肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境水體中沙門菌的耐藥性與噬菌體的抑菌作用

張 佳 ， 李情園 ， 董藝博 ， 馬翮斯 ， 章興賾 ， 陳佳鑫 ， 高建帥 ， 苑方重

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/中獸醫(yī)學(xué)院 ， 河北 保定 071001)

目前，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中由于抗生素的頻繁使用與不合理利用，導(dǎo)致沙門菌的耐藥性日益突出，而耐藥沙門菌的嚴(yán)重?cái)U(kuò)散已經(jīng)成為影響畜牧業(yè)與危害人類公共安全的重要問題[1-2]。在肉雞養(yǎng)殖過程中，致病性沙門菌多重耐藥問題更加嚴(yán)重[3-4]。通常情況下，養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)的耐藥沙門菌可以通過污染的水體與土壤快速擴(kuò)散進(jìn)入環(huán)境中并長(zhǎng)時(shí)間存在[4]。本試驗(yàn)通過分離純化宿主為耐藥沙門菌的噬菌體，尋求消除沙門菌耐藥性的可能途徑，為臨床治療與防治耐藥沙門菌問題提供可能的方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌分離與鑒定 腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC14028，由青島綠谷商貿(mào)有限公司提供。試驗(yàn)中分離的耐藥沙門菌株，來自5份水樣，采集自河北省保定市易縣某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)周圍池塘表層水體。將水樣靜置1 h，讓水樣自然沉淀，取上層清樣10 μL，加入10 mL的RV肉湯中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，于37 ℃培養(yǎng)24 h，取菌液劃線接種在SS瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。取中心黑色的光滑圓形單個(gè)菌落，分別劃線接種在SS、MacConkey和HE培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。取SS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特征類似沙門菌的菌株，進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定，根據(jù)結(jié)果選擇符合沙門菌特征的菌株11株，進(jìn)行革蘭染色觀察并保存?zhèn)溆谩?/p>

為進(jìn)一步鑒定11株沙門菌，提取其DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增目的片段為腸炎沙門菌特異性DNA標(biāo)記SdfⅠ，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為333 bp，引物設(shè)計(jì)參考Tennant等[5]的報(bào)道，上游引物：5′-TGTGTTTTATCTGATGCAAGAGG-3′；下游引物：5′-CGTTCTTCTGGTACTTACGATGAC-3′。將本試驗(yàn)分離的沙門菌株分別編號(hào)，按順序暫定編號(hào)為Sal-1、Sal-2…Sal-11。

1.2 噬菌體分離增殖與計(jì)數(shù) 準(zhǔn)備SM緩沖液：NaCl 5.8 g，MgSO4·7H2O 2 g，Tris 6 g，2%明膠5 mL，加雙蒸水800 mL溶解，調(diào)節(jié)至pH=7.5，加雙蒸水定容至1 L，經(jīng)高壓滅菌后室溫放置備用。

廢水中噬菌體的分離與純化采用Luis等[6]報(bào)道的方法，并略做調(diào)整。將分離細(xì)菌的同一批水樣，于4 ℃、6 100 r/min離心10 min，取上清液使用0.22 μm 細(xì)菌濾器過濾，濾液于4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?00 μL上述濾液，加入1 mL預(yù)培養(yǎng)的沙門菌液體培養(yǎng)基中，與3 mL預(yù)熱的上層培養(yǎng)基(含0.4%瓊脂)混合，然后均勻覆蓋在SS平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。檢查噬菌體在細(xì)菌培養(yǎng)基上形成的噬菌斑，挑取形狀清晰的噬菌斑，混溶入SM緩沖液中；上述過程重復(fù)3次，然后將噬菌體液于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

噬菌體計(jì)數(shù)方法采用Abiyad等[7]報(bào)道的方法。取噬菌體保存液，使用SM緩沖液10倍梯度稀釋，形成10-1～10-8濃度梯度，每個(gè)稀釋梯度取10 μL分別點(diǎn)在沙門菌上層培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上各梯度濃度的噬菌體斑，若噬菌體生長(zhǎng)密度大，則選擇下一濃度梯度計(jì)數(shù)。

