落葉松-楊柵銹菌MlpNHA1-like基因的克隆及序列分析

劉亦菲，楊 冰，周顯臻，李嘉雯，于 丹

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊陵 712100)

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)NHA1蛋白是酵母質(zhì)膜反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族成員之一，這類反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于Na+/H+交換蛋白大家族[1]。NHA1至少對4種堿金屬陽離子具有廣泛的底物特異性，在細(xì)胞內(nèi)具備多種功能，包括對滲透脅迫的即時響應(yīng)[2-3]。釀酒酵母NHA1蛋白由985個氨基酸組成，包含高度疏水的N端跨膜結(jié)構(gòu)域和親水的C端結(jié)構(gòu)域。響應(yīng)外界高滲透壓途徑關(guān)鍵調(diào)控因子絲裂原活化蛋白激酶HOG1能夠與NHA1的C端區(qū)域(431～985)互作，并且這種互作不受到是否被外源NaCl處理影響，同時HOG1能夠在體外有效地磷酸化NHA1 C端區(qū)域。更重要的是，NHA1在T765和T876 2個位點(diǎn)被HOG1磷酸化對外源滲透壓脅迫的即時響應(yīng)至關(guān)重要，可以幫助分離的蛋白與染色體上靶標(biāo)位點(diǎn)再次快速結(jié)合[3]。

除釀酒酵母NHA1基因外，在其他真菌中也克隆到4個同源基因，分別為裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)SOD2基因、魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)ZSOD2和ZSOD22基因及白色念珠菌(Candidaalbicans)CNH1基因[4-7]。然而在植物病原真菌中NHA1基因功能的研究報道甚少。專性寄生真菌落葉松-楊柵銹菌侵染楊樹葉片引起楊樹葉銹病，該病害影響楊樹生長，造成重大經(jīng)濟(jì)損失[8-10]。前期研究已成功克隆落葉松-楊柵銹菌中國菌株MlpHOG1基因，并借助小麥赤霉菌體系異源互補(bǔ)試驗(yàn)推斷MlpHOG1基因在該銹菌侵染菌絲生長和響應(yīng)環(huán)境脅迫方面具有一定的作用[11]。本研究通過系統(tǒng)發(fā)育分析和序列相似性比對確定落葉松-楊柵銹菌標(biāo)準(zhǔn)菌株NHA1候選基因，進(jìn)而同源克隆獲得中國菌株MlpNHA1-like基因的ORF片段，并對目的蛋白的基本理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位等方面進(jìn)行預(yù)測分析，為后續(xù)明確目的蛋白功能及其與MlpHOG1蛋白的互作關(guān)系提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 落葉松-楊柵銹菌中國菌株wh03為單孢菌系，由西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院森林病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。使用太白楊(Populuspurdomii)在溫室進(jìn)行菌株人工擴(kuò)繁，根據(jù)曹支敏等[12]的方法進(jìn)行菌株的活化及保存。

1.1.2 主要試劑 引物序列合成和大腸桿菌陽性轉(zhuǎn)化子測序由北京奧科鼎盛生物科技有限公司(楊凌分部)完成。總RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq酶購自Thermo Scientific公司，TransStartFastPfu酶購自全式金公司，pMD19-T載體購自TAKARA公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 候選基因系統(tǒng)發(fā)育分析 以釀酒酵母NHA1(YLR138W)的蛋白序列為查詢序列，在供試真菌的全基因組數(shù)據(jù)庫中以1e-5為閾值進(jìn)行比對分析，獲得每個供試物種與釀酒酵母NHA1相關(guān)的候選基因的蛋白序列(表1)。將所有蛋白序列用軟件MEGA7.0對齊，用gblocks移除序列中g(shù)aps較多的區(qū)域。最后，用iqtree構(gòu)建最大似然法(Maximum likelihood)樹，設(shè)置“-m”參數(shù)調(diào)用ModelFinder預(yù)測出待分析的氨基酸序列的最佳替代模型，設(shè)置“-b 1000”采用1 000次重復(fù)計算的常規(guī)自展檢驗(yàn)法(Bootstrap)對分支可靠性進(jìn)行評估。生成的樹文件使用MEGA7.0軟件查看。

