油葵苗期抗旱相關(guān)性狀的QTL定位及候選基因篩選

石慧敏，侯建華，蘇飛燕，王艷霞，李丹丹，周佳嶺

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 呼和浩特 010019)

干旱是世界范圍內(nèi)限制農(nóng)作物產(chǎn)量的主要因素之一[1]。在干旱頻發(fā)地區(qū)，種植耐旱性較強(qiáng)的作物顯得尤為重要[2]。向日葵是干旱半干旱地區(qū)一種十分重要的油料作物，根系發(fā)達(dá)，具有良好的抗旱潛力[3-5]，但其分布和產(chǎn)量仍受干旱的影響很大[6-11]。苗期是向日葵生長發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，苗期受旱對向日葵形態(tài)建成、生長發(fā)育以及后期產(chǎn)量和品質(zhì)形成都具有很大的影響，因此開展向日葵苗期抗旱性的研究至關(guān)重要。由于農(nóng)作物抗旱的遺傳機(jī)制非常復(fù)雜，因此常規(guī)育種方法在該領(lǐng)域若想取得重大進(jìn)展比較困難[12]。近年來，分子標(biāo)記技術(shù)已成功地應(yīng)用于數(shù)量性狀位點(diǎn)的鑒定(QTL)，且在挖掘作物對干旱脅迫響應(yīng)的重要性狀基因位點(diǎn)中已經(jīng)有廣泛的應(yīng)用[12-13]。HERVé等[14]報(bào)道了4個葉綠素濃度QTL和1個相對含水量 QTL，分別解釋了53%和9.8%的表型變異。Nishtman等[15]從PAC2×RHA266雜交的123個自交系及其親本中選取70個自交系為材料，在淹水狀態(tài)下分別檢測到葉綠素濃度和相對含水量的3個和6個QTL。在水分脅迫條件下，鑒定出7個和2個QTL。并發(fā)現(xiàn)葉綠素濃度和相對含水量的QTL在連鎖群10和16上存在重疊現(xiàn)象。最終認(rèn)為兩種水分條件下不同性狀的共同QTL位點(diǎn)在連鎖群10上顯得更為重要。張永虎[16]構(gòu)建了1張包含17個連鎖群并分布有738個標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜，兩種水分處理下檢測到30個QTL。盡管前人對向日葵干旱脅迫的研究取得了一定的進(jìn)展，但是由于上述用于QTL定位的遺傳圖譜所涉及到的標(biāo)記數(shù)量少、密度低，因此無法揭示向日葵耐旱性的綜合遺傳機(jī)制。隨著向日葵基因組的公布，為挖掘向日葵抗旱相關(guān)的重要候選基因提供了可能。

基于此，本研究利用前期構(gòu)建的高密度分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜，通過對150個株系組成的重組自交系群體苗期抗旱相關(guān)性狀的表型及遺傳統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行了QTL定位和候選基因的挖掘，為油葵遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)所用材料，是內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院提供的2個親本材料K55(弱抗旱性)和K58(強(qiáng)抗旱性)，雜交后由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)通過單粒傳法構(gòu)建的150個株系組成的F7代重組自交系群體。

1.2 材料種植和指標(biāo)測定

2018年春季，選擇籽粒飽滿的向日葵種子，用氯化汞溶液消毒浸泡5 min，用蒸餾水多次沖洗，在水分合適的培養(yǎng)皿內(nèi)室溫催芽2 d，種植于塑料盆(250 mm×190 mm×160 mm)，每盆中裝4 kg土壤(75%砂：20%營養(yǎng)土壤：5%蛭石)，種植前澆透水，每盆留苗8株，置于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)人工智能溫室中。溫室內(nèi)的溫度設(shè)置為25 ℃，濕度設(shè)置為40%。試驗(yàn)設(shè)置干旱脅迫和正常澆水(對照)2個處理，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。在向日葵幼苗生長到3片葉時(shí)開始進(jìn)行干旱脅迫處理，脅迫期間每3 d 測定1次土壤含水量，干旱脅迫土壤含水量控制在5%～10%，正常澆水土壤含水量控制在15%～20%，對照條件下以最高土壤含水量20%，脅迫條件下以最高土壤含水量10%來計(jì)算每次澆水量，澆水量=(土壤最高含水量-土壤測定含水量)×土壤風(fēng)干重量，土壤含水量和澆水量見表1。

