基于ISSR 和RAPD 標(biāo)記的太子參種質(zhì)遺傳多樣性研究

史 輝，陳美霞，李萍萍，葉祖云

（1. 寧德師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100；2. 福建省特色藥用植物工程技術(shù)研究中心，福建 寧德 352100）

太子參（Pseudostellaria heterophylla）為石竹科多年生草本植物，以塊根入藥，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具益氣健脾、生津潤(rùn)肺之功效[1]。太子參藥用成分主要有多糖、皂甙、氨基酸、環(huán)肽等，主要分布于我國(guó)福建、江蘇、安徽、貴州、山東、湖南等省[2]。太子參的品種選育工作滯后，缺乏規(guī)范化的引種和交流，使現(xiàn)有栽培群體混亂，內(nèi)在質(zhì)量和藥材產(chǎn)量參差不齊[3]。因此，對(duì)太子參種源進(jìn)行遺傳分析和鑒定尤為重要。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間多態(tài)性（ISSR）和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)單和多態(tài)性高等特點(diǎn)，且不需要預(yù)先知道研究材料的基因組信息[4-5]?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析[6-9]、品種鑒定[10-11]、親緣關(guān)系分析[12]和輔助育種[13]等工作。已有研究表明，太子參種質(zhì)資源具有較高的遺傳多樣性[3，14]，但該結(jié)論是基于單一分子標(biāo)記的研究結(jié)果。單一分子標(biāo)記檢測(cè)多態(tài)性信息少，會(huì)使各項(xiàng)遺傳參數(shù)產(chǎn)生偏差，不能全面揭示物種的遺傳多樣性[15]。ISSR 可以擴(kuò)增基因組的內(nèi)含子區(qū)域[16]，RAPD 可以同時(shí)擴(kuò)增大量位點(diǎn)[17]，2 種標(biāo)記的組合可以更高程度地覆蓋基因組。目前，綜合多種分子標(biāo)記對(duì)太子參進(jìn)行遺傳分析的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，擬采用多態(tài)性豐富的ISSR和RAPD 2種標(biāo)記技術(shù)分析不同產(chǎn)地的10個(gè)太子參種質(zhì)的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，以克服單一分子標(biāo)記對(duì)種質(zhì)遺傳分析存在誤差的缺點(diǎn)，為太子參種質(zhì)資源鑒定、科學(xué)引種及合理開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 供試材料為從國(guó)內(nèi)主要產(chǎn)地收集的10 個(gè)太子參種質(zhì)（表1），種植保存于福建省柘榮縣英山鄉(xiāng)鳳洋太子參良種繁育基地資源圃。經(jīng)寧德師范學(xué)院葉祖云教授鑒定，10個(gè)太子參種質(zhì)均為石竹科太子參。采摘新鮮幼嫩葉，采用康為世紀(jì)生物科技有限公司植物基因組提取試劑盒提取各種質(zhì)的基因組DNA。

表1 太子參名稱及來(lái)源Tab.1 Name and source of Pseudostellaria heterophylla

1.1.2 試劑 引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；rTaq、DM2000 Marker、dNTP、植物基因組提取試劑盒均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；瓊脂糖為西班牙Biowest進(jìn)口。

1.1.3 儀器 試驗(yàn)儀器包括PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)Biometra C-412）、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-rad GelDoc EZ）、超微量核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)ACTGene Nanodrop 2000）、高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)SIGMA 3-30K）、電泳儀（北京六一DYY-10C型）、超純水儀（美國(guó)MILLI-Q）、制冰機(jī)（美國(guó)Scotsman AF100-AS)、微量移液器（法國(guó)Gilson Ppetman 系列）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 太子參ISSR、RAPD 引物篩選 在前期建立的太子參ISSR和RAPD 反應(yīng)體系[18-19]基礎(chǔ)上，以ZS1為模板，分別用100 條ISSR 引物和21 條RAPD 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。從中篩選擴(kuò)增清晰且擴(kuò)增位點(diǎn)豐富的引物作為后續(xù)分析的引物。

