí)間過短會(huì)導(dǎo)致采集到的電流特征信號(hào)無法被記錄或記錄錯(cuò)誤。研究人員發(fā)現(xiàn)對(duì)于生物納米孔可以在待測(cè)DNA 分子入口處使用分子馬達(dá)，如DNA聚合酶或解旋酶，可以顯著降低DNA 的移動(dòng)速度，并在核酸水平上精確控制DNA 移動(dòng)[25]。DNA鏈中相鄰核酸之間的長(zhǎng)度只有0.5 nm，膜的厚度了決定測(cè)序的分辨率，更薄的厚度可使識(shí)別更加準(zhǔn)確，隨著石墨烯材料的出現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)其厚度與核酸之間間距相當(dāng)，具有很高的空間分辨率，并且具有高機(jī)動(dòng)和柵可調(diào)載流子的電子導(dǎo)電性，可應(yīng)用于納米孔單分子檢測(cè)[26]。氮化硅作為一種可靠的半導(dǎo)體相關(guān)材料，使用氮化硅薄膜制造納米孔更適合大規(guī)模生產(chǎn)，目前發(fā)現(xiàn)的最短有效厚度約為1.7～1.8 nm，大約可容納4 個(gè)連續(xù)的核酸[27]。Burck等人最近提出了一種基于納米孔的生化分析方法。其利用納米孔中的光電傳感技術(shù)對(duì)小的外周血循環(huán)中的游離DNA 片段進(jìn)行定量分析，證明小鼠血液中特異性檢測(cè)ERBB2 S310F 和PIK3CA H1047R 的基因突變[28]。

2.1.3.2 蛋白質(zhì)與多肽檢測(cè)

蛋白質(zhì)與多肽都是由氨基酸組成的。與DNA測(cè)序不同的是，納米孔技術(shù)無法對(duì)蛋白質(zhì)或多肽的每個(gè)氨基酸進(jìn)行測(cè)序，所以研究人員把精力集中在區(qū)分單一氨基酸上。單氨基酸檢測(cè)靈敏度與分子通過納米孔的易位速度相關(guān)，Yuan 等人使用未修飾的氣溶膠納米孔與待測(cè)氨基酸之間的氫鍵成功檢測(cè)出單個(gè)半胱氨酸[29]。為了檢測(cè)單氨基酸分辨率下的多肽，研究人員將不同分子量的多肽用不同阻滯信號(hào)幅度加以區(qū)分，Piguet等人在單氨基酸分辨率下對(duì)混合溶液或獨(dú)立的均荷電短同肽(5～10 個(gè)氨基酸)進(jìn)行了大小區(qū)分。在這項(xiàng)研究中，氣溶膠納米孔是完全未經(jīng)修飾的，可以正確區(qū)分不同長(zhǎng)度的多肽[30]。2019年，Matteo Dal Peraro 課題組以納米孔單分子檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)，對(duì)氣溶素的離子選擇能力與傳感能力展開研究。因?yàn)闅馊芩嘏c其他生物納米孔的區(qū)別主要在于其孔徑長(zhǎng)度，研究發(fā)現(xiàn)其能力主要由靜電和雙β-桶的最狹小部分直徑控制，較長(zhǎng)的孔與直徑較小的孔徑相結(jié)合可使分子的易位變慢，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽分子更高精度的檢測(cè)[31]。2021 年，荷蘭格羅寧根大學(xué)的Giovanni Maglia 教授通過低pH 條件以及在孔道內(nèi)引入芳香族氨基酸突變的方法，提高了多肽在納米孔中的停留時(shí)間、捕獲頻率和分辨率，同時(shí)對(duì)納米孔的多肽傳感機(jī)制做出一定驗(yàn)證，為納米孔的多肽檢測(cè)提供了一種切實(shí)可行的方法[32]。同年，為了促進(jìn)蛋白質(zhì)納米孔的實(shí)際應(yīng)用，LI M Y 團(tuán)隊(duì)通過納米孔實(shí)驗(yàn)與分子動(dòng)力學(xué)模擬，實(shí)現(xiàn)了高度特異的離子電流強(qiáng)度對(duì)待測(cè)物體積差分辨（如圖3 所示，彩圖見期刊電子版）[33]。

圖3 通過野生型氣溶膠膜通道運(yùn)輸C-A3 和mC-A3[33]。（a）氣溶膠納米孔模型。氣溶素（灰色）嵌入脂質(zhì)雙層膜（深藍(lán)色），核苷酸（紅色）放置在孔的入口；（b）含有甲基胞嘧啶和胞嘧啶的甲基化和非甲基化寡核苷酸結(jié)構(gòu)。紅色部分為添加的甲基部分Fig. 3 Transporting C-A3 and mC-A3 through a wild-type aerolysin membrane channel[33]. (a) All-atom model of the fulllength aerolysin nanopore system. Aerolysin (gray) was inserted into a lipid bilayer membrane (dark blue), while nucleotides (red) were placed at the entrance of the pore. (b) Structure of methylated and unmethylated oligonucleotides containing methylcytosine and cytosine, respectively. The only difference between them was the addition of a methyl group which is marked in red

2.2 數(shù)字式單分子生物檢測(cè)

