Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化蒲公英中菊苣酸的超聲提取工藝

程 雷，李梓欣，劉傳富，張 萬(wàn)，郝夢(mèng)帥，李 峰

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)為菊科多年生草本植物，性寒，味苦，具有清熱解表、健胃消炎、消腫散結(jié)、利尿等功效，常用于治療感冒發(fā)熱、喉嚨腫痛、尿路感染等癥[1-2]。研究表明，蒲公英具有抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖、增強(qiáng)免疫力等多種藥理作用[3]。蒲公英全草富含酚酸類、多糖類、黃酮類、甾醇類等多種化學(xué)成分，其花、葉和根中所含的酚酸類成分主要是菊苣酸(chicoric acid)和單咖啡酰酒石酸[4]。其中，菊苣酸作為一種重要的生物活性成分，具有抗病毒、調(diào)血脂、清除自由基、降血糖等藥理作用[5]。菊苣酸可經(jīng)化學(xué)合成制得[6]，也可從天然產(chǎn)物中提取分離獲得。文獻(xiàn)[7]報(bào)道，用于提取菊苣酸的天然植物主要是菊苣和紫錐菊，提取方法主要采用超聲波法和加熱回流法。超聲波法具有提取溫度低、高效快速、提取時(shí)間短、穿透力強(qiáng)、提取率高等特點(diǎn)，與加熱回流法相比具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，適用于提取對(duì)熱不穩(wěn)定的生物活性成分[8]。

目前，以蒲公英為原料提取菊苣酸的研究鮮有報(bào)道。菊苣酸對(duì)熱不穩(wěn)定[9]，鑒于此，作者采用超聲波法提取蒲公英中菊苣酸，通過(guò)HPLC法測(cè)定蒲公英中菊苣酸含量，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化蒲公英中菊苣酸的超聲提取工藝，為蒲公英資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

蒲公英干燥全草,購(gòu)自山西，由山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李峰教授鑒定為菊科植物蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)。蒲公英干燥全草經(jīng)粉碎機(jī)粉碎,過(guò)40目篩，備用。

菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)Y02J12Y136139，純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；乙腈、磷酸,色譜純；無(wú)水乙醇、甲醇,分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

Agilent 1260 Infinity型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；FW-80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；FA2004B型電子天平，上海天美天平儀器有限公司；CPA 2250型電子分析天平，德國(guó)賽多利斯公司；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司。

1.2 蒲公英中菊苣酸含量的測(cè)定

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取6 mg菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)品，用80%甲醇溶解后，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，混勻，即得濃度為600 μg·mL-1的菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 供試溶液的制備

精密稱取0.5 g蒲公英粉末于50 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL 50%乙醇，稱重，在超聲溫度為50 ℃、超聲功率為300 W的條件下超聲提取50 min；冷卻至室溫，再次稱重，并補(bǔ)足失重，混勻，抽濾，所得濾液即為供試溶液。

1.2.3 色譜條件

ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫35 ℃；流動(dòng)相為0.2%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～10 min，90%～78%A；10～14 min，78%～60%A；14～16 min，60%A；16～17 min，60%～90%A)；流速1.5 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm；進(jìn)樣量5 μL。

菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試溶液的HPLC圖譜見(jiàn)圖1。

1.3 蒲公英中菊苣酸的提取工藝優(yōu)化

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

分別考察乙醇和甲醇體積分?jǐn)?shù)(30%、40%、50%、60%、70%、80%)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，mL∶g，下同)、提取時(shí)間(30 min、40 min、50 min、60 min、70 min)、超聲功率(200 W、300 W、400 W、500 W)對(duì)蒲公英中菊苣酸提取率的影響。按下式計(jì)算蒲公英中菊苣酸提取率：

式中：c為提取液中菊苣酸濃度,μg·mL-1；V為提取液體積，mL；m為蒲公英粉末質(zhì)量，g；M為蒲公英中菊苣酸的含量，mg·g-1。

1.3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)蒲公英中菊苣酸提取率影響較大的液料比(A)、提取時(shí)間(B)、超聲功率(C)為考察因素，以菊苣酸提取率(Y)為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 菊苣酸含量測(cè)定的方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系