1.2.2 太子參種質(zhì)ISSR、RAPD 擴(kuò)增 利用篩選出的適宜引物和前期建立的ISSR 和RAPD 反應(yīng)體系[18-19]，對(duì)不同產(chǎn)地的10 個(gè)太子參種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計(jì)多態(tài)性條帶并進(jìn)行賦值，有帶為1，無(wú)帶為0。采用Popgene 32軟件計(jì)算種質(zhì)間的觀測(cè)等位基因數(shù)（Observed number of alleles，Na）、有效等位基因數(shù)（Effective number of alleles，Ne）、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)（Nei’s genetic diversity index，H）、Shannon’s 多態(tài)性指數(shù)（Shannon’s information index，I）。利用NTSYS-PC 2.1 軟件分別計(jì)算基于RAPD 標(biāo)記、ISSR 標(biāo)記以及綜合2 種標(biāo)記的10 個(gè)太子參種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)（Genetic similarity coefficient，GS），并基于GS 分別繪制ISSR 標(biāo)記聚類圖、RAPD標(biāo)記聚類圖以及綜合2種標(biāo)記的聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 太子參ISSR、RAPD引物篩選

用100 條ISSR 引 物（UBC801—UBC900）和21條RAPD 引 物 對(duì)ZS1 進(jìn) 行 擴(kuò) 增，部 分ISSR 和RAPD 引物的擴(kuò)增結(jié)果如圖1 所示。從100 條ISSR引物和21條RAPD引物中分別篩選出13、16條擴(kuò)增位點(diǎn)多、條帶明亮清晰的引物。13 條ISSR 引物分別為UBC807、UBC808、UBC811、UBC813、UBC818、UBC836、UBC841、UBC850、UBC866、UBC874、UBC876、UBC890、UBC891。16 條RAPD 引物分別為S1、S8、S10、S12、S13、S22、S24、S28、S30、S33、S90、S98、S145、S146、S147、S167。

圖1 太子參ISSR和RAPD適宜引物篩選Fig.1 Screening of ISSR and RAPD primers suitable for Pseudostellaria heterophylla

2.2 太子參ISSR、RAPD標(biāo)記擴(kuò)增分析

用篩選出的13 條ISSR 引物和16 條RAPD 引物對(duì)10 個(gè)太子參種質(zhì)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增片段為250～3 000 bp（圖2）。每個(gè)引物對(duì)大部分種質(zhì)都表現(xiàn)出多態(tài)性，某些引物在特定種質(zhì)上表現(xiàn)出特異性條帶。統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2）表明，ISSR 和RAPD 引物在10 個(gè)太子參種質(zhì)中分別獲得101、89 個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)（Number of polymorphism loci，NPL）分別為58、63 個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)頻率（Percentage of polymorphism loci，PPL）分別為57.37%、70.32%?；贗SSR標(biāo)記的太子參種質(zhì)間的Na為1.300 0～1.900 0，平均為1.573 7；Ne為1.143 9～1.723 6，平均為1.344 3；H 為0.215 0～0.450 0，平均為0.353 2；I 為0.368 9～0.642 0，平均為0.529 7?；赗APD 標(biāo)記的太子參種質(zhì)間的Na 為1.250 0～2.000 0，平均為1.703 2；Ne為1.172 5～1.801 6，平均為1.418 1；H 為0.215 0～0.480 0，平均為0.354 9；I 為0.368 9～0.673 0，平均為0.532 1。綜上，ISSR、RAPD 2 種標(biāo)記都能有效地展示太子參種質(zhì)間的遺傳差異。

圖2 ISSR引物UBC811（左）和RAPD引物S1（右）對(duì)太子參的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of Pseudostellaria heterophylla by ISSR primer UBC811（left）and RAPD primer S1（right）

表2 太子參不同引物的擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性Tab.2 Amplification results and polymorphism of Pseudostellaria heterophylla by different primers

2.3 太子參種質(zhì)ISSR、RAPD標(biāo)記GS分析

對(duì)多態(tài)性條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并賦值，利用NTSYSPC 2.1 軟件分別計(jì)算出基于ISSR 標(biāo)記的太子參種質(zhì)間的GS 為0.673～0.970（表3）；基于RAPD 標(biāo)記的GS 為0.517～0.944（表4）；綜 合2 種 標(biāo) 記 的GS 為0.668～0.911（表5）。由表3—5 可知，如果2 個(gè)種質(zhì)在ISSR 標(biāo)記分析中表現(xiàn)出較高的GS，則它們?cè)赗APD 標(biāo)記和綜合2 種標(biāo)記分析中也表現(xiàn)出較高的GS，說(shuō)明3 種分析結(jié)果具有較強(qiáng)的一致性。ISSR 與RAPD 標(biāo)記的GS 相比，RAPD 標(biāo)記的GS 整體上更低，綜合2 種標(biāo)記的GS 是基于2 種標(biāo)記的綜合統(tǒng)計(jì)結(jié)果，其GS介于兩者之間。綜合考量3種標(biāo)記分析獲取的GS，10 個(gè)太子參種質(zhì)間存在著較高的遺傳多樣性。