數(shù)字式單分子生物檢測(cè)通過將待測(cè)分子以統(tǒng)計(jì)學(xué)原理分離出“有”與“無”兩種狀態(tài)，對(duì)“有”的分子進(jìn)行計(jì)數(shù)，獲得待測(cè)分子數(shù)量。與批量檢測(cè)方法相比，數(shù)字式單分子生物檢測(cè)系統(tǒng)在對(duì)蛋白質(zhì)和核酸的測(cè)量上具有明顯優(yōu)勢(shì)。在批量測(cè)量中，待測(cè)物的濃度與信號(hào)強(qiáng)度成比例，樣本總體的特異性被忽略，只能測(cè)量平均活性。與整體檢測(cè)相比，數(shù)字式檢測(cè)與信號(hào)強(qiáng)度無關(guān)，讀取單個(gè)信號(hào)的有無并進(jìn)行計(jì)數(shù)[34]。數(shù)字式單分子生物檢測(cè)將單個(gè)帶有熒光底物的酶分子加載到飛升體積大小的微孔中，在微孔中每個(gè)酶分子都能催化大量底物使其轉(zhuǎn)化為熒光分子，產(chǎn)生較高的局部濃度，觀測(cè)含有熒光信號(hào)的微孔，計(jì)算酶分子的數(shù)量。以微磁珠為載體將待測(cè)生物分子與熒光底物捕獲到單個(gè)飛升體積大小的微孔或微反應(yīng)器中，對(duì)微孔陣列中每個(gè)孔中的熒光信號(hào)同時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，通過增加微磁珠被捕獲的概率檢測(cè)濃度極低的待測(cè)分子（如圖4 所示，彩圖見期刊電子版）[35]。

圖4 微磁珠加載示意圖[35]。（a）使用磁力和親-疏水微孔陣列高效加載微磁珠。（b）直徑、間距和深度不同的微孔陣列在多次循環(huán)下的加載率。（c、d）40 倍顯微鏡下加載前后的亮場(chǎng)顯微圖像。（e）100 倍顯微鏡下加載后的亮場(chǎng)顯微圖像Fig. 4 Magnetic bead seeding[35]. (a) Schematic of the magnetic bead seeding on HIH microwell arrays. (b) The bead distribution in arrays with varying well diameters, array pitches and well depths, for multiple-seeding cycles. (c,d) ×40 magnification bright field microscopy image of a microwell array before and after magnetic bead seeding, respectively. (e)×100 magnification bright field microscopy image of a microwell array after seeding

Rissin 課題組提出以微珠為載體的ELISA 單分子陣列檢測(cè)方法，使檢測(cè)過程更加穩(wěn)定，可實(shí)現(xiàn)單個(gè)蛋白質(zhì)分子的檢測(cè)[36]。首先使用單個(gè)蛋白分子被結(jié)合抗體的微珠捕獲，攜帶蛋白分子的微珠遵循泊松分布的百分比，即每個(gè)珠粒結(jié)合一個(gè)或零個(gè)目標(biāo)分子，與加入生物素化的檢測(cè)抗體形成三明治式免疫復(fù)合物，然后用鏈霉親和素結(jié)合的β-半乳糖苷酶進(jìn)行標(biāo)記，將微珠與熒光底物共同加入到與微孔尺寸相匹配的微孔陣列中，即每個(gè)微孔最多存在一顆微珠（如圖5 所示）[37]。通過這種方法，可以使捕獲的單個(gè)蛋白分子被分離在獨(dú)立的孔中。微孔封閉后，通過觀察微孔上的熒光數(shù)量計(jì)算單目標(biāo)分子。每個(gè)單獨(dú)的微反應(yīng)器在這個(gè)過程中起到分散待測(cè)分子，數(shù)字化檢測(cè)目標(biāo)的作用。蛋白質(zhì)濃度是通過測(cè)量同時(shí)含有珠粒和熒光產(chǎn)物的孔數(shù)與含有珠粒的孔總數(shù)的比率來確定的。該方法大大降低了檢測(cè)抗體和酶的使用量，也減少了與微珠的非特異性結(jié)合，降低了背景噪聲。因此，數(shù)字式單分子生物檢測(cè)方法的檢測(cè)限比傳統(tǒng)ELISA 低1 000 倍。

圖5 數(shù)字ELISA 示意圖[37]。（a）抗體結(jié)合微珠捕獲單個(gè)目標(biāo)生物分子，然后由另一個(gè)與標(biāo)記抗體結(jié)合的抗體檢測(cè)。將微珠裝入飛升微孔陣列中用于分離和檢測(cè)單個(gè)分子。（b）產(chǎn)生單分子信號(hào)的飛升微孔陣列的一部分熒光圖像。大多數(shù)飛升體積微孔含有一顆微珠，但這些珠中只有一小部分具有催化酶活性，表明是一種單一的結(jié)合蛋白。（c）蛋白質(zhì)在本體溶液中的濃度與結(jié)合蛋白質(zhì)分子的微珠的百分比關(guān)系Fig. 5 Schematic representation of digital ELISA[37]. (a) Antibody-coated beads captures the single target biomolecules, which are then detected by another antibody conjugated with a labeled antibody. Loading of beads into femtoliter well arrays for isolation and detection of single molecules. (b) Fluorescence image of a small section of the femtoliter well array after signals from single molecules are generated.While the majority of femtoliter chambers contain a bead from the assay, only a fraction of those beads possesses catalytic enzyme activity, indicative of a single, bound protein. (c) The concentration of protein in the bulk solution is correlated to the percentage of beads that have bound a protein molecule

數(shù)字式單分子檢測(cè)方法提高了研究人員對(duì)酶機(jī)制和酶群體的異質(zhì)性理解，將單酶分子捕獲到具有熒光底物的微孔中，在高通量的微孔陣列中同時(shí)觀測(cè)大量酶分子的活性，能夠獲得酶群長(zhǎng)期的動(dòng)力學(xué)狀態(tài)。數(shù)字式單分子檢測(cè)方法也可以直接以外周血為檢測(cè)對(duì)象，通過提取其生物標(biāo)志物定量分析自身循環(huán)系統(tǒng)血漿中的細(xì)胞因子含量，與痊愈患者進(jìn)行比較，觀察產(chǎn)生的生理變化，用于評(píng)估免疫療法的效果[38]。

