固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飛燕草中7種生物堿

樊輕亞， 許衛(wèi)軍

(信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，河南信陽(yáng) 464000)

飛燕草(Consolidaajacis(L.) Schur)為毛茛科飛燕草屬草本植物，又名百部草、魚燈蘇。在我國(guó)山西、江西、廣西、陜西、浙江、河南、福建等地均有生長(zhǎng)，全草可供藥用，具有祛風(fēng)、理濕、止痛、止咳化痰等功效，《植物名實(shí)圖考》、《中華本草》、《中國(guó)藥植圖鑒》、《浙江天目山植志》等均有記載。飛燕草植物中主要有效成分是生物堿類物質(zhì)，約占1%，具有抗菌、肌松及解痙作用等[1]。張偉等研究發(fā)現(xiàn)飛燕草總堿是一種競(jìng)爭(zhēng)性肌肉松弛劑，對(duì)兔、犬的橫紋肌肉有明顯的松弛作用，可用于多動(dòng)癥、肌緊張等疾病[2]。

生物堿的分離純化方法多為液-液萃取和固液萃取等方法，但這些傳統(tǒng)的方法具有操作過(guò)程繁瑣、有機(jī)溶劑用量大、殘留多、經(jīng)濟(jì)成本比較高、對(duì)環(huán)境有一定的污染等缺點(diǎn)。而固相萃取法操作簡(jiǎn)單，無(wú)兩相分離的繁瑣操作；萃取時(shí)間短，選擇性高，能萃取小體積待測(cè)樣品且不改變樣品生物活性；富集倍數(shù)高且有較高的回收率；有機(jī)溶劑消耗少、殘留低，環(huán)境污染小，符合綠色化學(xué)的概念，在食品、醫(yī)藥化工等農(nóng)藥殘留及痕量檢測(cè)等領(lǐng)域得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[3 - 9]。目前，固相萃取用于中草藥有效成分分離純化方面的研究也有一些報(bào)道[10 - 13]，但在藥用飛燕草的萃取分離等方面尚未見(jiàn)相關(guān)的報(bào)道。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)與傳統(tǒng)HPLC法相比，具有速度快、靈敏度高、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[14 - 18]。本實(shí)驗(yàn)采用PCX固相萃取小柱凈化樣品中生物堿成分，并與UPLC-MS/MS聯(lián)用測(cè)定飛燕草中7種生物堿的含量。該方法簡(jiǎn)單快速、凈化效果好、選擇性好、靈敏度和精密度高，可快速檢測(cè)飛燕草中7種生物堿的含量，為飛燕草的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

美國(guó)Waters Xevo TQ-MS型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源。

洋翠雀堿、翠雀索靈堿、洋翠雀枯生堿、巴比翠雀堿、洋翠雀定堿、洋翠雀康寧、翠雀胺標(biāo)準(zhǔn)品(成都普菲德，純度>98%)；固相萃取柱：C18柱(Waters，500 mg/3mL)，HLB柱(Waters，200 mg/6mL)，PCX柱(上海楚定分析儀器，60 mg/3mL)，SCX柱(上海楚定分析儀器，60 mg/3mL)；甲醇、乙腈(色譜純，德國(guó)默克)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

實(shí)驗(yàn)用飛燕草藥材均購(gòu)于網(wǎng)絡(luò)藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為飛燕草(Consolidaajacis(L.) Schur)全草。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品提取實(shí)驗(yàn)稱取一定量的100目飛燕草粉末于提取容器中，按照1∶60的料液比加入乙醇提取60 min，提取液在60 ℃下?lián)]干后，用甲醇定容至5 mL，用稀HCl調(diào)節(jié)pH值為6，備用。