表3 基于ISSR標(biāo)記的太子參種質(zhì)GSTab.3 GS of Pseudostellaria heterophylla germplasm based on ISSR markers

表4 基于RAPD標(biāo)記的太子參種質(zhì)GSTab.4 GS of Pseudostellaria heterophylla germplasm based on RAPD markers

表5 基于ISSR 和RAPD 標(biāo)記的太子參種質(zhì)GSTab.5 GS of Pseudostellaria heterophylla germplasm based on ISSR and RAPD markers

2.4 太子參種質(zhì)ISSR、RAPD標(biāo)記聚類分析

為客觀地展示太子參不同種質(zhì)間的GS 及其親緣關(guān)系，利用NTSYS-PC 2.1 軟件對(duì)10 個(gè)太子參種質(zhì)分別繪制ISSR 標(biāo)記聚類圖、RAPD 標(biāo)記聚類圖以及綜合2 種標(biāo)記的聚類圖。當(dāng)GS 以0.780 為界線時(shí)，ISSR 標(biāo)記聚類將10 個(gè)太子參種質(zhì)劃分為3 組：第1 組包括福建省柘榮縣的3 個(gè)種質(zhì)ZS1、ZS2 和ZS3 以及貴州省施秉縣的G2、湖南省隆回縣的HN和江蘇省句容縣的S1；貴州省施秉縣的G1 單獨(dú)聚為第2 組；第3 組包括安徽省宣城市的2 個(gè)種質(zhì)A1和A2以及江蘇省句容縣的S2（圖3）。RAPD標(biāo)記聚類將10 個(gè)太子參種質(zhì)分為4 組：第1 組包括福建省柘榮縣的3 個(gè)種質(zhì)ZS1、ZS2 和ZS3；第2 組包括安徽省宣城市的2個(gè)種質(zhì)A1和A2、貴州省施秉縣的2個(gè)種質(zhì)G1 和G2 以及江蘇省句容縣的S2；湖南省隆回縣的HN 單獨(dú)聚為第3 組；江蘇省句容縣的S1 單獨(dú)聚為第4 組（圖4）。綜合2 種標(biāo)記的聚類將10 個(gè)太子參種質(zhì)分為4組：第1組包括福建省柘榮縣的3個(gè)種質(zhì)ZS1、ZS2 和ZS3；第2 組包括安徽省宣城市的2個(gè)種質(zhì)A1 和A2、貴州省施秉縣的G1 以及江蘇省句容縣的S2；第3組包括貴州省施秉縣的G2和湖南省隆回縣的HN；江蘇省句容縣的S1 單獨(dú)聚為第4組（圖5）。綜上，不管是單標(biāo)記還是綜合標(biāo)記進(jìn)行的聚類，其聚類結(jié)果均與太子參種質(zhì)的地理分布有明顯的相關(guān)性。

圖3 基于ISSR標(biāo)記的太子參種質(zhì)聚類Fig.3 Dendrogram of Pseudostellaria heterophylla germplasm based on ISSR markers

圖4 基于RAPD標(biāo)記的太子參種質(zhì)聚類Fig.4 Dendrogram of Pseudostellaria heterophylla germplasm based on RAPD markers

圖5 基于ISSR和RAPD標(biāo)記的太子參種質(zhì)聚類Fig.5 Dendrogram of Pseudostellaria heterophylla germplasm based on ISSR and RAPD markers

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

3.1.1 太 子 參ISSR、RAPD 引 物 篩 選 ISSR 和RAPD 均為隨機(jī)標(biāo)記，其特點(diǎn)是1 條引物在研究材料的基因組上可能沒(méi)有結(jié)合位點(diǎn)或者有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。沒(méi)有結(jié)合位點(diǎn)，就沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物；有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)就有多種擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，在用ISSR 和RAPD 標(biāo)記做遺傳分析之前，必須先篩選適宜引物。擴(kuò)增產(chǎn)物種類越多，說(shuō)明該引物在基因組上檢測(cè)的位點(diǎn)越多；擴(kuò)增條帶越清晰，說(shuō)明該引物在基因組上的非特異性擴(kuò)增越少。擴(kuò)增條帶清晰且擴(kuò)增條帶種類豐富的引物是適宜進(jìn)行太子參遺傳分析的引物[18，20]。篩選到的引物越多，在基因組上檢測(cè)的位點(diǎn)就越多，對(duì)整個(gè)基因組的覆蓋程度就越高，結(jié)果就越可靠。本研究共篩選出13 條ISSR 引物和16條RAPD 引物，并分別獲得101、89 個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，數(shù)量較為豐富，能廣泛地覆蓋太子參基因組。