2.2.1 核酸檢測(cè)

目前大多數(shù)的核酸檢測(cè)需要對(duì)目標(biāo)DNA 或RNA 進(jìn)行擴(kuò)增，通常使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。在定量PCR (qPCR)中，每個(gè)擴(kuò)增周期后通過熒光增強(qiáng)程度判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)豐度。這種方法可以在短時(shí)間內(nèi)將目標(biāo)序列擴(kuò)增100 萬(wàn)次以上，所需樣本量小[39]。除此之外，包括滾動(dòng)環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(RCA)、雜交化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)等技術(shù)也可用于核酸檢測(cè)，但是這些方法往往耗時(shí)費(fèi)力、需要消耗大量樣本、并且靈敏度不足。

為了解決這些問題并獲得更高的靈敏度，數(shù)字PCR 方法對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，并將其劃分到含有一個(gè)或零個(gè)目標(biāo)模板分子的孔中，從而允許對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行排除擴(kuò)增偏差的絕對(duì)定量[40]，由此發(fā)展出的液滴數(shù)字PCR (ddPCR)方法利用油包水乳化液滴限制單個(gè)核酸靶點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模數(shù)字化檢測(cè)。此外，數(shù)字式ELISA 的檢測(cè)方法能夠在不需要進(jìn)行DNA 擴(kuò)增的條件下，檢測(cè)亞飛摩濃度的基因組DNA[41]。該方法成功檢測(cè)到全血中濃度為0.016 fmol/L 的金黃色葡萄球菌的基因組DNA。數(shù)字式ELISA 方法對(duì)miRNA的檢測(cè)也具有極高的靈敏度，通過與目標(biāo)miRNA序列互補(bǔ)的鎖定核酸探針的直接雜交，檢測(cè)限可達(dá)到1～10 fmol/L，能夠通過多重檢測(cè)飛摩濃度的具有單核苷酸錯(cuò)配的同源miRNA[42]。除了高靈敏度之外，該方法還解決了逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（miRNA 檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)方法）所面臨的樣品丟失和擴(kuò)增變異的問題（如圖6所示，彩圖見期刊電子版）[43]。

圖6 數(shù)字式單分子陣列檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行MicroRNA 檢測(cè)[43]。（a）單個(gè)miRNA 分子通過與生物素化的探測(cè)器探針雜交到探針化的順磁珠中被捕獲。隨后加入鏈霉親和素結(jié)合酶來標(biāo)記捕獲的miRNA 復(fù)合物，以便在與熒光酶底物孵育時(shí)產(chǎn)生熒光信號(hào)。（b）單個(gè)微珠與熒光襯底一起裝入飛升微孔陣列，隨后用油密封。然后將孔上熒光的數(shù)量作為目標(biāo)miRNA濃度的數(shù)字讀數(shù)Fig. 6 MicroRNA detection with digital single molecule detection technology[43]. (a) Individual miRNA molecules are captured by hybridization to probecoated paramagnetic beads, along with biotinylated detector probe. The streptavidin-conjugated enzyme is subsequently added to label the captured miRNA complex, to allow generation of a fluorescent signal upon incubation with a fluorogenic enzyme substrate. (b) Individual beads are loaded along with fluorogenic substrate into a femtoliter microwell array, which is subsequently sealed with oil. The number of fluorescent “on” wells is then counted as a digital readout of the target miRNA concentration

2.2.2 蛋白質(zhì)檢測(cè)

數(shù)字式單分子檢測(cè)技術(shù)最大應(yīng)用領(lǐng)域之一是對(duì)神經(jīng)病學(xué)和神經(jīng)退行性疾病的診斷。常見的檢測(cè)對(duì)象包括神經(jīng)絲光(NfL)、Tau 蛋白、淀粉樣蛋白(Aβ)、α-突觸蛋白 (a-synuclein)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)。這些蛋白在血漿中的濃度低于在腦脊液（CSF）中的濃度，血漿檢測(cè)比腦脊液檢測(cè)對(duì)人體的傷害小很多，因此需要一種靈敏度極高的技術(shù)，獲得對(duì)血漿中低濃度蛋白質(zhì)的技術(shù)量化檢測(cè)指標(biāo)，如數(shù)字式ELISA 單分子檢測(cè)技術(shù)。Mattsson 團(tuán)隊(duì)證實(shí)患老年癡呆癥患者神經(jīng)絲光NfL 血漿水平（平均51.0 ng/L）顯著高于認(rèn)知健康的對(duì)照組的檢測(cè)物水平（平均34.7 ng/L），而輕度認(rèn)知障礙患者（平均42.8 ng/L）與其他兩組之間無顯著差異[44]。其他研究人員也通過對(duì)血漿中NfL量化，確認(rèn)額顳葉癡呆癥與其相關(guān)，且血漿中的NfL 濃度與腦脊液中濃度呈正相關(guān)。Gill 課題組使用單分子陣列技術(shù)對(duì)疑似輕度創(chuàng)傷性腦損傷(mTBI)患者與健康對(duì)照組的tau、NfL 和GFAP進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果表明患者血漿中檢測(cè)蛋白含量明顯偏高[45-46]。魯汶大學(xué)生物傳感器研究人員使用同一檢測(cè)方法對(duì)阿摩到皮摩的Tau 蛋白水平進(jìn)行量化，證明了所提出的檢測(cè)方法與不同生物樣品中Tau 濃度范圍具有兼容性，獲得55±29 aM 的檢測(cè)限，靈敏度較商用產(chǎn)品提高了5 000 倍[47]。在另一項(xiàng)研究中，Dinh 等研究人員使用數(shù)字式ELISA 方法測(cè)量血清與尿液中肉毒桿菌神經(jīng)毒素A1(BoNT/A1)量化值，檢測(cè)限分別達(dá)到200 pg/L和1 ng/L[48]。