表1 參與NHA1系統(tǒng)進(jìn)化分析的物種及比對結(jié)果

1.2.2 總RNA的提取及cDNA的合成 參照QIAGEN公司Rneasy Plant Mini Kit試劑盒說明書，提取落葉松-楊柵銹菌夏孢子總RNA，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000檢測RNA的完整性、濃度及純度。參照Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。

1.2.3 引物設(shè)計及目的基因克隆 根據(jù)落葉松-楊柵銹菌標(biāo)準(zhǔn)菌株98AG31全基因組數(shù)據(jù)庫(v1.0，https://mycocosm.jgi.doe.gov/Mellp1/Mellp1.home.html)[13]中Protein ID 116278基因序列，利用軟件Primer Premier 5設(shè)計特異性擴(kuò)增引物。上游引物為116278-uF1(5′CGAAGAACCAAGAGCCACAAG3′)，下游引物為116278-uR1(5′ GTGAGCCATTGAGATTGTATG 3′)。

PCR反應(yīng)總體系為 50 μL：5×TransStarFastPfuBuffer 10 μL，2.5 mM dNTPs 4 μL，10 μM上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，TransStarFastPfuDNA聚合酶1 μL，無菌水32 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 1 min；95 ℃變性 20 s，58 ℃退火 20 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸 5 min，16 ℃保存。擴(kuò)增完成后，在PCR產(chǎn)物中加入0.6 μLTaqDNA聚合酶，72 ℃延伸30 min，16 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書，回收目的條帶?；厥债a(chǎn)物連接pMD19-T載體骨架，利用熱激法將重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，最后將篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子送至公司進(jìn)行測序。

1.2.4 目的基因編碼蛋白生物信息學(xué)分析 利用ExPASy在線工具ProtParam分析目的基因編碼蛋白的相對分子質(zhì)量、殘基數(shù)目與組成、等電點(diǎn)和穩(wěn)定性等基本理化性質(zhì)。利用NCBI的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(conserved domain database，CDD)和在線工具SMART分析目的基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，并使用TBtools[14]進(jìn)行繪制。利用TMHMM Server 2.0工具和ExPASy在線工具Protscale在線分析目的基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域和氨基酸序列親水/疏水性。利用SOPMA在線工具預(yù)測目的基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)。利用4種在線軟件EuK-mPLoc 2.0、WOLF PSORT、CELLO和PROTCOMP預(yù)測分析目的蛋白的亞細(xì)胞定位區(qū)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選基因的確定

以釀酒酵母NHA1蛋白序列為誘餌，在落葉松-楊柵銹菌標(biāo)準(zhǔn)菌株98AG31全基因組數(shù)據(jù)庫(v1.0)中進(jìn)行比對，得到2個蛋白序列，Protein ID分別為45128和116278。進(jìn)而選取擔(dān)子菌柄銹菌亞門松櫟柱銹菌和小麥稈銹菌、擔(dān)子菌黑粉菌亞門玉米黑粉菌、子囊菌盤菌亞門稻瘟菌和禾谷鐮孢菌、子囊菌外囊菌亞門裂殖酵母、子囊菌酵母亞門白色念珠菌及接合菌卷枝毛霉等多種代表真菌，將比對后獲得的所有與NHA1相關(guān)的蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果顯示，ID 45128(v1.0)為NHA1在落葉松-楊柵銹菌標(biāo)準(zhǔn)菌株98AG31中的直系同源基因(圖1)，命名MlpNHA1。ID 116278(v1.0)雖然不是直系同源基因(圖1)，但其在釀酒酵母全基因組數(shù)據(jù)庫中序列相似性比對得到唯一蛋白序列即NHA1(e-value為2e-59)，并且其編碼蛋白具有與NHA1相同的保守結(jié)構(gòu)域(c_cpa1，e-value為5.92e-97)，命名為MlpNHA1-like。

注：1)供試物種中與NHA1相關(guān)的所有蛋白序列一同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；2)物種后的數(shù)字代表在JGI相應(yīng)物種數(shù)據(jù)庫中的蛋白序號(Protein ID)；3)自展支持率標(biāo)注于節(jié)點(diǎn)。