表1 土壤含水量及澆水量對照表

脅迫15 d之后，每個材料隨機(jī)選取5株，對正常澆水和干旱脅迫兩種水分條件處理下的向日葵幼苗的葉片相對電導(dǎo)率、葉綠素含量、葉面積、葉片相對含水量、根長共5個性狀進(jìn)行測定。根長用根系掃描儀(萬深 LA-S) 測定，葉綠素含量(SPAD值)使用葉綠素儀(TYS-A) 測定，葉面積用葉面積系數(shù)法測定，葉片相對電導(dǎo)率用DDS-11A電導(dǎo)儀測定；采用飽和稱重法測定葉片的相對含水量[17]，計(jì)算公式為：

RWC=[(Wf-Wd) / (Wt-Wd)]×100%

其中，Wf為葉片鮮重，Wd為葉片干重，Wt為被水飽和后的葉片重量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用Excel 2019軟件對表型數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入整理，利用SPSS23.0軟件進(jìn)行表型性狀分析、相關(guān)分析等，利用JoinMap4.0，采用CIM(復(fù)合區(qū)間作圖法)定位方法對向日葵幼苗性狀進(jìn)行QTL定位。

1.4 QTL定位

本研究定位所使用的高密度遺傳連鎖圖譜是呂品等[18]于2017年以油用向日葵強(qiáng)抗旱自交系K58為父本，弱抗旱自交系K55為母本進(jìn)行雜交獲得150個F7重組自交系(RIL)群體所構(gòu)建的。該圖譜包含4 912個SNP標(biāo)記和93個SSR標(biāo)記，分布于向日葵17個連鎖群上，總長2 425.05 cM，相鄰2個標(biāo)記間的平均距離0.49 cM。 采用JoinMap4.0軟件對RIL定位群體的所有基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析。使用復(fù)合區(qū)間映射(CIM)方法[19]來識別QTL。用PT檢驗(yàn)1 000次設(shè)定閾值，首先考慮0.99置信度對應(yīng)的LOD閾值，若沒有定位區(qū)間則考慮0.95置信度對應(yīng)的LOD閾值；若沒有定位區(qū)間則考慮0.90置信度的閾值。若仍沒有結(jié)果則沒有考慮PT檢驗(yàn)的結(jié)果，手動降低閾值到3.0；若3.0沒有區(qū)間則降到2.5或2.0。檢測到的各性狀QTL位點(diǎn)命名方法為：q+所測性狀的英文名縮寫+連鎖群位置+QTL編號。

1.5 候選基因篩選

利用遺傳連鎖圖譜中的所有SNP和SSR標(biāo)記，確定了物理圖譜和遺傳圖譜的比對關(guān)系。在基因組上檢測到的與QTL的置信區(qū)間一致的區(qū)域被認(rèn)為是QTL區(qū)域，位于QTL內(nèi)的基因被定義為QTL的候選基因，如Chao等[20]的方法所述。本研究選擇掃描標(biāo)記區(qū)間內(nèi)基因組區(qū)域?qū)?yīng)的候選基因，以2017年發(fā)布的向日葵基因組作為參考基因組進(jìn)行比對[21]，并利用GO、KEGG、COG、NR、pam、Swiss-Prot等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀分析

圖1顯示，兩個親本和RIL群體中的150個材料在正常澆水和干旱脅迫條件下5個抗旱相關(guān)性狀的正態(tài)分布結(jié)果。從圖1可以看出，所有性狀均呈連續(xù)分布，且呈現(xiàn)正態(tài)分布或偏正態(tài)分布，符合QTL定位的要求。

從表2可以看出，在正常灌水條件下，兩親本間的平均值差異不是很明顯；強(qiáng)抗旱種質(zhì)K58葉片相對電導(dǎo)率、葉綠素含量、葉片相對含水量、葉面積和根長等5個性狀均高于K55(弱抗旱種質(zhì))，RIL群體的變異系數(shù)為7.6%～45.4%。在干旱條件下，K58(強(qiáng)抗旱種質(zhì))的所有性狀也均高于K55(弱抗旱種質(zhì))，RIL群體的變異系數(shù)在12.0%～42.2%之間。