1.3 沙門菌株藥敏試驗(yàn) 準(zhǔn)備藥敏紙片，包括氨芐西林(AMP)、氧氟沙星(OFX)、阿莫西林(AMX)、頭孢噻肟(CTX)、恩諾沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、左氧氟沙星(LEV)、鏈霉素(S)、林可-壯觀霉素(LS)和磺胺異噁唑(SF)等。將分離的各株沙門菌和標(biāo)準(zhǔn)株菌液各1 mL，與3 mL預(yù)熱的上層培養(yǎng)基(含0.4%瓊脂)混合，然后均勻覆蓋在SS平板培養(yǎng)基上，待上層培養(yǎng)基凝固后，將選取的藥敏紙片輕貼在培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌環(huán)直徑，按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)標(biāo)準(zhǔn)(m100-s20)判斷藥物敏感性：抑菌環(huán)直徑(φ)≥18 mm為敏感(S)，φ≤14 mm為耐藥(R)。

1.4 噬菌體感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)與細(xì)菌生長(zhǎng)曲線 將營養(yǎng)瓊脂NA(成分：蛋白胨10 g，牛肉粉3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，pH 7.4，加水至1 L)高壓滅菌，冷卻至60 ℃左右，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加瓊脂100 μL，冷凝后備用。

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇多重耐藥菌株Sal-4進(jìn)行噬菌體抑菌試驗(yàn)。將噬菌體加入過夜培養(yǎng)的Sal-4菌液中，并分別稀釋成不同濃度，使最終MOI為10∶1、1∶1、1∶10、1∶100，分別取10 μL細(xì)菌與噬菌體的混合液加入96孔板瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃靜置培養(yǎng)，使用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔OD值，每隔6 h測(cè)量1次，連續(xù)24 h。

1.5 噬菌體對(duì)沙門菌耐藥性的影響 根據(jù)噬菌體計(jì)數(shù)與MOI選擇結(jié)果，將噬菌體稀釋，加入1 mL 過夜培養(yǎng)的Sal-4菌液中，使最終MOI為1∶10，重復(fù)1.3藥敏試驗(yàn)，并測(cè)量抑菌環(huán)直徑。判定方法同1.3。

1.6 動(dòng)物試驗(yàn) 將1.2純化分離的噬菌體稀釋至濃度為1×108噬菌斑形成單位(Plaques forming unit,PFU)備用。將40只21日齡小鼠隨機(jī)分為4個(gè)組，每組10只，選擇沙門菌Sal-4作為試驗(yàn)感染菌株，具體分組和處理見表1。

表1 試驗(yàn)分組和處理Table 1 Experimental groups and treatments(n=10)

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離和鑒定 本試驗(yàn)成功分離出沙門菌11株，按順序分別編號(hào)，暫定編號(hào)為Sal-1～Sal-11。針對(duì)生化試驗(yàn)初步鑒定的11株沙門菌，進(jìn)行SdfⅠ基因PCR擴(kuò)增，所有菌株均獲得了明亮的DNA條帶，片段長(zhǎng)度約為333 bp，部分沙門菌分離株的凝膠電泳結(jié)果見圖1。

圖1 部分腸炎沙門菌分離株Sdf Ⅰ基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of Sdf Ⅰ gene in some Salmonella enteritis isolatesM：DL-2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC14028； 2～10:沙門菌分離菌株Sal-1～Sal-9M：DL-2 000 DNA Marker； 1：Salmonella standard strain ATCC14028； 2-10：Salmonella isolates Sal-1-Sal-9

2.2 噬菌體分離增殖與計(jì)數(shù) 試驗(yàn)中成功分離到宿主為沙門菌的噬菌體毒株，經(jīng)過噬菌體計(jì)數(shù)，確定其濃度為3.0×1011PFU。