3.1.2 太子參ISSR、RAPD 標(biāo)記擴(kuò)增分析 不同引物在基因組上檢測(cè)的位點(diǎn)不同，如果太子參種質(zhì)的基因組在某些位點(diǎn)上具有較高的多態(tài)性，那么這些位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的引物就會(huì)表現(xiàn)出較高的PPL、Na、Ne、H和I 值；反之，則會(huì)表現(xiàn)出較低的PPL、Na、Ne、H 和I值。所以同一種標(biāo)記的不同引物會(huì)表現(xiàn)出不同的PPL、Na、Ne、H和I值[21]。RAPD標(biāo)記的PPL、Na、Ne、H 和I 的平均值略高于ISSR，說(shuō)明整體上RAPD 比ISSR 標(biāo)記具有更高的多態(tài)性。但從各個(gè)引物的情況 來(lái) 看，某 些ISSR 引 物（如UBC808、UBC841、UBC850和UBC891）也展示出較高的PPL、Na、Ne、H和I值。這是因?yàn)镮SSR 和RAPD 標(biāo)記檢測(cè)的位點(diǎn)是不同的[16-17]，基因組上一些多態(tài)性位點(diǎn)能被某些ISSR 引物檢測(cè)到，而另一些多態(tài)性位點(diǎn)能被某些RAPD 引物檢測(cè)到。因此，綜合2 種標(biāo)記則可以彌補(bǔ)彼此檢測(cè)能力的不足。

3.1.3 太子參種質(zhì)ISSR、RAPD 標(biāo)記GS分析 種質(zhì)間GS 的大小表示種質(zhì)間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近[22-24]。GS越大，種質(zhì)間的遺傳差異越小，親緣關(guān)系越近；反之，GS 越小，種質(zhì)間的遺傳差異越大，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)[25]。與ISSR 標(biāo)記相比，RAPD 標(biāo)記的GS 整體上更低，更能展示太子參種質(zhì)間的遺傳差異。這與RAPD 標(biāo)記的PPL、Na、Ne、H 和I 的平均值略高于ISSR 標(biāo)記相吻合。但應(yīng)具體到種質(zhì)考量，對(duì)于某些種質(zhì)（如G1、S2、A1、A2）而言，ISSR 比RAPD 標(biāo)記更能展示其與其他種質(zhì)間的區(qū)別。綜上，應(yīng)綜合2 種標(biāo)記計(jì)算種質(zhì)間的GS 并對(duì)其進(jìn)行聚類，以更客觀地展示種質(zhì)間的遺傳差異。

3.1.4 太子參種質(zhì)ISSR、RAPD 標(biāo)記聚類分析綜合2 種標(biāo)記的聚類圖顯示，當(dāng)GS 以0.780 為界線時(shí)，10個(gè)太子參種質(zhì)被劃分為4組。20世紀(jì)90年代初貴州省施秉縣有從福建省柘榮縣引種太子參的歷史[14]，但在本研究中，貴州省施秉縣的2 個(gè)種質(zhì)（G1 和G2）與福建省柘榮縣的3 個(gè)種質(zhì)（ZS1、ZS2 和ZS3）并沒(méi)有聚在一組，可能太子參在長(zhǎng)期的自然選擇和人工選擇下經(jīng)過(guò)多代的無(wú)性繁殖積累了很多突變。第2 組中安徽省宣城市的2 個(gè)種質(zhì)（A1 和A2）與江蘇省句容縣的栽培種質(zhì)（S2）的GS 分別高達(dá)0.900、0.911，從地理距離來(lái)看，安徽省宣城市與江蘇省句容縣僅相距約90 km，近地引種的可能性很大[26]。江蘇省句容縣的2 個(gè)種質(zhì)（S1 和S2）的GS僅為0.679，未聚在一組，推測(cè)野生種質(zhì)S1 不是從安徽省宣城市引種。貴州省施秉縣的G2 與湖南省隆回縣的HN 雖然聚為第3 組，但GS 僅為0.789，兩地間距離約360 km，是否互相引種還需進(jìn)一步考證。