表2 正常澆水和干旱脅迫條件下親本和RIL群體各性狀指標(biāo)

從表3可知，正常澆水條件下，葉片相對電導(dǎo)率與葉綠素含量呈極顯著正相關(guān)，與葉片相對含水量呈顯著性負(fù)相關(guān)，但未達(dá)到極顯著水平；干旱脅迫條件下，葉片相對電導(dǎo)率與葉綠素含量仍呈極顯著正相關(guān)；此外，根長與葉面積呈顯著性正相關(guān)，但未達(dá)到極顯著水平。

表3 正常澆水和干旱脅迫條件下RIL群體各性狀間的相關(guān)分析

2.2 QTL定位

兩種水分條件下向日葵苗期抗旱相關(guān)性狀的QTL定位結(jié)果顯示，在RIL群體中共有11個QTL位點(diǎn)，正常澆水條件下5個QTL，干旱脅迫條件下6個QTL。定位于5號連鎖群上的位點(diǎn)最多，為3個QTL位點(diǎn)。各性狀的表型貢獻(xiàn)率處于0.768%～7.547%之間(表4，圖2)。

表4 兩種水分條件下苗期各性狀的QTL定位結(jié)果

正常灌水條件下檢測到的5個QTL位點(diǎn)中，葉片相對電導(dǎo)率、葉綠素含量、葉面積、葉片相對含水量和根長各檢測到一個QTL位點(diǎn)。位于第16連鎖群上與葉片相對電導(dǎo)率緊密關(guān)聯(lián)的qCCn-16-1位點(diǎn)LOD值最大，為4.271，表型貢獻(xiàn)率為5.765%；第5連鎖群上與葉綠素含量緊密相關(guān)的qLRCn-5-1位點(diǎn)表型貢獻(xiàn)率最大，為7.547%。

干旱脅迫條件下檢測到的6個QTL位點(diǎn)中，葉片相對含水量檢測到2個位點(diǎn)，葉片相對電導(dǎo)率、葉綠素含量、葉面積和根長各1個QTL位點(diǎn)。位于第8連鎖群上與葉面積緊密相關(guān)的qLA-8-1的位點(diǎn)表型貢獻(xiàn)率最大，為6.705%；位于第16連鎖群上與葉綠素含量緊密相關(guān)的QTL位點(diǎn)LOD值最大，為4.204。

2.3 與干旱相關(guān)的候選基因

本研究將檢測到的位點(diǎn)對應(yīng)的QTL區(qū)間序列與NCBI上發(fā)表的向日葵基因組[21]進(jìn)行比對，利用GOG、GO、KEGG、NR等數(shù)據(jù)庫對候選基因進(jìn)行基因功能注釋。COG(同源蛋白簇)主要注釋到以下幾條：3條參與翻譯后修飾、蛋白質(zhì)更新、伴侶；1條參與脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝；5條參與無機(jī)離子的運(yùn)輸與代謝；3條參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；1條參與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生；1條參與防御機(jī)制；1條參與復(fù)制、重組和修復(fù)；1條參與次生代謝產(chǎn)物的生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝；3條參與碳水化合物的運(yùn)輸和代謝；1條參與輔酶的運(yùn)輸和代謝。在兩種水分條件下，共注釋和篩選到62個重要的候選基因，候選基因位于3個連鎖群(8、13、16)的3個QTL內(nèi)，與3個性狀(葉片相對電導(dǎo)率、葉面積、葉綠素)相關(guān)(表5)。