除神經(jīng)學(xué)標(biāo)志物外，單分子陣列技術(shù)也越來越多地應(yīng)用于檢測(cè)血液中的腫瘤標(biāo)志物、心臟驗(yàn)證標(biāo)志物、自身免疫性疾病中的細(xì)胞因子與趨化因子等。

2.2.3 小分子的單分子檢測(cè)

為了檢測(cè)單個(gè)小分子，Wang 課題組將單分子陣列檢測(cè)調(diào)整為一種競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析形式，分析修飾的微珠或分析標(biāo)記的酶與樣品中的目標(biāo)分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)免疫分析法成功用于檢測(cè)唾液和血清中的皮質(zhì)醇和前列腺素E2。結(jié)果表明競(jìng)爭(zhēng)免疫分析法對(duì)小分子的靈敏度較傳統(tǒng)競(jìng)爭(zhēng)ELISA 法高出約50 倍[49]。

通過將單個(gè)分子限制在飛升級(jí)微反應(yīng)器陣列中，基于微孔的檢測(cè)技術(shù)為檢測(cè)單個(gè)目標(biāo)分子提供了一種強(qiáng)大的工具，提高了靈敏度。隨著靈敏度、小型化和成本效益的不斷提高，這種單分子生物檢測(cè)技術(shù)在推進(jìn)臨床診斷和理解疾病機(jī)制方面表現(xiàn)出重要的潛力。

2.3 回音壁模式光學(xué)諧振腔（WGM）單分子生物檢測(cè)

回音壁模式光學(xué)諧振腔（WGM）作為無標(biāo)的微納米傳感器，可以讓人們直接在光下觀察單分子水平的動(dòng)態(tài)過程，具有高時(shí)間和空間分辨率，并且能夠響應(yīng)影響光模式分布的環(huán)境擾動(dòng)。WGM器件具有高靈敏度，此外，其結(jié)構(gòu)具有多樣性且易于與現(xiàn)有制造設(shè)備(如傳統(tǒng)的基于芯片的技術(shù))集成，促使WGM 傳感器廣泛用于生物分子檢測(cè)。典型的WGM 傳感器由一個(gè)低噪聲泵浦光源和一個(gè)高Q 值微腔組成。通過光的全反射將光波限制在諧振腔內(nèi)，循環(huán)的光波會(huì)產(chǎn)生自干涉光學(xué)共振，光波倏逝場(chǎng)從微腔激發(fā)延伸到周圍的介質(zhì)中，當(dāng)生物分子與納米級(jí)光場(chǎng)重疊時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)（WGM 共振漂移）。理論上，生物分子與光相互作用，光波每循環(huán)一圈，路徑長(zhǎng)度都會(huì)發(fā)生一些變化，這種路徑長(zhǎng)度的變化使光的共振波長(zhǎng)或頻率發(fā)生偏移[50]。利用諧振腔表面散射損失和吸收損失導(dǎo)致光學(xué)共振頻率信號(hào)變化，可實(shí)現(xiàn)生物分子的高靈敏檢測(cè)（如圖7 所示，彩圖見期刊電子版）[51]。為了將WGM 的檢測(cè)能力提升到單分子級(jí)別，可以通過增強(qiáng)光與金屬納米結(jié)構(gòu)上分子的相互作用而實(shí)現(xiàn)，使用金屬納米結(jié)構(gòu)將光集中在超出衍射極限的深亞波長(zhǎng)尺度，以增強(qiáng)與單一分子的相互作用。然而，用這種方法獲得的單分子高分辨率，導(dǎo)致傳感部分縮小，有效傳感面積為納米粒子的結(jié)合部分的表面積，在與NPs 結(jié)合時(shí)，只有少量分子可以被識(shí)別[52]。另一種基于光學(xué)WGM 與微腔的機(jī)械本征模耦合的傳感方法，不受這種傳感體積減小的影響，其用足夠的功率激發(fā)空腔內(nèi)的光波導(dǎo)，其共振頻率相對(duì)于諧振頻率略有藍(lán)移，則可以在亞Hz 線寬的頻率Vm上引起諧振腔的相干光機(jī)械振蕩(OMO)，振蕩頻率和它的高次諧波可以直接由腔發(fā)射的功率譜確定。由于腔內(nèi)光場(chǎng)本身就像光彈簧一樣做機(jī)械運(yùn)動(dòng)，OMO 的頻率取決于激發(fā)頻率相對(duì)于WGM共振位置的失諧[53]。為了檢測(cè)特定的生物分子，需要使用分析特異性捕獲劑（抗體[54]、抗體片段[55]、互補(bǔ)核酸適體[56]、其他識(shí)別分子）對(duì)WGM進(jìn)行修飾，在捕獲劑將待測(cè)分子捕獲到傳感區(qū)域中時(shí)，會(huì)導(dǎo)致共振波長(zhǎng)偏移，由于這一現(xiàn)象，WGM 已被用于核酸、病毒、蛋白質(zhì)、端粒酶活性等目標(biāo)的檢測(cè)。研究人員基于該原理成功檢測(cè)到大腸桿菌聚合酶打開和關(guān)閉時(shí)信號(hào)的變化。通過改變檢測(cè)波長(zhǎng)，也可以在蛋白質(zhì)不同體積的位置探測(cè)單蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)，這種多模態(tài)WGM 傳感器甚至可以使蛋白質(zhì)的三維動(dòng)力學(xué)達(dá)到原子級(jí)分辨率，成為單分子動(dòng)力學(xué)研究的重要工具。