研究還發(fā)現(xiàn)，野生種質(zhì)（HN 和S1）間以及它們與栽培種質(zhì)（ZS1、ZS2、ZS3、G1、G2、S2、A1、A2）間的遺傳差異都很大，GS都小于0.800（HN與S1的GS為0.737，HN 與栽培種質(zhì)間的GS 為0.732～0.789，S1 與栽培種質(zhì)間的GS 為0.679～0.779）。除貴州省施秉縣 的2 個(gè) 種 質(zhì)G1 和G2 遺 傳 差 異 較 大（GS 僅 為0.768），沒(méi)有聚在一組外，其他相同產(chǎn)地的栽培種質(zhì)間的遺傳差異都很?。℅S 都大于0.800），并按產(chǎn)地分別聚在一組。說(shuō)明聚類分析結(jié)果與太子參種質(zhì)的地理分布有明顯的相關(guān)性，但由于引種的原因，使聚類結(jié)果與太子參種質(zhì)的地理分布并不完全吻合，該結(jié)果與前人的研究結(jié)果[14，27]基本一致。同時(shí)，也說(shuō)明太子參經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期相同生態(tài)環(huán)境下的人工栽培馴化，使相同地理分布的栽培種質(zhì)間的遺傳差異減小，降低了種質(zhì)的遺傳多樣性。

3.1.5 隨機(jī)標(biāo)記的不足和后續(xù)研究展望 ISSR 和RAPD 均為隨機(jī)標(biāo)記，隨機(jī)標(biāo)記的缺點(diǎn)是引物可能會(huì)在材料的基因組上出現(xiàn)非特異性的結(jié)合，導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。盡管在本研究中設(shè)置了多次重復(fù)，但對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)時(shí)，不可避免會(huì)存在誤差。按照不同的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行賦值，得出的GS 和聚類圖均會(huì)有所不同。盡管前期已經(jīng)對(duì)各個(gè)引物的擴(kuò)增體系進(jìn)行了優(yōu)化，但仍存在少量非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的弱帶，對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果造成干擾。幸運(yùn)的是RAPD標(biāo)記引物異常豐富，且在本研究中RAPD 標(biāo)記在太子參種質(zhì)間展示出較高的多態(tài)性，后續(xù)可加大對(duì)RAPD 引物的篩選，并結(jié)合其他分子標(biāo)記以及形態(tài)特性指標(biāo)，以獲得更準(zhǔn)確的分析結(jié)果。本研究還發(fā)現(xiàn)，一些ISSR 和RAPD 引物對(duì)某些太子參種質(zhì)擴(kuò)增出特異性條帶。后續(xù)可在本研究基礎(chǔ)上，對(duì)種質(zhì)特異性條帶進(jìn)行回收克隆、測(cè)序，再根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)特異引物。實(shí)現(xiàn)由ISSR 或RAPD 標(biāo)記向序列特異擴(kuò)增區(qū)域（Sequence characterized amplified region，SCAR）標(biāo)記的轉(zhuǎn)化[28]，以便更精確地鑒定太子參種質(zhì)。

3.2 結(jié)論

本研究采用ISSR 和RAPD 標(biāo)記對(duì)來(lái)自不同產(chǎn)地的10 個(gè)太子參種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性研究。13 條ISSR 引物和16 條RAPD 引物分別獲得101、89 個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)。其中NPL 分別為58、63 個(gè)，PPL 分別為57.37%、70.32%?；贗SSR 標(biāo)記的太子參種質(zhì)間的Na、Ne、H 和I 的平均值分別為1.573 7、1.344 3、0.353 2、0.529 7?；赗APD 標(biāo)記的太子參種質(zhì)間的Na、Ne、H 和I 的平均值分別為1.703 2、1.418 1、0.354 9、0.532 1。說(shuō)明2 種標(biāo)記都能有效地展示太子參種質(zhì)間的遺傳差異。因?yàn)閱螛?biāo)記所能檢測(cè)的位點(diǎn)數(shù)量有限，不能充分覆蓋太子參基因組，使遺傳分析產(chǎn)生偏差，為更客觀地展示太子參種質(zhì)間的遺傳差異，應(yīng)綜合2 種標(biāo)記計(jì)算太子參種質(zhì)間的GS并聚類。綜合2 種標(biāo)記的太子參種質(zhì)間的GS 為0.668～0.911。綜合2 種標(biāo)記的聚類分析結(jié)果表明，當(dāng)GS為0.780時(shí)，10個(gè)太子參種質(zhì)可聚為4組，聚類分析結(jié)果與太子參種質(zhì)的地理分布有明顯的相關(guān)性。綜合2 種標(biāo)記對(duì)太子參種質(zhì)進(jìn)行遺傳分析，能更準(zhǔn)確有效地鑒定太子參種質(zhì)?？筛鶕?jù)聚類結(jié)果推測(cè)種質(zhì)的來(lái)源，為厘清太子參產(chǎn)地間的引種交流情況提供參考依據(jù)。