1.2.2 固相萃取依次用5 mL甲醇、5 mL水潤(rùn)洗PCX固相萃取小柱，隨后取上述濃縮液至柱上，流速為1.0 mL/min，待樣品流干之再后加入5 mL水進(jìn)行淋洗，然后抽真空吹干，用5 mL的3%氨水甲醇溶液洗脫P(yáng)CX小柱，收集洗脫液，N2吹濃縮至干，用UPLC流動(dòng)相進(jìn)行溶解，用UPLC-MS/MS法測(cè)定。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備精密稱取7種對(duì)照品(洋翠雀堿、翠雀索靈堿、洋翠雀枯生堿、巴比翠雀堿、洋翠雀定堿、洋翠雀康寧、翠雀胺)各10.0 mg，分別用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 mg/mL的儲(chǔ)備溶液。然后精密吸取7種儲(chǔ)備溶液各1 mL，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，即得0.1mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.3 樣品分析條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BHE C18柱(50 mm×2.1 mm×1.7 μm，美國(guó)Waters公司)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.2% NH4Ac(B)，梯度洗脫程序:0～2 min，2%～15%A；2～8 min，15%～50%A；8～12 min，50%～80%A；12～15 min，80%～2%A；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：3 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子模式；離子源溫度：130 ℃；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣(N2)流速：9.0 L/min；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；錐孔氣流量：50 L/h；碰撞氣流量：2.5 L/h。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

提取溶劑的選擇既取決于被提取物質(zhì)的性質(zhì)，還和物質(zhì)的介電性質(zhì)與溶劑的差異性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)分別以乙酸乙酯、甲醇、三氯甲烷、乙醇和正戊烷作為溶劑，以7種生物堿作為提取目標(biāo)物，研究了不同溶劑對(duì)提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同溶劑對(duì)生物堿提取率的影響Fig.1 Effect of different solvents on the extraction efficiency of alkaloids

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在非極性溶劑正戊烷中檢測(cè)不到7種生物堿組分，而在極性稍弱的溶劑乙酸乙酯和三氯甲烷中則提取效果較差，提取后其它雜質(zhì)成分較多，后續(xù)操作的干擾問(wèn)題較多。在極性較強(qiáng)的溶劑甲醇、乙醇中7種生物堿的提取率較高，這是因?yàn)轱w燕草生物堿中含有叔胺氮和羥基，這些基團(tuán)都具有一定的極性，因此選擇極性較強(qiáng)的溶劑有利于這些組分的溶解和釋放。乙醇和甲醇的提取率相差不大，但是乙醇無(wú)毒，并且價(jià)格便宜，因此本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇作為提取溶劑。

2.2 固相萃取體系的篩選及萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 固相萃取柱的選擇飛燕草成分復(fù)雜，不僅含有生物堿，還含有固定油、脂類、苷類等多種物質(zhì)。這些成分不僅會(huì)干擾待測(cè)物質(zhì)的分析測(cè)定，而且會(huì)對(duì)檢測(cè)儀器和色譜柱造成一定的損害。因此本文分別考察了C18柱、PCX柱、SCX柱、HLB柱等4種固相萃取柱對(duì)于飛燕草中生物堿類化合物的前處理凈化能力。以回收率作為評(píng)價(jià)的指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，選用C18柱及HBL柱時(shí)，各種生物堿的回收率較低，且洗脫液難以濃縮。這是因?yàn)橐怨枘z鍵合的C18小柱和聚合物基質(zhì)的HLB小柱都是非極性反相萃取吸附小柱，其主要用來(lái)吸附提取物中的非極性目標(biāo)物，極性越大的物質(zhì)則在柱上被吸附的越少，所以對(duì)具有一定極性的7種生物堿的回收率偏低；選用SCX柱時(shí)，7種生物堿成分回收率大概在50%～70%；選用PCX柱時(shí)，7種物質(zhì)的回收率均能達(dá)到80%以上，且萃取速度較快。PCX柱萃取回收率比SCX柱高，因此本文采用PCX固相萃取柱進(jìn)行樣品前處理。

圖2 4種固相萃取柱的提取效率Fig.2 Extraction efficiency of 4 kinds of SPE cartridges for alkaloids

