全自動固相萃取-三重四級桿質譜聯(lián)用法測定釀酒用原輔料中108種農(nóng)藥殘留

葉華夏，黃 箭，薛潤萍，李茂春，安明哲，謝正敏

（五糧液股份有限公司，四川宜賓 644000）

白酒釀造主要使用的原輔料為大米、小麥、糯米、玉米、高粱、稻殼，這6 種原輔料在生產(chǎn)儲存過程中，使用的農(nóng)藥會直接或間接地殘存于釀酒原料中，為釀酒生產(chǎn)過程帶來不良影響，如影響有益微生物的生長、改變窖泥的性狀，從而影響酒的品質。

根據(jù)國標等相關標準，釀酒原輔料大米、小麥、糯米、玉米、高粱、稻殼中常見的農(nóng)藥品種為108種；公司釀酒生產(chǎn)所用的原料糧食的數(shù)量也很巨大，當樣品量大時，人工前處理方法可能會無法滿足檢測需要。本研究建立了基于全自動均質儀、固相萃取儀、平行濃縮儀的釀酒用原輔料的前處理方法，本方法對樣品處理速度快，可以一次同時處理多個樣品，提高了檢測效率。樣品前處理過程均由儀器完成，消除了人為操作的誤差，使得結果更加精確可信，滿足生產(chǎn)需要。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料樣品：公司釀酒原輔料大米、糯米、玉米、高粱、小麥混合糧粉。

標準品及試劑：108種農(nóng)藥濃度為0.1 mg/mL的標準儲備液；乙腈（色譜純）；甲苯（色譜純）；正己烷（色譜純）；氯化鈉（分析純）。

耗材：C固相萃取柱（1000 mg/6 mL CNWBOND）、GCB/NH2 固相萃取柱（500 mg/500 mg，6 mL CNWBOND）、0.2 μm有機系濾膜。

儀器設備：Raykol Fotector Plus 全自動固相萃取儀，Raykol AutoEVA-60全自動平行濃縮儀，全自動均質儀，三重四級桿氣相色譜串聯(lián)質譜聯(lián)用儀，Agilent Technologies,Inc.7890B-7000C。

1.2 試驗方法

1.2.1 前處理方法

1.2.1.1 樣品的制備

取待測樣品經(jīng)粉碎機粉碎后，過20 目篩，混勻制成待測樣，放入容器中備用。

1.2.1.2 樣品提取

稱取20 g 粉碎完成的樣品（精確至0.01 g）于80 mL 離心管中，加入40 mL 乙腈，均質器15000 r/min 勻漿提取1 min，加入5 g 氯化鈉，再勻漿提取1 min，離心機3000 r/min 離心5 min，取上清液20 mL（相當于10 g試樣量），待凈化。

1.2.1.3 第一次凈化

將C柱安裝在Fotector Plus 全自動固相萃取儀上，活化：約10 mL 乙腈；上樣：將待凈化的乙腈提取液轉移到固相萃取柱上；淋洗：15 mL 乙腈淋洗收集所有流出液，具體步驟見表1 所示。采用AutoEVA-60 全自動平行濃縮儀將上述收集液氮吹濃縮至1 mL左右。

表1 第一次凈化固相萃取步驟

1.2.1.4 第二次凈化

將GCB/NH柱接在固相萃取裝置上，加入約2 g 無水硫酸鈉于柱上方，下接收集管?；罨杭s4 mL 乙腈+甲苯（3+1）；上樣：將濃縮液轉移至固相萃取柱上方，以6 mL 乙腈+甲苯（3+1）分三次清洗雞心瓶后轉移到固相萃取柱上；洗滌串聯(lián)柱：25 mL乙腈+甲苯（3+1）。詳細過程請見表2。40 ℃水浴溫度下，將收集液旋轉濃縮至0.5 mL，將濃縮液轉移至氮吹管中，5 mL 正己烷分3 次洗滌雞心瓶，合并，40 ℃氮吹吹至0.5 mL，再加入5 mL 正己烷，氮吹至體積小于1 mL，供GC/MS/MS 檢測。

表2 第二次凈化固相萃取步驟

1.2.2 儀器條件

色譜條件：色譜柱：HP-5MS UI Agilent 30 m*0.25 mm*0.25 μm；升溫程序：60 ℃（保持2 min）以5 ℃/min 升溫至280 ℃（保持20 min）；進樣口溫度：280 ℃；載氣：氦氣，純度≥99.999 %；流速：1 mL/min；進樣量：1 μL；進樣方式：不分流進樣。

質譜條件：He 淬滅氣體：2.25 mL/min；N碰撞氣體：1.5 mL/min；電離方式:EI；掃描方式：MRM；電離能量：70 eV；質量掃描范圍：30～550；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；四級桿溫度：150 ℃；溶劑延遲：5 min。

1.2.3 定性及定量分析

待測樣品中，檢出的色譜峰保留時間與標準圖譜相一致；進行背景扣除后，定量離子、定性離子都出現(xiàn)，定量離子與定性離子的比值需要與標準品中的比值保持一致。本方法采用外標法進行定量，以標準品的峰面積與待測樣品峰面積之比進行計算。農(nóng)藥殘留組分的前級離子、產(chǎn)物離子、碰撞能量見表3。

表3 108種農(nóng)藥的質譜MRM采集參數(shù)

續(xù)表3 (一) 108種農(nóng)藥的質譜MRM采集參數(shù)

續(xù)表3(二) 108種農(nóng)藥的質譜MRM采集參數(shù)

2 結果與分析

2.1 基質加標回收實驗

以混合糧粉為基質樣品，進行樣品基質加標回收實驗，添加濃度為0.05 mg/kg 標樣進行固相萃取凈化，測試其回收率及精確度（n=6）。詳細的測試數(shù)據(jù)見表4。加標試驗回收率的相對標準偏差需要小于20%。

表4 108種農(nóng)藥回收率及精確度

2.2 與手動前處理方法的比較

2.2.1 處理效果的比較

以混合糧粉為樣品，全自動前處理方法平行處理3 次樣品，手動方法按指定方法處理樣品，檢測結果如表5。

由表5 可以看出，全自動前處理方法對樣品檢測的重現(xiàn)性較好，個別檢出的農(nóng)殘也與手動方法檢測結果相符。

表5 不同方法糧粉農(nóng)殘檢測結果 (μg/kg)

2.2.2 處理時間的比較

全自動前處理儀器一次可以同時處理6 個樣品，因此我們以處理6 個樣品的實驗時間來進行比較，具體見表6。

由表6 可知，當樣品量較大時，全自動前處理方法更加節(jié)約實驗時間。

3 結論

本方法可實現(xiàn)釀酒原輔料中多種農(nóng)藥殘留樣品的提取和凈化前處理過程全自動化，將稱量好的樣品加入溶劑放置于離心管中，通過AH-30 全自動均質儀進行均質萃取，保證萃取效果；經(jīng)均質提取完的萃取液通過Fotector Plus 全自動固相萃取儀對其進行凈化，具有高效性以及良好平行性，可以滿足多種農(nóng)藥的凈化要求；洗脫液通過AutoEVA-60 平行濃縮儀進行濃縮，實現(xiàn)60 個樣品同時進行，加快濃縮速度，提高實驗效率。與手動前處理方法相比，當樣品量大時，本文建立的方法操作省時，全自動儀器處理消除了人為誤差，靈敏度和準確度都符合要求，可用于釀酒原輔料中多種農(nóng)藥殘留的檢測分析。

表6 不同前處理方法時間的對比（min）