表5 與干旱脅迫相關(guān)的重要候選基因

續(xù)表5 Continued Table 5

基于基因功能注釋，發(fā)現(xiàn)許多基因與干旱脅迫有關(guān)。位于8號染色體上的QTL qLA-8-1區(qū)間內(nèi)的候選基因rna22964編碼熱擊蛋白90-5，該基因參與翻譯后修飾和蛋白質(zhì)更新；rna23294編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子2；rna22215編碼細(xì)胞色素P450 90A1；rna23271編碼細(xì)胞色素P450 82G1；rna23019和rna23004均編碼乙烯反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子RAP2-7；rna22100編碼E3泛素蛋白連接酶RHC2A；rna22868編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子26；rna22783編碼水通道蛋白TIP2-1，參與碳水化合物的運(yùn)輸和代謝；rna22224編碼脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3；rna22878編碼細(xì)胞色素P450 71A1；rna22577編碼小熱激蛋白；rna22661和rna22193分別編碼脫落酸受體PYL2和PYL4；rna22948編碼ABC運(yùn)輸者G家庭成員31。位于13號染色體上與葉綠素含量緊密關(guān)聯(lián)的QTL位點(diǎn)qCC-13-1區(qū)間內(nèi)的候選基因rna40140編碼水通道蛋白TIP4;1，參與碳水化合物的運(yùn)輸和代謝；rna40077編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G家庭成員15，該基因參與防御機(jī)制。位于16號染色體上的QTL位點(diǎn)qCCn-16-1的區(qū)間內(nèi)的候選基因rna49909編碼光調(diào)節(jié)蛋白。

3 討 論

3.1 表型性狀分析

作物抗旱性是一種綜合性狀，單一指標(biāo)往往不具有代表性。因?yàn)樗袉蝹€抗旱的生物學(xué)過程最終都將反映在植物生長及其最終產(chǎn)品(產(chǎn)量)上[22]，因此，選擇多個指標(biāo)來綜合評價(jià)作物的抗旱性才較為客觀。本研究選取了5個與向日葵抗旱相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行QTL定位；干旱脅迫下，K58所有性狀均高于K55，說明K58具有較強(qiáng)抗旱性。此外，本研究利用5個與抗旱相關(guān)的性狀對RIL群體進(jìn)行抗旱性評價(jià)，但是有些性狀間相關(guān)性不大，這可能是試驗(yàn)誤差造成的。由表2可以發(fā)現(xiàn)，兩種水分條件下葉片相對電導(dǎo)率與葉綠素含量均呈極顯著正相關(guān)，且干旱脅迫下，相關(guān)系數(shù)增大，說明二者與干旱脅迫具有密切的關(guān)系，因此認(rèn)為這兩個指標(biāo)是衡量向日葵干旱脅迫的重要指標(biāo)，這與張海燕等[23]在甘薯中的研究結(jié)論一致。

3.2 油葵抗旱性的遺傳基礎(chǔ)和QTL

近幾十年中，QTL定位是植物數(shù)量性狀位點(diǎn)挖掘中十分重要的方法之一，并且已經(jīng)開發(fā)了多種遺傳結(jié)構(gòu)不同的群體進(jìn)行定位。RIL是永久性分離群體，故常作為 QTL定位群體[24]。在本研究中，對RIL群體進(jìn)行表型分析，并在正常澆水和干旱脅迫兩種條件下對油葵苗期的5個抗旱相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位，共檢測到油葵5條染色體上與抗旱相關(guān)的11個QTL位點(diǎn)。位于8號染色體上與葉面積緊密相關(guān)的2個位點(diǎn)qLAn-8-1和qLA-8-1在兩種水分條件下被重復(fù)檢測到，表明所檢測到的QTL是穩(wěn)定的。尚未定位到與前人研究一致的抗旱相關(guān)性狀的QTL位點(diǎn)。本研究在干旱條件下于5號染色體檢測到與葉片相對含水量相關(guān)的QTL，HERVé等[14]于5號染色體上也定位到了控制葉片含水量相關(guān)的1個QTL位點(diǎn)。Nishtman ABDI等[15]在正常澆水和干旱條件下分別在16號染色體上定位到控制葉綠素含量1個和2個QTL，而本研究也在正常澆水條件下也于16號染色體上檢測到1個控制葉綠素含量的QTL，這2個性狀雖然與前人研究定位到同一個染色體上，但物理位置卻不相同，QTL標(biāo)記區(qū)間的差異可能是由于圖譜之間的標(biāo)記種類和密度不一致所造成的。此外，qLRWC-5-1、qLRWC-5-2和qLRCn-5-1均定位于5號染色體上；qLRC-16-1和qCCn-16-1均定位于16號染色體上，qLRWCn-17-1和qRL-17-1均定位于17號染色體上，這些QTL之間雖然控制著不同的性狀，但是卻定位到同一染色體上，這些結(jié)果從各性狀間的相關(guān)分析中也可以看出，兩種水分條件下葉片相對電導(dǎo)率與葉綠素含量均呈極顯著正相關(guān)；正常澆水條件下葉片相對電導(dǎo)率與葉片相對含水量呈顯著性負(fù)相關(guān)，由此也可以看出相關(guān)性較高的性狀間，可能是由同一染色體調(diào)控的，且該結(jié)果與Nishtman等利用RIL群體在水分脅迫下獲得的結(jié)果一致[15]。