2.2 目的基因的克隆

提取落葉松-楊柵銹菌中國菌株wh03夏孢子總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為擴(kuò)增模板。由于標(biāo)準(zhǔn)菌株98AG31中注釋的基因ID 45128序列不完整，尚未克隆到該基因的ORF片段。根據(jù)基因ID 116278的序列設(shè)計特異引物進(jìn)行同源克隆，PCR擴(kuò)增后得到一個特異且濃度較高的條帶，大小約為1.7 kb。切膠回收及TA克隆檢測后進(jìn)行測序分析，結(jié)果表明成功獲得wh03菌株基因ID 116278的ORF片段，長度為1 545 bp，將該基因命名為MlpNHA1-like (wh03)(GenBank accession number MZ826137)。

2.3 目的基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

利用在線軟件ProtParam進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明MlpNHA1-like (wh03) 基因編碼514個氨基酸，相對分子量57.787 ku。在極性氨基酸分析中，負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)總數(shù)為46個，正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)總數(shù)為40個，帶負(fù)電荷的數(shù)目略多于正電荷。MlpNHA1-like (wh03)理論等電點(diǎn)(pI)為5.81，說明偏酸性。預(yù)測的不穩(wěn)定指數(shù)為36.56，未超過40，推測屬于穩(wěn)定蛋白。

釀酒酵母NHA1蛋白具有高度疏水的N端跨膜結(jié)構(gòu)域和親水的C端結(jié)構(gòu)域[3]。利用NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(CDD)分析，發(fā)現(xiàn)MlpNHA1-like (wh03)蛋白具有和NHA1一致的保守結(jié)構(gòu)域c_cpa1(圖2A)。在線軟件SMART分析結(jié)構(gòu)域顯示MlpNHA1-like (wh03)蛋白具有10個跨膜結(jié)構(gòu)，與NHA1特征一致(圖2B)。進(jìn)一步借助TMHMM Server 2.0 工具對目的蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果同樣表明MlpNHA1-like (wh03)蛋白包含10個跨膜結(jié)構(gòu)，分別位于第15～32、37～59、74～93、106～128、212～234、254～273、308～330、342～364、374～396、409～431位氨基酸(圖3A)。使用在線軟件Protscale分析氨基酸序列親疏水性，圖形的高峰值(正值)的區(qū)域表示疏水的區(qū)域，而負(fù)值的“低谷”區(qū)域是親水區(qū)域，分析結(jié)果顯示預(yù)測的疏水區(qū)域與跨膜區(qū)域基本一致(圖3B)。

圖2 MlpNHA1-like (wh03)蛋白保守結(jié)構(gòu)域

圖3 MlpNHA1-like (wh03)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)和親/疏水性區(qū)域

運(yùn)用SOPMA在線預(yù)測目的蛋白二級結(jié)構(gòu)，顯示MlpNHA1-like (wh03)蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由4種形式組成(圖4)，分別為45.33%的α-螺旋(Alpha helix)、3.89%的β-轉(zhuǎn)角(β-turn)、13.42%的延伸鏈(Extended strand)和37.35%的無規(guī)則卷曲(Random coil)，其中α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主要二級結(jié)構(gòu)。

圖4 MlpNHA1-like (wh03)蛋白二級結(jié)構(gòu)組成

2.4 目的基因編碼蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測分析

蛋白亞細(xì)胞定位的預(yù)測可為后續(xù)功能研究提供參考。采用4種在線軟件EuK-mPLoc、WOLF PSORT、CELLO和PROTCOMP對MlpNHA1-like (wh03)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析。EuK-mPLoc預(yù)測結(jié)果顯示目的蛋白定位在細(xì)胞膜(cell membrane)區(qū)域。其余3種軟件預(yù)測結(jié)果由計算的數(shù)值來反映，數(shù)值越高則預(yù)測的準(zhǔn)確性越大。WOLF PSORT軟件預(yù)測顯示數(shù)值明顯高的2個區(qū)域?yàn)橘|(zhì)膜(plas：13)和線粒體(mito：9)。CELLO預(yù)測結(jié)果顯示質(zhì)膜區(qū)域數(shù)值明顯高于其他區(qū)域(Plasma Membrane：4.943)。同樣，PROTCOMP整體預(yù)測結(jié)果顯示質(zhì)膜區(qū)域數(shù)值明顯高于其他區(qū)域(Plasma Membrane：9.85)。因此，4種軟件綜合預(yù)測顯示MlpNHA1-like (wh03)蛋白定位在質(zhì)膜區(qū)域。