分別精密吸取0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、0.9 mL菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于1 mL容量瓶中，加入80%甲醇定容至刻度，混勻，按1.2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)、菊苣酸濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得線性方程為y=14.75x-318.5，R2=0.9996。表明，菊苣酸濃度在60～540 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度

取供試溶液，按1.2.3色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次。測(cè)得菊苣酸峰面積的RSD值為0.98%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性

取同一供試溶液8份，分別放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h，按1.2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)得菊苣酸峰面積的RSD值為0.25%，表明24 h內(nèi)菊苣酸的穩(wěn)定性良好。

2.1.4 重復(fù)性

平行配制6份供試溶液，分別按1.2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)得菊苣酸峰面積的RSD值為0.44%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.5 加標(biāo)回收率

精密稱取適量菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)品，用50%乙醇超聲輔助溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，混勻，按1.2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得到濃度為456.35 μg·mL-1的菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱定0.25 g菊苣酸含量已知的蒲公英粉末6份于50 mL具塞錐形瓶中，分別加入2 mL菊苣酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、8 mL 50%乙醇，按1.2.2條件超聲提取，平行制備供試溶液，按1.2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)得菊苣酸的平均加標(biāo)回收率為104.6%，RSD值為1.73%。

2.1.6 蒲公英中菊苣酸含量的測(cè)定

取同一批次的蒲公英藥材，按1.2.2條件平行制備6份供試溶液，按1.2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。通過(guò)外標(biāo)法計(jì)算得到蒲公英中菊苣酸含量為7.438 2 mg·g-1。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 醇體積分?jǐn)?shù)的影響

精密稱取12份5 g蒲公英粉末于250 mL具塞錐形瓶中，分別加入一定量不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇和甲醇，在超聲溫度為50 ℃、液料比為20∶1、超聲功率為200 W的條件下超聲提取30 min，考察醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菊苣酸提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇和甲醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)菊苣酸提取率的影響

由圖2可知，隨著醇體積分?jǐn)?shù)的增大，菊苣酸提取率整體逐漸升高；當(dāng)醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，菊苣酸提取率最高；當(dāng)醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時(shí)，菊苣酸提取率降低。原因可能是，菊苣酸的分子結(jié)構(gòu)中含有羧基和較多酚羥基，在植物體中易形成鹽，菊苣酸鹽在高濃度的醇溶液中溶解度降低，導(dǎo)致菊苣酸提取率降低。通過(guò)比較不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇和甲醇對(duì)菊苣酸提取率的影響，同時(shí)考慮到甲醇具有毒性，確定較適宜的提取溶劑為50%乙醇。

2.2.2 液料比的影響

精密稱取5份5 g蒲公英粉末于250 mL具塞錐形瓶中，分別按液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1加入50%乙醇，在超聲溫度為50 ℃、超聲功率為200 W、提取時(shí)間為30 min的條件下提取，考察液料比對(duì)菊苣酸提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 液料比對(duì)菊苣酸提取率的影響

由圖3可知，隨著液料比的增大，即提取溶劑乙醇用量的增加，菊苣酸提取率逐漸升高，當(dāng)液料比為50∶1時(shí)，菊苣酸提取率最高。這是由于，增加提取溶劑用量可以提高細(xì)胞內(nèi)外菊苣酸的濃度差，更有利于菊苣酸分子在溶液中擴(kuò)散，使得菊苣酸的溶出量增加，進(jìn)而提高菊苣酸提取率。當(dāng)液料比由40∶1增大到50∶1時(shí)，菊苣酸提取率的升幅不明顯，為了節(jié)約提取溶劑，確定較適宜的液料比為40∶1。

2.2.3 提取時(shí)間的影響

精密稱取5份5 g蒲公英粉末于250 mL具塞錐形瓶中，按液料比30∶1加入50%乙醇，在超聲溫度為50 ℃、超聲功率為200 W的條件下分別超聲提取30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，考察提取時(shí)間對(duì)菊苣酸提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)菊苣酸提取率的影響

由圖4可知，提取時(shí)間在30～40 min范圍內(nèi)時(shí)，菊苣酸提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，菊苣酸提取率最高；而在40～50 min范圍內(nèi)時(shí)，菊苣酸提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。可能是由于，菊苣酸在溶液中不穩(wěn)定[9]，部分發(fā)生降解所致。在50 min后，菊苣酸提取率緩慢回升，可能是由于，提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，菊苣酸的溶出速率大于降解速率，溶出量增加。因此，確定較適宜的提取時(shí)間為40 min。