3.3 候選基因

從大量候選基因中選擇重要的候選基因往往是一項(xiàng)困難的任務(wù)，然而，QTL信息和基因表達(dá)變異的整合是一種常見策略[25-26]。在此基礎(chǔ)上本研究推測了一些可能與干旱脅迫密切相關(guān)的重要候選基因。位于8號染色體上與葉面積緊密關(guān)聯(lián)的QTL位點(diǎn)上注釋到的rna23019和rna23004均編碼乙烯反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子RAP2-7；Somayeh Najaf等[27]對向日葵的AP2/ERF基因進(jìn)行全基因組識別后，選取9個AP2/ERF基因，通過qPCR驗(yàn)證所選基因在不同非生物脅迫條件下葉片和根組織中的表達(dá)情況證實(shí)AP2/ERFs基因能有效抵抗非生物脅迫。rna22661和rna22193分別編碼脫落酸受體PYL2和PYL4；已知PLY參與ABA響應(yīng)干旱脅迫的信號傳導(dǎo)過程[28]。研究發(fā)現(xiàn)ABA受體PYL4先前被檢測到參與了植物對各種脅迫的響應(yīng)。過表達(dá)TaPYL4可以提高小麥的抗旱性[29]。rna23294編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子2，研究發(fā)現(xiàn)CsWRKY2參與了茶樹的干旱脅迫，當(dāng)使用外源ABA后CsWRKY2的表達(dá)得到了增強(qiáng)，當(dāng)使用ABA合成抑制劑時(shí)，CsWRKY2的表達(dá)受損[30]。另外，ThWRKY2可在干旱脅迫下啟動ThERF1(乙烯響應(yīng)因子)基因的表達(dá)，該基因編碼一種新的乙烯響應(yīng)因子，并且對干旱脅迫在內(nèi)的非生物脅迫進(jìn)行負(fù)調(diào)控。在芥菜中過表達(dá)ThERF1增加了植物的蒸騰速率，導(dǎo)致植物對干旱脅迫更敏感[26]。rna22783和rna40140分別編碼水通道蛋白TIP2;1和TIP4;1。有研究結(jié)果表明，HvTIP2;1和HvTIP4;1在大麥對干旱脅迫條件的適應(yīng)過程中具有重要作用[31]。另有研究者在水稻中發(fā)現(xiàn)OsTIP2;1在根部強(qiáng)烈表達(dá)，幾乎沒有在葉片中表達(dá)，這說明水通道蛋白調(diào)控生理過程使植物獲得抗旱性可能具有特異性[32-33]。

下一步，我們將開展精細(xì)定位，對這些候選基因進(jìn)行克隆和功能鑒定，并通過群體的擴(kuò)大等途徑，繼續(xù)發(fā)掘與其他性狀相關(guān)的候選基因，為加強(qiáng)向日葵種質(zhì)資源中優(yōu)異基因的深度發(fā)掘和其在育種中的利用奠定基礎(chǔ)。

本研究表明葉片相對電導(dǎo)率和葉綠素含量可以作為向日葵苗期抗旱性評價(jià)的重要指標(biāo)。此外，本研究對向日葵苗期抗旱相關(guān)的5個性狀進(jìn)行QTL定位，于兩種水分條件下共得到11個QTL位點(diǎn)，并對這些位點(diǎn)對應(yīng)的基因組區(qū)域進(jìn)行候選基因的功能注釋，共篩選到62個與干旱脅迫相關(guān)的候選基因，這些基因可作為后期重點(diǎn)研究的對象。