運(yùn)動訓(xùn)練誘導(dǎo)自發(fā)性高血壓大鼠生理性心臟肥大

彭 朋，何瑞波，馬 剛，王大寧，薄 海，秦永生

在20世紀(jì)80年代末之前，臨床醫(yī)師一般建議心力衰竭患者要盡量避免體育鍛煉。然而研究發(fā)現(xiàn)，長期運(yùn)動訓(xùn)練可改善心血管疾病危險因素，如降低血壓水平及胰島素抵抗。Emter等證實，低強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練顯著延遲自發(fā)性高血壓心力衰竭大鼠模型失代償性心力衰竭的發(fā)生，并提高存活率。更為重要的是，上述運(yùn)動的健康效應(yīng)并不依賴于血壓的變化。臨床研究也證實，心力衰竭患者在醫(yī)務(wù)監(jiān)督下進(jìn)行運(yùn)動訓(xùn)練是安全有益的。

心臟肥大是心臟對各種刺激的適應(yīng)性反應(yīng)。病理性刺激，如高血壓和心肌梗死導(dǎo)致病理性心臟肥大，后者作為主要心血管病危險因素之一，是幾乎所有心力衰竭患者預(yù)后不良的體征。然而，長期規(guī)律運(yùn)動訓(xùn)練同樣可誘導(dǎo)心臟肥大，但心功能增強(qiáng)同時不會發(fā)生心力衰竭，該類型稱為生理性心臟肥大(即運(yùn)動員心臟)。本研究旨在探討長期運(yùn)動(游泳)對自發(fā)性高血壓大鼠(spontameacsly hypertensive rats,SHR)心臟肥大的影響并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 30只12周齡SPF級雄性SHR，體重(210±12)g，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)(5只/籠)，12/12 h晝夜交替，自由進(jìn)食水。動物適應(yīng)環(huán)境1周后隨機(jī)分為高血壓運(yùn)動組(SHR-exercise，SHR-Ex)和高血壓對照組(SHR-control，SHR-C)，將15只健康Wistar大鼠作為正常血壓對照組(normotensive control，NC)。SHR-Ex組進(jìn)行8周游泳運(yùn)動，SHR-C組和NC組在鼠籠內(nèi)安靜飼養(yǎng)。動物適應(yīng)1周后開始正式實驗。

1.2 大鼠游泳運(yùn)動方案制定 SHR-Ex大鼠進(jìn)行每天1次、連續(xù)90 min的無負(fù)重游泳運(yùn)動。游泳缸體積為150 cm×60 cm×70 cm，水溫30～32 ℃，水深60 cm，保證每只大鼠有200 cm活動面積以進(jìn)行持續(xù)運(yùn)動。每周訓(xùn)練5 d，共持續(xù)8周。方案參考文獻(xiàn)[6]。

1.3 血壓和心臟超聲測定 末次訓(xùn)練后48 h(避免急性運(yùn)動的影響)，稱重后麻醉動物，采用智能無創(chuàng)血壓測試儀(BP-2010E，日本)測量尾動脈血壓，包括收縮壓(systolic blood pressure，SBP)和舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)。采用7 MHz探頭的二維M型超聲心動圖(Vevo 770，加拿大)對大鼠心臟結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行監(jiān)測，參數(shù)包括：左心室舒張末期直徑(left ventricular end-diastolic diameter LVEDD)、左心室收縮末期直徑(left ventricular end- systolic diameter，LVESD)、左心室壁厚度(left ventricular wall thickness，LVWT)和左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)。

1.4 組織取材 超聲測定后處死大鼠，取出心臟并分離左心室，稱重左心室質(zhì)量(left ventricle weight，LVW)并計算與脛骨長度(tibia length，TL)的比值作為心臟質(zhì)量指數(shù)(left ventricle weight index，LVWI)以評估心臟肥大。心臟分離左心室，沿縱軸將其分為兩份，一份用甲醛溶液固定，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)和Masson染色后進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察，一份投入液氮中并轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱凍存待測分子生物學(xué)指標(biāo)。

1.5 心肌病理學(xué)檢查 取心肌組織，用10%甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、透明、包埋和切片(5 μm)等一系列處理后制作病理組織切片。HE染色和Masson染色后光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯BX51，日本)下選取10個視野，用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量分別獲取心肌細(xì)胞橫截面積(cross-sectional area，CSA)和膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)，其中CVF為膠原面積與所測視野面積的比值。