圖7 由諧振腔表面的全內(nèi)反射激發(fā)的WGM[51]Fig. 7 Illustration of a WGM cavity excited by frustrated total internal reflection at a prism surface[51]

2.3.1 單分子檢測(cè)應(yīng)用

WGM 的檢測(cè)方法為無標(biāo)檢測(cè)，其對(duì)分子的類型往往無法識(shí)別，通常使用與待測(cè)分子尺寸匹配的微粒子代替。病毒一直對(duì)人類構(gòu)成潛在威脅，早在2008 年，Vollmer F 課題組首次報(bào)道了使用模式偏移技術(shù)檢測(cè)單個(gè)甲型流感病毒粒子(半徑約50 nm)，從微球形WGM 的共振頻率/波長(zhǎng)的離散變化觀察到單個(gè)病毒粒子的結(jié)合，通過減小微球的尺寸，可以增強(qiáng)離散波移信號(hào)的幅度。在使用與病毒大小相當(dāng)?shù)木郾揭蚁┘{米顆粒的實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)傳感機(jī)制與模式體積成反比。將此效應(yīng)的基礎(chǔ)電磁理論與實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較，既可以從最佳共振位移直接獲得結(jié)合病毒粒子的大小和質(zhì)量[57]。美國(guó)伊利諾伊大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用無標(biāo)的硅光子微環(huán)諧振器直接在一個(gè)復(fù)雜的分析矩陣檢測(cè)完整病毒的純化樣品，并且對(duì)菜豆莢斑駁病毒(一種重要的農(nóng)業(yè)病原體)實(shí)現(xiàn)了定量檢測(cè)，檢測(cè)限為10 ng/mL。通過在緩沖液中研磨少量葉片樣本，于45 min 內(nèi)，就可以識(shí)別受感染的葉片[58]?？諝庵幸泊嬖诤芏辔⑿〉牟《痉肿樱琒hao L 團(tuán)隊(duì)研究人員基于自由空間耦合的微環(huán)面成功檢測(cè)出了單個(gè)聚苯乙烯顆粒(半徑為70 nm)以及空氣中的病毒粒子[59]。蛋白質(zhì)的尺寸通常小于病毒的尺寸，在對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，就需要更高的靈敏度WGM 檢測(cè)裝置，才能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)。許多研究小組已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了在純緩沖溶液和復(fù)雜介質(zhì)中對(duì)蛋白質(zhì)的直接檢測(cè)[60-61]。Robison H M 課題組利用循環(huán)免疫細(xì)胞中結(jié)核相關(guān)抗原和對(duì)照抗原暴露進(jìn)行多重細(xì)胞因子免疫分析，驗(yàn)證了適用于結(jié)核桿菌(LTBI)的7-plex 細(xì)胞因子檢測(cè)。該方法具有良好的動(dòng)態(tài)范圍、檢測(cè)限和重現(xiàn)性，與單酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法具有良好的相關(guān)性，準(zhǔn)確地檢測(cè)和量化了患者的PBMCs 在結(jié)核相關(guān)抗原和對(duì)照抗原刺激后分泌的7 種細(xì)胞因子濃度，并與強(qiáng)大的特征選擇方法相結(jié)合，揭示了與LTBI 狀態(tài)和再激活風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的個(gè)體規(guī)范化免疫信號(hào)[62]。近期，肖云峰教授和龔旗煌院士課題組首先成功制備出壁厚約為1 μm 的微泡腔，并利用熱光效應(yīng)進(jìn)行篩選，進(jìn)一步將微泡腔接入微流系統(tǒng)構(gòu)成微流光學(xué)傳感器，并成功實(shí)現(xiàn)了單鏈DNA 分子的檢測(cè)[63]。

2.3.2 蛋白質(zhì)分子構(gòu)象動(dòng)力學(xué)檢測(cè)

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)的動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)是極其復(fù)雜的，涉及到與結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)和波動(dòng)相關(guān)的不同時(shí)間尺度、運(yùn)動(dòng)幅度和不同方向。大多數(shù)蛋白質(zhì)的功能來自于復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)的改變，通常在與其他分子的相互作用，或環(huán)境條件如溫度和PH 值的變化時(shí)發(fā)出響應(yīng)，蛋白質(zhì)可以在很短的時(shí)間間隔內(nèi)采用許多不同的構(gòu)象，因此檢測(cè)蛋白質(zhì)的構(gòu)象動(dòng)態(tài)對(duì)于更好地理解其生物學(xué)功能至關(guān)重要。為了觀察蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)，常常需要對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行研究。研究單個(gè)蛋白構(gòu)象變化的一種方法是將光集中在深亞波長(zhǎng)尺度上，以增強(qiáng)與單一蛋白質(zhì)的相互作用。通過附加一個(gè)等離子體金屬納米棒，可以將光集中到一個(gè)蛋白質(zhì)的尺寸(約10 nm)，生物分子與這種光場(chǎng)相互作用可產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)[64]。通過這種方法，已經(jīng)有科研人員實(shí)現(xiàn)對(duì)固定在WGM 傳感器上的活性聚合酶的構(gòu)象運(yùn)動(dòng)的檢測(cè)。利用這種無標(biāo)的光學(xué)檢測(cè)方法觀測(cè)出單分子水平上的相互作用和相關(guān)的構(gòu)象變化[65]。為了實(shí)現(xiàn)具有多個(gè)傳感通道的WGM 傳感器平臺(tái)，研究人員利用不同的激光探測(cè)蛋白質(zhì)分子動(dòng)力學(xué)，從而獲得蛋白質(zhì)不同部分的動(dòng)力學(xué)信息。通過使用等離子體金納米顆粒耦合WGMs，以微秒時(shí)間分辨率探測(cè)周轉(zhuǎn)期間的酶構(gòu)象動(dòng)力學(xué)，對(duì)單分子水平上酶周轉(zhuǎn)的溫度依賴進(jìn)行研究，并對(duì)其建立物理模型，成為研究酶周轉(zhuǎn)和熱力學(xué)之間關(guān)系的重要工具[66]。