2.2.2 洗脫溶劑的選擇及優(yōu)化在SPE中洗脫是關(guān)鍵步驟，本實(shí)驗(yàn)分別以乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、甲醇、3%的氨水甲醇作為洗脫溶劑，研究其對(duì)7種生物堿回收率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：乙醚的洗脫液中無(wú)生物堿成分，可能是因?yàn)橐颐训臉O性過(guò)低，對(duì)幾種生物堿的洗脫不利；乙酸乙酯和正丁醇洗脫液中僅含有少數(shù)生物堿成分，且回收率較低；在乙醇和甲醇洗脫液中，均含有7種生物堿成分，但乙醇洗脫液中還含有較多雜質(zhì)，甲醇洗脫后回收率較高。在甲醇中加入一定比例的氨水進(jìn)行洗脫，結(jié)果顯示含有3%氨水的甲醇比純甲醇的洗脫能力更強(qiáng)，這是由于生物堿在植物細(xì)胞中大部分以鹽的形態(tài)存在，加入氨水使得生物堿游離為分子狀態(tài)，有利于溶解于有機(jī)溶劑中，大部分生物堿成分的回收率都能達(dá)到較高水平。實(shí)驗(yàn)選擇3%氨水甲醇溶液為洗脫溶劑。

2.2.3 上樣液pH值對(duì)固相萃取的影響本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在提取液中加稀HCl或稀氨水調(diào)節(jié)pH值為5～10，考察pH對(duì)萃取率的影響。由圖3可知，pH為6時(shí)，萃取率最大，這與生物堿類物質(zhì)在不同pH下存在的分子結(jié)構(gòu)的類型有關(guān)。由于飛燕草中7種生物堿成分均含有叔胺N，為弱堿性化合物，在酸性條件下，弱堿性物質(zhì)易電離成離子狀態(tài)；當(dāng)pH值為6時(shí)，生物堿完全電離，吸附劑分子之間的相互作用力增大，其在PCX固相萃取柱中的保留增強(qiáng)，有利于雜質(zhì)的分離。而當(dāng)萃取物pH增大至堿性時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)不能完全電離，也不能被吸附劑吸附保留，因此選擇稀HCl調(diào)節(jié)pH值為6比較合適。

圖3 pH值對(duì)萃取率的影響Fig.3 Effect of pH on extraction efficiency1.Delosine;2.Delconsine;3.Ajadine;4.Eldeline;5.Ajaconine;6.Ajacusine;7.Ajacine.

2.3 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.3.1 色譜條件的選擇對(duì)飛燕草固相萃取后提取液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，考察了有機(jī)相溶劑(乙腈、甲醇)中加入不同種類的緩沖液(三乙胺、乙酸銨、氨水等)作為流動(dòng)相時(shí)，對(duì)待測(cè)物的分離效果和對(duì)質(zhì)譜電離的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用乙腈作為色譜分析的流動(dòng)相時(shí)，分離度更好，且能使色譜的分析時(shí)間明顯縮短。在有機(jī)相中添加一定比例的NH4Ac可以使質(zhì)譜電離過(guò)程的離子化程度更高，質(zhì)譜響應(yīng)更強(qiáng)，色譜峰的峰形更好。因此，以乙腈-0.2%NH4Ac溶液為流動(dòng)相，選擇梯度洗脫方式，7種生物堿分離度良好，峰形好、柱效高。實(shí)驗(yàn)所得總離子流色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 飛燕草固相萃取后總離子流(TIC)色譜圖Fig.4 TIC of Consolida ajacis(L.) Schur after SPE 1.Ajacusine；2.Ajacine；3.Ajaconine；4.Delcosine； 5.Delsoline;6.Eldeline；7.Ajadine.

2.3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化和裂解途徑采集全掃描模式下正離子、負(fù)離子信號(hào)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示負(fù)離子模式下幾乎無(wú)質(zhì)譜響應(yīng)，因此選擇響應(yīng)良好的ESI+作為離子化模式，分別找出這7種化合物的[M+H]+，作為準(zhǔn)分子離子峰。母離子需要進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)才能產(chǎn)生子離子，進(jìn)一步優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)中的干燥氣體、干燥器流量、碰撞電壓和錐孔電壓等，選擇兩個(gè)響應(yīng)較強(qiáng)的子離子作為監(jiān)測(cè)碎片離子，選擇響應(yīng)值最大的子離子進(jìn)行定量分析。7種化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 7種生物堿的質(zhì)譜參數(shù)