1.6 Western blot檢測蛋白表達(dá)量 將心臟組織勻漿裂解(4 ℃，20000 g離心30 min)，用考馬斯亮藍(lán)法測定總蛋白含量。取10 μg蛋白樣品經(jīng)15% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，一抗4 ℃孵育過夜，包括心鈉素(atrial natriuretic factor，ANF)、肌球蛋白輕鏈-2(myosin light chain-2，MLC-2)、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶Aβ亞基(calcineurin Aβ，CNAβ)、PI3激酶p110α亞基[PI3-K(p110α)]，磷酸化Akt(p-Akt)。以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗37 ℃孵育1 h，充分洗滌后，使用ECL發(fā)光顯影，X線膠片壓片曝光，掃描各條帶的灰度值，β-actin為內(nèi)參蛋白。以各組與NC組的比值作為蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 實驗過程中，由于拒跑2只、死亡5只，共剔除7只大鼠，死亡原因主要是高血壓大鼠發(fā)生心力衰竭以及運(yùn)動后的感染，最終納入38只，其中NC組15只、SHR-C組12只和SHR-Ex組11只。

2.2 心臟重量以及血壓的比較 與NC組比較，SHR-C組和SHR-Ex組LVW、LVWI、SBP和DBP均升高(<0.05)；與SHR-C組比較，SHR-Ex組LVW和LVWI增加(<0.05)，SBP和DBP的變化無統(tǒng)計學(xué)差異(>0.05，表1)。

2.3 心臟結(jié)構(gòu)與功能的比較 與NC組比較，SHR-C組LVWT升高(<0.05)，LVEDD下降(<0.05)，LVEF的變化無統(tǒng)計學(xué)意義(>0.05)；與SHR-C組比較，SHR-Ex組LVEDD和LVEF增加(<0.05)，LVWT的變化無統(tǒng)計學(xué)意義(>0.05，表2)。三組間LVESD的變化無統(tǒng)計學(xué)意義(>0.05)。

2.4 心肌染色以及各組CSA和CVF的比較 心肌HE染色見圖1，細(xì)胞質(zhì)染成紅色，細(xì)胞核染成藍(lán)色，NC組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常完整、排列規(guī)則有序，SHR-C組心肌細(xì)胞肥大腫脹，排列疏松紊亂，SHR-Ex組心肌細(xì)胞較SHR-C組排列致密有序，病理學(xué)明顯改善。心肌Masson染色見圖2，心肌間質(zhì)膠原纖維染成藍(lán)色，NC組細(xì)胞間質(zhì)僅有極少量膠原纖維，SHR-C組可見明顯心肌間質(zhì)膠原沉積以及心肌纖維化，SHR-Ex組心肌纖維化程度較SHR-C組明顯減輕。與NC組比較，SHR-C組心肌細(xì)胞CSA和CVF升高(<0.05)；與SHR-C組比較，SHR-Ex組心肌細(xì)胞CSA升高(<0.05)，CVF下降(<0.05,表3)。

2.5 心肌胚胎基因表達(dá)的比較 與NC組比較，SHR-C組ANF和MLC-2蛋白表達(dá)量上調(diào)(<0.05)；與SHR-C組比較，SHR-Ex組ANF和MLC-2蛋白表達(dá)量下調(diào)(<0.05,表4)。

2.6 心臟肥大信號途徑蛋白表達(dá)的比較 與NC組比較，SHR-C組CNAβ、PI3-K(p110α)和p-Akt蛋白表達(dá)量上調(diào)(<0.05)，提示病理性心臟肥大與CNAβ和PI3-K(p110α)/p-Akt兩條信號通路激活均有關(guān)聯(lián)；與SHR-C組比較，SHR-Ex組CNAβ蛋白表達(dá)量下調(diào)(<0.05)，PI3-K(p110α)和p-Akt的變化無統(tǒng)計學(xué)意義，說明運(yùn)動在不干擾PI3-K/Akt信號通路的情況下抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶過表達(dá)(圖3，表5)。

3 討 論

本研究采用壓力超負(fù)荷致心肌病理損傷的實驗?zāi)Ｐ?，探討耐力?xùn)練(游泳)對心肌的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長期運(yùn)動訓(xùn)練能夠從結(jié)構(gòu)、分子和功能水平上誘導(dǎo)高血壓引起的病理性心臟肥大向生理性心臟肥大轉(zhuǎn)化，這一作用至少發(fā)生在高血壓心力衰竭代償期。Emter等以心力衰竭大鼠為研究對象并得到相似的結(jié)論，即低強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練誘導(dǎo)心臟出現(xiàn)有益適應(yīng)并可延緩SHR失代償性心力衰竭的發(fā)生。但過度運(yùn)動則可對心臟重塑和心功能產(chǎn)生不利影響。普遍認(rèn)為，運(yùn)動訓(xùn)練有助于保護(hù)個體免受各種心血管疾病的侵襲，但生物學(xué)機(jī)制尚未完全清楚。值得注意的是，在本研究中，耐力訓(xùn)練在不改變血壓水平的情況下發(fā)揮了心臟保護(hù)作用，這與之前的多項報道一致。