2.4 表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）單分子生物檢測(cè)

拉曼光譜是一種功能強(qiáng)大的分析工具，可以探測(cè)分子的震動(dòng)指紋信號(hào)，根據(jù)拉曼光譜固有的特異性，可以對(duì)物理、化學(xué)和生物的復(fù)合系統(tǒng)進(jìn)行分析。這種光學(xué)技術(shù)具有低損害性和用途廣泛等特點(diǎn)，可用于固體、液體和氣體樣品的研究，已被應(yīng)用于化學(xué)檢測(cè)、疾病診斷和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。然而，自發(fā)拉曼散射很弱，拉曼光譜的靈敏度較低。表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)能夠顯著增強(qiáng)表面吸附分子的拉曼信號(hào)，克服傳統(tǒng)拉曼光譜靈敏度低的限制。經(jīng)過技術(shù)的不斷完善，SERS 技術(shù)在生物傳感領(lǐng)域表現(xiàn)出優(yōu)異的靈敏度。通常利用互補(bǔ)核酸、抗體和適配體作為識(shí)別病毒的識(shí)別元件[67]。在SERS 發(fā)展的早期階段，使用表面粗糙的金屬襯底，能夠?yàn)楸粰z測(cè)分子提供良好的拉曼增強(qiáng)[68-69]。但是，由于粗糙的金屬基底對(duì)場(chǎng)的增強(qiáng)能力有限，不足以滿足單分子檢測(cè)。隨后，研究證明大幅的電磁增強(qiáng)，可以使測(cè)量非共振分子拉曼微分截面的SERS 信號(hào)在10-29～ 10-30cm2/sr范圍內(nèi)[70]。SERS 襯底(如非晶態(tài)Au 襯底)表面原子遷移會(huì)使測(cè)量到的單分子信號(hào)受到影響[71]。在SERS 理論中，電磁場(chǎng)方法激活的拉曼增強(qiáng)因子與局域電場(chǎng)增強(qiáng)的四次方成正比，表示為：

其中E0(r0,ω)是 入射光的電場(chǎng)，E(r0,ω)為熱點(diǎn)處的局部電場(chǎng)。相應(yīng)的增強(qiáng)拉曼強(qiáng)度可表示為：

其中A表示實(shí)際中與用于采集拉曼信號(hào)的光學(xué)系統(tǒng)的采集效率相關(guān)的系數(shù)；| α(ωR,ω)|表示被檢測(cè)分子的拉曼極化率；I0(r0,∞)表示入射光強(qiáng)度[72]。根據(jù)公式（2）可知，使用特定的光學(xué)系統(tǒng)來提高SERS 測(cè)量的靈敏度，主要有兩種增強(qiáng)方法。一個(gè)是局域電場(chǎng)增強(qiáng)，對(duì)應(yīng)于EM，另一個(gè)是增加被檢測(cè)分子的拉曼極化率，對(duì)應(yīng)于CM。

SERS 單分子生物檢測(cè)可以在不統(tǒng)計(jì)平均值的情況下觀察單分子中細(xì)微的光譜現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，SERS 單分子檢測(cè)可以準(zhǔn)確觀察到拉曼峰的均勻展寬和非均勻展寬。在應(yīng)用方面，SERS 單分子生物檢測(cè)顯著增加了拉曼光譜的可應(yīng)用區(qū)域[73]。利用單分子SERS 技術(shù)，在單分子水平上實(shí)現(xiàn)了對(duì)還原氧化反應(yīng)和催化反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，可用于指導(dǎo)具有最高催化活性的多相生物催化劑的設(shè)計(jì)[74]。

2.4.1 病毒檢測(cè)

病毒感染是導(dǎo)致人類發(fā)病和死亡的主要原因之一，給衛(wèi)生保健系統(tǒng)造成了重大經(jīng)濟(jì)成本。SERS 技術(shù)是一種非?？煽康某Ｒ?guī)病毒感染快速識(shí)別技術(shù)。譜分析統(tǒng)計(jì)方法的發(fā)展使得人們能夠?qū)ν徊《静煌局甑腟ERS 光譜加以區(qū)分。例如，銀納米棒陣列用于SERS 技術(shù)可檢測(cè)幾種致病性病毒，如腺病毒、鼻病毒和人類免疫缺陷病毒等[75]。此外，還可以區(qū)分不同毒株的甲型流感病毒[76]、呼吸道合胞病毒[61]和輪狀病毒[77]。Oganes Ambartsumyan 課題組于2021 年，以多層金底物制備新型SERS，成功識(shí)別出濃度為106pfu/ml的腺病毒和柯薩奇病毒(其中pfu 是斑塊形成單位，即感染病毒顆粒的數(shù)量)[61]。相關(guān)研究團(tuán)隊(duì)還使用SERS 檢測(cè)方法磁捕獲病毒基因組，使用鍍金的順磁納米粒子(NPs)，其既可用作SERS 底物，也可作為從其他成分靶向純化病毒基因組的高效方法[78]。而Saira Nasir 課題組通過SERS 方法，采用多元數(shù)據(jù)分析技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)血液樣本中丙型肝炎病毒(HCV)的定性與定量分析，準(zhǔn)確率達(dá)99%[75]。采用夾心法對(duì)流感病毒進(jìn)行全病毒捕獲和血凝素適配體鑒定。初級(jí)適配體附著在SERS底物的金屬顆粒上，捕獲流感病毒并與具有拉曼活性分子標(biāo)記的二級(jí)適配體結(jié)合。捕獲流感病毒顆粒后，加入拉曼染料標(biāo)記的二級(jí)適配體（如圖8 所示，彩圖見期刊電子版），使用拉曼染料在生物液中幾分鐘完成檢測(cè)，并成功檢測(cè)到多種A 型流感病毒株[79]。