2.3 沙門菌抗生素耐藥分析 使用AMP等10種常用抗生素，針對(duì)試驗(yàn)中分離到的11株耐藥性沙門菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，其中4株對(duì)1種抗生素耐藥，2株對(duì)2種抗生素耐藥，2株對(duì)3種抗生素耐藥，2株對(duì)4種抗生素耐藥，1株對(duì)6種抗生素耐藥(表2)。

由表2結(jié)果可知，本試驗(yàn)分離的11株沙門菌多重耐藥率為63.64%(7/11)。用于檢測(cè)的抗生素中，沙門菌株對(duì)氨芐西林耐藥比例最高(81.82%，9/11)，其次為阿莫西林(63.64%，7/11)、鏈霉素(45.46%，5/11)。頭孢噻肟、恩諾沙星、氟苯尼考、林可-壯觀霉素和磺胺異噁唑?qū)Ρ驹囼?yàn)分離的沙門菌有較好的抑菌效果，其中林可-壯觀霉素和磺胺異噁唑?qū)λ芯昃幸种谱饔?，恩諾沙星和氟苯尼考對(duì)分離菌株均呈現(xiàn)高度敏感(但恩諾沙星對(duì)Sal-4、Sal-7，氟苯尼考對(duì)Sal-4無抑制作用)。試驗(yàn)分離的11株沙門菌中，編號(hào)為Sal-4的菌株，對(duì)包括氨芐西林、阿莫西林、恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢噻肟和鏈霉素在內(nèi)的6種抗生素明顯耐藥。

表2 沙門菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果(抑菌環(huán)直徑φ=mm)Table 2 Results of drug sensitivity test of Salmonella(Diameter of bacteria inhibiting zone,φ=mm)

2.4 噬菌體MOI與細(xì)菌生長(zhǎng)曲線 根據(jù)細(xì)菌耐藥結(jié)果(表2)，Sal-4菌株表現(xiàn)多重耐藥，因而選擇Sal-4作為后續(xù)試驗(yàn)菌株，進(jìn)行噬菌體試驗(yàn)。如圖2所示，當(dāng)噬菌體存在時(shí)，Sal-4數(shù)量增長(zhǎng)緩慢，在MOI分別為1∶1、1∶10和1∶100時(shí)細(xì)菌增殖趨勢(shì)無明顯差異；但在MOI為10∶1時(shí)，細(xì)菌增殖明顯滯后，此條件下的細(xì)菌生長(zhǎng)情況不符合做后續(xù)藥敏試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)的要求。對(duì)比MOI為1∶1、1∶10、1∶100時(shí)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，細(xì)菌在MOI為1∶10時(shí)，最符合細(xì)菌增殖滯后且滿足藥敏試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)條件，因此，后續(xù)試驗(yàn)中選擇MOI為1∶10進(jìn)行。

圖2 不同MOI下Sal-4生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of Sal-4 under different MOI

2.5 噬菌體對(duì)沙門菌耐藥性的影響 將試驗(yàn)分離的噬菌體與多重耐藥沙門菌Sal-4共同培養(yǎng)后，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示，與未經(jīng)噬菌體處理的Sal-4菌株相比，處理后細(xì)菌對(duì)抗生素敏感性增加，表現(xiàn)為抗生素抑菌環(huán)直徑增加。

表3 噬菌體作用后Sal-4藥敏試驗(yàn)結(jié)果(抑菌環(huán)直徑φ=mm)Table 3 Results of drug sensitivity test of Salmonella Sal-4 treated by phage(Diameter of bacteria inhibiting zone,φ=mm)