壓力超負(fù)荷與耐力訓(xùn)練引起的心臟肥大在心臟結(jié)構(gòu)和功能水平上截然不同。病理性心臟肥大的特征是心肌纖維化、血管形成減少、細(xì)胞凋亡增加、胚胎基因重新表達(dá)、代謝(尤其是脂肪酸代謝)基因表達(dá)下調(diào)、左心室功能障礙及病死率增高。生理性和病理性心臟肥大均存在心臟幾何結(jié)構(gòu)的改變，壓力超負(fù)荷常發(fā)生向心性肥大(心室壁增厚，心腔縮窄)，而容量超負(fù)荷則表現(xiàn)為離心性肥大(心室壁與心腔成比例增加)。耐力訓(xùn)練如長跑或游泳一般誘導(dǎo)心臟離心性肥大。盡管生理性和病理性心臟肥大之間的差異得到廣泛證實，但這兩種形式的肥大是否由細(xì)胞內(nèi)不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起尚不清楚。由于病理性心臟肥大的刺激通常是慢性的，而生理性心臟肥大的刺激則是間歇性的，因此刺激的持續(xù)時間被認(rèn)為是決定心肌表型的關(guān)鍵。但在Perrino等設(shè)計的間歇性壓力超負(fù)荷小鼠模型中證實，決定心臟肥大類型的主要因素是觸發(fā)和激活的細(xì)胞內(nèi)信號通路的種類，而非持續(xù)時間。

目前，在生理性和病理性心臟肥大中發(fā)揮不同作用的2個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已被確定，分別是PI3-K/Akt通路和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路。本研究結(jié)果證實，耐力訓(xùn)練能夠在不干擾PI3-K/Akt通路的情況下恢復(fù)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性。由于鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶介導(dǎo)病理性而非生理性心臟肥大，因此推測長期運(yùn)動訓(xùn)練通過抑制病理性心臟肥大信號途徑改善SHR心臟重塑。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是一種鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，可使活化T細(xì)胞核因子(calcineurin/nuclear factor of activation T cell，NFAT)去磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位并上調(diào)心臟促肥大基因和胚胎基因表達(dá)。心肌過度表達(dá)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶或NFAT3的轉(zhuǎn)基因小鼠易發(fā)生心肌梗死，并迅速發(fā)展為心力衰竭。相反，CNAβ缺陷小鼠對病理性刺激如壓力超負(fù)荷、血管緊張素Ⅱ灌注產(chǎn)生肥大反應(yīng)的能力明顯受損。PI3-K/Akt途徑是參與出生后心臟正常生長的主要信號通路之一，其上調(diào)已被證實可誘導(dǎo)生理性和病理性心臟肥大。心臟肥大表型與Akt上調(diào)的程度有關(guān)，過度刺激該通路將導(dǎo)致病理性心臟肥大。此外，PI3-K/Akt通路通過在多種機(jī)制抑制凋亡并促進(jìn)細(xì)胞存活。本研究發(fā)現(xiàn)，耐力訓(xùn)練僅下調(diào)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶介導(dǎo)的信號途徑，而對PI3-K/Akt通路并未產(chǎn)生作用，提示運(yùn)動訓(xùn)練是病理性心臟肥大安全有效的防治策略。

胚胎基因(ANF、MLC-2)是胚胎時期心臟表達(dá)的、進(jìn)入成年后則處于靜止?fàn)顟B(tài)的基因。臨床研究證實，循環(huán)ANF水平增加與心力衰竭的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。由于胚胎基因表達(dá)的胎兒型蛋白質(zhì)功能低下，因而造成心臟表型由成熟的“收縮狀態(tài)”向“胚胎型合成狀態(tài)”轉(zhuǎn)變，繼之造成病理性心臟肥大。在本研究中，游泳訓(xùn)練使ANF、MLC-2蛋白表達(dá)量得以下調(diào)，提示運(yùn)動訓(xùn)練有可能通過下調(diào)胚胎基因表達(dá)抑制病理性心臟肥大，這對于恢復(fù)SHR受損的心功能具有重要作用。

綜上所述，長期運(yùn)動訓(xùn)練能夠促進(jìn)SHR病理性心臟肥大向生理性心臟肥大轉(zhuǎn)變，其機(jī)制可能與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號途徑活性下調(diào)及胚胎基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)。