2.2.4 超聲功率的影響

精密稱取4份5 g蒲公英粉末于250 mL具塞錐形瓶中，按液料比30∶1加入50%乙醇，在超聲溫度為50 ℃、提取時(shí)間為40 min、超聲功率分別為200 W、300 W、400 W、500 W的條件下提取，考察超聲功率對(duì)菊苣酸提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，隨著超聲功率的增大，菊苣酸提取率逐漸升高；當(dāng)超聲功率超過(guò)400 W時(shí)，菊苣酸提取率的升幅趨緩；當(dāng)超聲功率為500 W時(shí)，菊苣酸提取率最高。原因可能是，超聲功率增大，超聲波的空化作用和機(jī)械作用增強(qiáng)，使得植物細(xì)胞壁的破裂程度提高，從而加速了菊苣酸的溶出?？紤]到降低能耗，確定較適宜的超聲功率為400 W。

圖5 超聲功率對(duì)菊苣酸提取率的影響

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(表1)

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3.2 回歸模型的建立與方差分析

通過(guò)對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得到二次多項(xiàng)式回歸方程為：Y=92.96+5.47A+1.12B-3.20C-0.12AB+1.65AC+0.47BC-1.81A2-1.57B2-5.70C2。

回歸模型的方差分析見(jiàn)表2。

表2 回歸模型的方差分析

一次項(xiàng)A、C，二次項(xiàng)C2對(duì)菊苣酸提取率的影響極顯著，一次項(xiàng)B，交互項(xiàng)AB、AC、BC，二次項(xiàng)A2、B2的影響均不顯著。通過(guò)比較F值的大小可判斷[10]，各因素對(duì)菊苣酸提取率的影響大小為：液料比(A)>超聲功率(C)>提取時(shí)間(B)。

2.3.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖可直觀地反映交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，響應(yīng)曲面越陡峭，說(shuō)明交互作用對(duì)菊苣酸提取率的影響越顯著[11]。各因素交互作用對(duì)菊苣酸提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線見(jiàn)圖6。

由圖6可知，交互作用影響菊苣酸提取率的順序?yàn)锳C>BC>AB，符合方差分析中F值的判斷結(jié)果。

圖6 各因素交互作用對(duì)菊苣酸提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

2.3.4 回歸模型的優(yōu)化

由于不顯著項(xiàng)對(duì)回歸模型的影響有時(shí)會(huì)干擾模型對(duì)響應(yīng)值的擬合，導(dǎo)致模型出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象，因此通過(guò)忽略交互項(xiàng)AB、AC、BC以及二次項(xiàng)B2對(duì)模型的影響，降低模型的復(fù)雜度。優(yōu)化后的回歸方程為：Y=92.30+5.47A+1.12B-3.20C-1.89A2-5.78C2。

優(yōu)化后回歸模型的方差分析見(jiàn)表3。

表3 優(yōu)化后回歸模型的方差分析

2.3.5 最佳提取工藝的確定及驗(yàn)證

經(jīng)優(yōu)化后回歸模型分析得出的最佳提取工藝為：液料比40∶1、提取時(shí)間50 min、超聲功率272.26 W，在此條件下，菊苣酸提取率的理論值為97.4368%。考慮到實(shí)際可操作性，將最佳提取工藝修正為：液料比40∶1、提取時(shí)間50 min、超聲功率300 W。經(jīng)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到菊苣酸平均提取率為95.34%，與理論值的相對(duì)誤差為2.15%，表明優(yōu)化后的回歸模型有較好的預(yù)測(cè)性能，優(yōu)化得到的提取工藝穩(wěn)定可靠，可用于蒲公英中菊苣酸的提取。

3 結(jié)論

以醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、超聲功率為考察因素，以蒲公英中菊苣酸提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化蒲公英中菊苣酸的超聲提取工藝。確定最佳提取工藝為：以50%乙醇為提取溶劑、液料比40∶1(mL∶g)、提取時(shí)間50 min、超聲功率300 W，在此條件下，蒲公英中菊苣酸提取率為95.34%。