3 結(jié)論與討論

結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析、序列相似性比對及同源克隆，獲得落葉松-楊柵銹菌中國菌株MlpNHA1-like (wh03)基因ORF片段，并對目的基因編碼蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位預(yù)測分析。

通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，落葉松-楊柵銹菌ID 45128與酵母菌NHA1所在的同一進(jìn)化枝被外群卷枝毛霉隔開，并且在該進(jìn)化枝中供試物種候選基因的進(jìn)化趨勢與供試物種進(jìn)化趨勢一致，該枝內(nèi)所有候選基因包括ID 45128均與酵母菌NHA1基因互為直系同源基因，將ID 45128命名為MlpNHA1。ID 116278基因?yàn)榕韵低椿?，由于可能與釀酒酵母NHA1基因有功能保守性，將其命名為MlpNHA1-like。這類NHA1-like基因僅存在于落葉松-楊柵銹菌、松櫟柱銹菌和玉米黑粉菌這3種供試擔(dān)子菌中，在供試的小麥稈銹菌及子囊菌中均發(fā)生了缺失。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果可知，在擔(dān)子菌和子囊菌發(fā)生分歧前，NHA1基因與NHA1-like基因的分歧就已發(fā)生，長時間的分歧下兩類基因的功能保守程度有待于進(jìn)一步的研究。

考慮到釀酒酵母HOG1與NHA1互作并將其磷酸化從而應(yīng)對外界滲透壓脅迫[3]，因此將MlpNHA1和MlpNHA1-like都確定為候選基因。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)菌株98AG31中目的基因的序列在中國菌株中進(jìn)行同源克隆，但MlpNHA1的序列不完整，目前MlpNHA1基因還未成功克隆，后續(xù)將嘗試多種克隆方法以期獲得MlpNHA1基因的ORF片段。通過NCBI中GEO DataSets數(shù)據(jù)庫查找標(biāo)準(zhǔn)菌株98AG31中MlpNHA1-like基因(ID 116278)的表達(dá)情況[15]，顯示夏孢子及其萌發(fā)階段的表達(dá)量均相對較高(結(jié)果未展示)。本研究以中國菌株夏孢子cDNA為模板擴(kuò)增獲得較亮條帶，與之較為吻合。比較中國菌株wh03和來自法國的標(biāo)準(zhǔn)菌株98AG31中MlpNHA1-like基因的核苷酸序列，顯示二者長度相同，30個核苷酸位點(diǎn)存在差異，相似性為98%，整體較為保守。和之前克隆的MlpMKK1/1基因相比[16]，在不同地域菌株中核苷酸差異位點(diǎn)略有增加。

預(yù)測分析顯示，目的蛋白MlpNHA1-like(wh03)具有與釀酒酵母NHA1蛋白一致的保守結(jié)構(gòu)域c_cpa1。并且，目的蛋白具有系列跨膜結(jié)構(gòu)且與疏水區(qū)域位置基本一致，結(jié)合釀酒酵母NHA1蛋白特征[17]，推斷較長的跨膜區(qū)域?yàn)槟康牡鞍譔端部分；預(yù)測表明其余下游較短部分為親水區(qū)域，推斷為目的蛋白C端部分。亞細(xì)胞定位預(yù)測目的蛋白MlpNHA1-like(wh03)分布在質(zhì)膜區(qū)域，與Western blot檢測釀酒酵母NHA1蛋白定位在質(zhì)膜區(qū)域[18]結(jié)果一致，同時與預(yù)測具有跨膜結(jié)構(gòu)存在也較為吻合。雖然MlpNHA1-like(wh03)基因不是NHA1在落葉松-楊柵銹菌中的直系同源基因，但結(jié)合序列比對分析和生物信息學(xué)預(yù)測分析推斷二者具有一定共性存在。釀酒酵母HOG1與NHA1的C端區(qū)域互作并將其磷酸化從而即時響應(yīng)外界滲透壓脅迫[3]。在落葉松-楊柵銹菌中，MlpNHA1-like(wh03)能否與MlpHOG1相互作用參與致病過程及包含滲透脅迫在內(nèi)的各種環(huán)境脅迫應(yīng)答過程，有待后續(xù)進(jìn)一步分析。