圖8 核酸適體的病毒顆粒在固體基質(zhì)上的檢測(cè)[79]Fig. 8 Detection of virus particles of aptamer on solid substrates[79]

2.4.2 蛋白質(zhì)檢測(cè)

SERS 可以檢測(cè)蛋白質(zhì)的內(nèi)在信號(hào)，因此可以作為一種有效的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。PENG Y S課題組于2021 年利用Nb2C 和Ta2C MXenes 在電荷轉(zhuǎn)移共振增強(qiáng)和電磁增強(qiáng)的協(xié)同作用下，顯著增強(qiáng)SERS，準(zhǔn)確識(shí)別5×10-9M 的SARS-CoV-2刺突蛋白，有利于實(shí)現(xiàn)新型冠狀病毒的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和預(yù)警[80]。隨后，2022 年DELPHINE 課題組也對(duì)世界范圍內(nèi)快速傳播的新冠病毒進(jìn)行SERS 檢測(cè)，通過對(duì)人體的SARS-CoV-2 刺突蛋白單鏈抗體文庫(kù)進(jìn)行生物篩選，獲得了結(jié)合SARS-CoV-2刺突蛋白的單鏈抗體片段。將單鏈抗體與磁性納米顆粒和SERS 納米標(biāo)記相結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，在病毒載體中檢測(cè)SARS-CoV-2 刺突蛋白，30 min 內(nèi)檢測(cè)限為257 fg/mL。同時(shí)檢測(cè)到B.1.1.7 (alpha)、B.1.351 (beta)和B.1.617.2 (delta)刺突蛋白，與冠狀病毒HKU1 刺突蛋白無交叉反應(yīng)[81]。LIU B 課題組基于金銀核殼結(jié)構(gòu)的SERS 納米標(biāo)記和多氯聯(lián)苯(PCBS)相結(jié)合的生物傳感器，實(shí)現(xiàn)具有寬線性動(dòng)態(tài)范圍的蛋白質(zhì)超靈敏檢測(cè)。結(jié)果表明，該生物傳感器對(duì)小鼠免疫球蛋白G（IgG）具有良好的檢測(cè)限672 fg/mL，線性動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍為10 pg/mL～10 μg/mL[82]。然而，由于SERS 信號(hào)的復(fù)雜性和不可靠性，需要對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化?？蒲腥藛T在SERS 的基礎(chǔ)上研發(fā)直接免疫分析(SERSIA)技術(shù)離心，將金納米顆粒(GNPs)均勻地包裹在目標(biāo)蛋白上，與靶蛋白密切接觸，可以檢測(cè)到靶蛋白的內(nèi)在信號(hào)，能夠在微米范圍內(nèi)對(duì)固定化蛋白進(jìn)行定量成像[83]。

2.4.3 生物標(biāo)志物檢測(cè)

SERS 被認(rèn)為是一種非常有前途的超靈敏技術(shù)，甚至可以檢測(cè)單個(gè)分子，長(zhǎng)期以來一直被認(rèn)為是一種強(qiáng)大的微量生物標(biāo)志物分析工具。同步的癌癥生物標(biāo)志物檢測(cè)為癌癥的早期診斷帶來了巨大希望。在相關(guān)檢測(cè)初期，SERS 單分子生物檢測(cè)可用于同時(shí)檢測(cè)多種肝癌相關(guān)的microRNA(miRNA)生物標(biāo)志物，通過合成3 種高度均勻、可重復(fù)的納米標(biāo)記，產(chǎn)生強(qiáng)烈的SERS 信號(hào)，其具有特征的拉曼光譜。上述結(jié)果表明SERS 納米標(biāo)記具有很高的靈敏度和優(yōu)良的復(fù)用檢測(cè)能力，在研究3 個(gè)目標(biāo)miRNA 的同時(shí)，通過多重和定量測(cè)定，成功地進(jìn)行了矩陣分析，檢測(cè)限在皮摩范圍內(nèi)[84]。最近，國(guó)內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)使用SERS的檢測(cè)方法對(duì)外泌體和上清血液中的microRNA，通過Fe3O4@Ag-SERS 輔助增強(qiáng)接受信號(hào)，單基的錯(cuò)配識(shí)別達(dá)到1aM，在這個(gè)靈敏度下，可以將胰腺癌與慢性胰腺炎(CP)和正常對(duì)照(NC)區(qū)分開來[85]。隨著新型分析技術(shù)的發(fā)展，矩陣化生物檢測(cè)方法越來越受到人們的重視，采用光子晶體(PC)和SERS 作為兩種編碼元素，在不同模式下對(duì)多重生物檢測(cè)進(jìn)行雙重編碼。在實(shí)踐中，PC 微珠和SERS 納米標(biāo)記分別作為載體和標(biāo)簽，以三明治形式對(duì)抗原進(jìn)行多重檢測(cè)。雙編碼多重生物檢測(cè)具有極低的背景和干擾，以及高穩(wěn)定性和重復(fù)性。定量分析結(jié)果表明，該檢測(cè)系統(tǒng)具有良好的分析性能和較高的靈敏度。對(duì)腫瘤標(biāo)志物AFP 和CEA 的多重檢測(cè)結(jié)果表明，該方法具有靈敏度高、檢測(cè)范圍廣、交叉反應(yīng)性低的特點(diǎn)[86]。LI 課題組利用SERS 有序金納米蜂窩陣列可同時(shí)靈敏檢測(cè)3 個(gè)或3 個(gè)以上目標(biāo)。SERS 是一種有效的分子成像光學(xué)形態(tài)，由于其固有的性質(zhì)，生成的增強(qiáng)拉曼光譜分析物接近納米粗糙銀等貴金屬表面(Ag)或金(Au)。由于化學(xué)物質(zhì)獨(dú)特的窄指紋拉曼光譜，SERS 技術(shù)為生物醫(yī)學(xué)研究提供了多參數(shù)分子分析和多路復(fù)用等具有重要意義的方法。這些特征增強(qiáng)的拉曼光譜從一個(gè)特定的分子物種可以明確用來識(shí)別和量化混合物中的不同目標(biāo)[87]。

