中草藥對(duì)奶牛乳房炎致病菌的體外抑菌效果試驗(yàn)

何顯杰

清豐縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南清豐 457300

0 引言

奶牛乳房炎是奶牛乳腺組織發(fā)生病理機(jī)能變化的防御應(yīng)答反應(yīng)[1]，大多數(shù)病例由病原微生物侵染奶牛機(jī)體內(nèi)部而引發(fā)，對(duì)奶牛泌乳性能、乳汁理化特性和生理繁殖機(jī)能等造成不利影響，成為奶牛疾病防控的重要內(nèi)容。致病性細(xì)菌是奶牛乳房炎的主要致病因子，種類(lèi)較多，盡管奶牛乳房炎致病菌存在區(qū)域差別，但金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌和大腸桿菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌，約占細(xì)菌性乳房炎的70%以上[2]。在長(zhǎng)期獸醫(yī)臨床治療中，抗生素在防控細(xì)菌性奶牛乳房炎方面發(fā)揮了重要作用，但也帶來(lái)了牛奶抗生素殘留超標(biāo)、耐藥菌株不斷增多等嚴(yán)重問(wèn)題。

中草藥來(lái)源廣泛，存在于動(dòng)植物和礦石等中，具有無(wú)毒或低毒、無(wú)污染、無(wú)殘留和無(wú)耐藥性等諸多優(yōu)勢(shì)[3]。很多中草藥表現(xiàn)抗毒素和抑菌的藥物功效，能夠提高動(dòng)物免疫力和機(jī)體的抗病能力，是很好的抗生素替代品。本試驗(yàn)根據(jù)中獸藥理論，結(jié)合乳房炎致病機(jī)制，按照“清熱解毒、抗菌消炎、消腫止疼和通經(jīng)利乳”的配伍原則，選取10 種中草藥應(yīng)用于奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌和大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)，旨在篩選抑菌效果顯著的中草藥，為臨床防治奶牛乳房炎的中草藥研制和應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 中草藥

板藍(lán)根、蒲公英、紫花地丁、黃連、連翹、黃芩、金銀花、魚(yú)腥草、紅花和大青葉，購(gòu)自濮陽(yáng)市天業(yè)藥店。分別稱取上述中草藥20 g，用去離子水浸泡2～3 h，猛火煮開(kāi)后調(diào)為文火，煮30 min，過(guò)濾，藥渣中再加去離子水，煮20 min，過(guò)濾。2 次藥液合并濃縮至藥液濃度為1 g/mL，分裝于玻璃瓶，4 ℃保存，備用。

1.1.2 菌株和培養(yǎng)基

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和無(wú)乳鏈球菌來(lái)自清豐縣部分奶牛場(chǎng)乳房炎奶牛，經(jīng)分離鑒定得到。普通肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（含2%小牛血清）由濮陽(yáng)市動(dòng)物疫病控制中心提供。

用接種環(huán)無(wú)菌挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接種于普通肉湯培養(yǎng)基，無(wú)乳鏈球菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（含2%小牛血清），37 ℃培養(yǎng)18～24 h，3 種菌液復(fù)壯后，在紫外可見(jiàn)光光度計(jì)下比色，將波長(zhǎng)調(diào)至625 nm處進(jìn)行稀釋菌液，當(dāng)吸光度值為0.08～0.1時(shí)細(xì)菌濃度為1×108～2×108CFU/L即可，備用。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

無(wú)菌操作臺(tái)、高壓滅菌鍋、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV5，梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司；恒溫箱、打孔器（孔徑Φ＝3 mm）等，本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 抑菌試驗(yàn)

根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]，采用試管二倍稀釋法測(cè)定中草藥對(duì)3 種細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC）。體外抑菌試驗(yàn)：取30 支5 mL滅菌試管，分成3組（1 種菌液1組），每組10 支試管，分別標(biāo)記1～10號(hào)，每組每個(gè)試管中裝入1 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，另在每組1號(hào)試管添加1 mL中草藥液，搖勻，吸取1 mL混合液加入2號(hào)試管，以此類(lèi)推，至8號(hào)試管（棄去1 mL），9號(hào)試管設(shè)為菌液空白對(duì)照，不添加中草藥液，10號(hào)試管設(shè)為中草藥液對(duì)照，不添加菌液。分別吸取0.05 mL制備后的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和無(wú)乳鏈球菌加入每組每個(gè)試管中，37 ℃培養(yǎng)24 h，與空白對(duì)照比較，以肉眼觀察培養(yǎng)基清亮且未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度判定為該藥物的最低抑菌濃度（MIC）。每組3 個(gè)重復(fù)，取重復(fù)數(shù)值多者為MIC值。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 中草藥對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

連翹對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC為15.63 mg/mL，其次為板藍(lán)根、蒲公英、紫花地丁、黃芩、金銀花、大青葉，MIC均為31.25 mg/mL（表1）。

表1 中草藥對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.2 中草藥對(duì)大腸桿菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果

板藍(lán)根、蒲公英和黃芩的MIC最低，為62.5 mg/mL，抑菌效果最好，其次為紫花丁、連翹、金銀花和魚(yú)腥草，MIC為125 mg/mL（表2）。

表2 中草藥對(duì)大腸桿菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.3 中草藥對(duì)無(wú)乳鏈球菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

紫花丁的MIC最低為15.63 mg/mL，抑菌效果最好，其次為板藍(lán)根、蒲公英、紫花丁、連翹、黃芩和金銀花，MIC為31.25 mg/mL（表3）。

表3 中草藥對(duì)無(wú)乳鏈球菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

細(xì)菌是引起奶牛乳房炎的主要病原微生物，因此，殺滅或者抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖是防治該病的關(guān)鍵。在我國(guó)實(shí)行飼料禁抗的大趨勢(shì)下，中草藥含有許多天然生物活性成分，抗菌消炎效果較好，是抗生素替代品的主要研究方向。謝成運(yùn)等[5]應(yīng)用黃芩、黃連、丹參、連翹等對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌體外抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)中草藥對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果較好。百合地開(kāi)力地等[6]報(bào)道，金銀花、魚(yú)腥草、紅花等對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌（大腸桿菌、鏈球菌和綠膿桿菌等）的最小抑菌濃度均為15.63 mg/mL；丁月云等[7]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩、大青葉、連翹等對(duì)豬大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌效果顯著。朱曉萍等[8]研究黃連等中草藥對(duì)常見(jiàn)病原菌的體外抑菌效果，結(jié)果顯示，所選10 種中草藥對(duì)奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和無(wú)乳鏈球菌均有不同程度的抑菌效果。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，連翹對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC為15.63 mg/mL；板藍(lán)根、蒲公英和黃芩對(duì)大腸桿菌抑菌效果最好，MIC為62.5 mg/mL；紫花丁對(duì)無(wú)乳鏈球菌抑菌效果最好，MIC為15.63 mg/mL。與上述學(xué)者研究結(jié)果相同或近似。但是，體外抑菌試驗(yàn)對(duì)中草藥的抗菌作用只能是一種參考性的方法，其實(shí)際臨床應(yīng)用效果還必須通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)加以比較、驗(yàn)證，從而進(jìn)一步闡明其抑菌機(jī)理。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)10 種中草藥對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和無(wú)乳鏈球菌均具有不同程度的抑菌特性。該試驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床應(yīng)用中藥防治奶牛乳房炎病具有一定的積極意義，為進(jìn)一步篩選效果良好的抗菌中藥復(fù)方提供參考。