2.6 動(dòng)物試驗(yàn) 結(jié)果如表4所示，廣譜耐藥沙門菌Sal-4對(duì)試驗(yàn)小鼠的致死率為90%(組1)，使用AMP單獨(dú)治療時(shí)，小鼠死亡率為70%(組2)，與組1無明顯差異(P>0.05)；單獨(dú)使用噬菌體治療Sal-4感染的小鼠(組 3)，小鼠死亡率明顯下降，與組2比較差異極顯著(P<0.01)，表明噬菌體可以抑制Sal-4對(duì)試驗(yàn)小鼠的損傷；在應(yīng)用噬菌體和AMP后(組4)，小鼠死亡率下降至20%，說明所分離的噬菌體Phage-1可以增強(qiáng)抗生素對(duì)Sal-4的抑制作用。

表4 Phage與AMP對(duì)Sal-4攻毒小鼠的影響Table 4 The effect of Phage and AMP on mice infected by Sal-4 (n=10)

3 討論

沙門菌特別是腸炎沙門菌，是最重要的食源性病原菌，常與禽類產(chǎn)品的污染有關(guān)。沙門菌每年在全球范圍內(nèi)造成約9 300萬胃腸炎病例和155 000人死亡[8]?？咕委熓侵委熒抽T菌感染的首選方法；然而，由于抗生素在人體醫(yī)藥和動(dòng)物生產(chǎn)中的濫用，抗菌藥物的耐藥性已成為世界性難題[9]。目前，源于畜牧業(yè)的耐藥微生物對(duì)環(huán)境和人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重挑戰(zhàn)。因此，弄清這些遺傳因子轉(zhuǎn)化為病原菌的來源和機(jī)制，不僅對(duì)減少治療中的感染，而且對(duì)防止微生物耐藥性的威脅具有重要意義[10]?？股囟嘀厮幠退?多重藥耐藥、極端耐藥和泛耐藥)是由適應(yīng)性進(jìn)化控制的，在抗生素脅迫條件下，多重藥耐藥的病原菌克隆可以成為優(yōu)勢(shì)菌[11-12]。

有研究表明，對(duì)取自環(huán)境的水樣進(jìn)行細(xì)菌分離和耐藥性分析，可以方便準(zhǔn)確的評(píng)估和檢測(cè)某一地區(qū)的細(xì)菌耐藥及耐藥基因進(jìn)化情況，是一種高效的病原菌檢測(cè)方式[13]。本試驗(yàn)在對(duì)肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)周圍水體取樣后，經(jīng)過對(duì)水樣進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，分離并鑒定出11株沙門菌，通過藥敏試驗(yàn)評(píng)估所分離沙門菌的耐藥性；此外，從同一水樣中分離噬菌體，選取不同感染復(fù)數(shù)(MOI)的噬菌體單獨(dú)應(yīng)用，以及與3種耐藥抗生素聯(lián)合應(yīng)用，檢測(cè)噬菌體及其與抗生素聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)耐藥沙門菌的抑制作用。結(jié)果顯示，自養(yǎng)殖場(chǎng)周圍水體中分離的11株沙門菌均對(duì)常用抗生素存在耐藥現(xiàn)象，并且多重耐藥率高達(dá)63.64%(7/11)。由于噬菌體的普遍存在性、宿主特異性和無害性，可以與食物一起口服，同時(shí)噬菌體療法作為一種治療細(xì)菌感染的替代療法被廣泛研究，特別是針對(duì)抗生素耐藥細(xì)菌的治療使用，具有很大的應(yīng)用潛力[10]。本試驗(yàn)結(jié)果還顯示，在MOI為1∶10時(shí)，噬菌體對(duì)沙門菌的抑制效果最好；噬菌體與抗生素聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可以明顯降低耐藥沙門菌對(duì)抗生素的耐藥性，試驗(yàn)選擇的耐藥沙門菌Sal-4分離株，在噬菌體作用下，對(duì)抗生素的敏感性顯著增加。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示，同時(shí)使用噬菌體與氨芐青霉素治療沙門菌感染，小鼠死亡率極顯著下降(P<0.01)，說明所分離的噬菌體Phage-1可以顯著降低Sal-4對(duì)抗生素的耐藥作用。