在ESI+條件下，7種化合物主要發(fā)生側(cè)鏈斷裂，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，可以推測(cè)7種化合物的裂解路徑。除洋翠雀康寧外，其它6種生物堿母核結(jié)構(gòu)相同，這6種生物堿有一個(gè)共同質(zhì)譜斷裂特征，即16位脫甲氧基斷裂；另外翠雀胺、翠雀索靈堿發(fā)生1位羥基的斷裂，在二級(jí)質(zhì)譜圖中可以觀察到很強(qiáng)的[M+H-18]+特征碎片離子；洋翠雀枯生堿、洋翠雀堿和洋翠雀定堿發(fā)生4位酯基的斷裂；巴比翠雀堿發(fā)生6位的脫羧反應(yīng)；洋翠雀康寧發(fā)生羥乙基斷裂和脫水反應(yīng)。7種化合物質(zhì)譜裂解路徑見(jiàn)圖5。

圖5 7種生物堿的二級(jí)質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑Fig.5 Fragmentation pathways of 7 alkaloids compounds

2.4 線性范圍、檢出限與定量限

分別取一定量的7種生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成1、5、10、20、40、80、100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按UPLC-MS/MS測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)檢測(cè)時(shí)得到的色譜峰面積和濃度之間的關(guān)系繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以信噪比(S/N)=3及S/N=10計(jì)算該方法的檢出限和定量限。由表2可知，7種飛燕草生物堿的線性范圍均在1～100 mg/L之間，相關(guān)系數(shù)均在0.982以上，7種生物堿的檢出限為0.02～0.45 mg/L，方法定量限為0.08～1.23 mg/L，表明該方法靈敏度良好。

2.5 回收率與精密度

分別準(zhǔn)確稱取3份樣品，分別添加1、5、10 mg/L三個(gè)濃度水平的7種生物堿的混合對(duì)照品溶液，采用“1.2.1”及“1.2.2”方法進(jìn)行提取和萃取，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了回收率及精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。7種生物堿的加標(biāo)回收率在95.9%～98.1%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.4～2.5%之間，表明所建立的分析方法準(zhǔn)確、可靠，回收率高，精密度良好。

表2 7種生物堿的回歸方程、線性范圍、檢出限、定量限及回收率(n=6)

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

精密稱取6個(gè)產(chǎn)地飛燕草藥材粉末各20 g，按照“1.2.1”和“1.2.2”方法提取及萃取后，然后按1.3方法測(cè)定其含量，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，6個(gè)產(chǎn)地中均檢測(cè)出7種生物堿成分，但6個(gè)產(chǎn)地的飛燕草中各種生物堿含量分布不同，翠雀索靈堿含量最高，洋翠雀康寧、洋翠雀枯生堿在各個(gè)產(chǎn)地中含量相差較大；廣西產(chǎn)地的7種生物堿含量明顯高于其它產(chǎn)地，而江西產(chǎn)地的7種生物堿成分均低于其他省份，這些含量和分布的差別可能和該植物生長(zhǎng)時(shí)所需的溫度與地質(zhì)條件有關(guān)。因此在提取飛燕草中生物堿時(shí)，應(yīng)根據(jù)其組成和含量分布進(jìn)行產(chǎn)地篩選，以利于獲得更高的提取率，降低生產(chǎn)成本。

表3 6個(gè)產(chǎn)地飛燕草藥材中7種生物堿的分析結(jié)果(n=6)

3 結(jié)論

本文將固相萃取技術(shù)應(yīng)用于飛燕草中生物堿的萃取，采用單因素實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化了固相萃取中各因素對(duì)飛燕草中7種生物堿萃取率的影響，并與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法聯(lián)用測(cè)定生物堿含量。該固相萃取法操作簡(jiǎn)單，萃取時(shí)間短，選擇性高，富集性及回收率都較高，是一種具有極大發(fā)展前景的萃取技術(shù)。本文中超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法在保證含量測(cè)定準(zhǔn)確的前提下，可提高分析效率，降低分析成本，凸顯現(xiàn)代環(huán)保的理念，對(duì)后繼藥物活性關(guān)系和品質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用具有重要的研究?jī)r(jià)值。