2.5 CRISPR（聚簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)）單分子檢測(cè)

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short palindromic repeats)序列是一種基于基因組編輯的技術(shù)，目前已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究中[88]。CRISPR 不僅可以用于核酸生物標(biāo)志物的檢測(cè)，以其為基礎(chǔ)的特異性高靈敏度酶促報(bào)告子解鎖(SHERLOCK)和DNA內(nèi)切酶靶向CRISPR 反式報(bào)告系統(tǒng)(DETECTR)對(duì)檢測(cè)病毒與細(xì)菌核酸也表現(xiàn)出單分子層次的超高靈敏度（如圖9 所示，彩圖見期刊電子版）[89]。這些方法靈敏度可以用于檢測(cè)特定的阿摩爾單鏈DNA 或RNA 序列和高特異性的單堿基錯(cuò)配。

圖9 兩種檢測(cè)病毒RNA 的CRISPR 方法[89]。（a）SHERLOCK 方法；（b）DETECTR 方法Fig. 9 Two CRISPR methods for detecting viral RNA[89]. (a) SHERLOCK assay; (b) DETECTR assay

基于CRISPR 的方法也適用于矩陣檢測(cè)。例如，使用具有特定切割偏好的不同Cas 酶進(jìn)行多重SHERLOCK 測(cè)定，實(shí)現(xiàn)了4 個(gè)RNA 和DNA 靶點(diǎn)的多重檢測(cè)，保持了在阿摩級(jí)范圍內(nèi)的靈敏度[90]。SHERLOCK 和DETECTR 的 主 要 優(yōu) 點(diǎn) 是它們適用于即時(shí)診斷。SHERLOCK 已經(jīng)在基于紙張的橫向流動(dòng)分析中實(shí)現(xiàn)超靈敏的核酸檢測(cè)，可以快速檢測(cè)核酸（小于90 min），且檢測(cè)儀器便于制造。SHERLOCK 更被用于檢測(cè)血清、唾液和尿液樣本矩陣中的登革熱和寨卡病毒[91]。SHERLOCK 還因其具有檢測(cè)單堿基差異的能力，可用來區(qū)分密切相關(guān)的病毒株[92]。該技術(shù)還被用于檢測(cè)引起宮頸癌的人乳頭瘤病毒，采用DETECTR 對(duì)兩種不同類型的人乳頭狀瘤病毒(HPV)進(jìn)行檢測(cè)，響應(yīng)時(shí)間為1 h。其他Cas 酶與DETECTR 配合檢測(cè)可以提高檢測(cè)性能，例如Cas14檢測(cè)DNA 單核苷酸多態(tài)性（基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA 序列多態(tài)性；SNPs）用于檢測(cè)游離細(xì)胞的DNA，可用于癌癥的診斷[93]。

3 單分子檢測(cè)方法總結(jié)

在這篇綜述中，介紹了一些前沿的單分子檢測(cè)方法及相關(guān)應(yīng)用，并對(duì)文中綜述的檢測(cè)方法的特點(diǎn)進(jìn)行匯總（表1）。

表1 文中不同單分子生物檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比Tab.1 Advantages and disadvantages of various methods of single molecule biological detection

4 未來展望及總結(jié)

不同方法的靈敏度、特異性、動(dòng)態(tài)范圍、矩陣檢測(cè)和成本對(duì)于單分子檢測(cè)技術(shù)都十分重要。單分子生物檢測(cè)在生命科學(xué)領(lǐng)域具有革命性的突破，不僅在于對(duì)疾病的早期診斷與治療上，更突出體現(xiàn)在準(zhǔn)確了解潛在生物學(xué)機(jī)制上。許多檢測(cè)方法不能提供足夠的敏感性和特異性，單分子生物檢測(cè)的目的是可以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子的定量分析，定量是理解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和生物系統(tǒng)分子動(dòng)力學(xué)的核心，也是核酸檢測(cè)、測(cè)量從病變細(xì)胞分泌到血液中的蛋白質(zhì)、測(cè)量與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的生物標(biāo)記物等的核心。在這些技術(shù)中，生物傳感器對(duì)單個(gè)分子表現(xiàn)出較高的靈敏度和選擇性。基于單分子檢測(cè)的方法都具有各自的優(yōu)勢(shì)，雖然這些檢測(cè)方法或系統(tǒng)得到了優(yōu)秀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，大幅提高了原有的靈敏度與分辨率，但還存在很多需要突破的關(guān)鍵方向，比如，待測(cè)分子的實(shí)時(shí)量化、生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的生物傳感、多路復(fù)用能力、不同生物分子檢測(cè)的通用性、檢測(cè)速率等仍存在局限性。這是未來能夠讓人們對(duì)生命科學(xué)有更深認(rèn)識(shí)的關(guān)鍵，需要科研人員共同努力繼續(xù)優(yōu)化，解決尚存的問題，以應(yīng)用、實(shí)用為主，實(shí)現(xiàn)多種正交技術(shù)的分析。