干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY 基因的鑒定與分析

付家旭，閆亞麗，謝小文，張心悅，溫鵬飛，關小康，王同朝，衛(wèi) 麗

（河南農業(yè)大學 農學院，河南 鄭州 450002）

玉米（Zea mays）是我國主要的糧食作物，也是重要的飼料和工業(yè)原料。近年來，隨著全球氣候變暖，干旱發(fā)生的頻率和強度逐年增加，對玉米生產造成嚴重影響[1]。尤其在播種-出苗階段，若遭遇干旱，會嚴重影響玉米出苗和生長。干旱脅迫條件下，水分虧缺會引起氣孔關閉，導致光合作用下降，造成減產，嚴重時甚至絕收[2]。

轉錄因子是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質，通過與靶基因啟動子區(qū)的順式作用元件結合，激活或抑制基因的表達，在植物逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用[3]。目前，已發(fā)現WRKY、bZIP（Basic leucine zipper）、NAC（NAM、ATAF1/ATAF2 和CUC2）、MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog ）和bHLH（Basic helix-loophelix）等轉錄因子家族與逆境脅迫密切相關[4-8]。WRKY 是植物中較龐大的一個轉錄因子家族，自ISHIGURO 等[9]從甘薯中克隆出第一個WRKY 基因SPF1（Sweet potato factor 1）后，在 擬 南 芥（Arabidopsis thaliana）[10]、水稻（Oryza sativaL.）[11]、高粱（Sorghum bicolor）[12]、小 麥（Triticum aestivumL.）[13]、大麥（Hordeum vulgareL.）[14]、玉米[15]和陸地棉（Gossypium hirsutum）[16]等多個物種中鑒定到WRKY基因。WRKY 轉錄因子通過特異性結合靶基因啟動子的順式作用元件W-box[（T）TGAC（C/T）]而調控基因表達，在植物生長發(fā)育及逆境脅迫中具有重要作用[17]。過表達小麥TaWRKY2基因提高了干旱脅迫條件下轉基因小麥葉片中的游離脯氨酸、可溶性糖和葉綠素含量，進而提高了對干旱的耐受性[18]。干旱和鹽脅迫誘導大豆（Glycine max）GmWRKY12表達，過表達GmWRKY12基因提高了大豆葉片中脯氨酸含量，降低了丙二醛（MDA）含量，最終提高了抗旱性和耐鹽性[19]。過表達陸地棉GhWRKY33基因可以提高擬南芥對脫落酸（ABA）和干旱的耐受能力[20]。前期，河南農業(yè)大學農學院旱作節(jié)水課題組以豫882為試驗材料，在苗期進行干旱-復水處理轉錄組測序分析，從中得到11 002 個差異表達的基因，包括56 個轉錄因子家族，2 332 個轉錄因子[5，21-23]。在前期[23]研究基礎上，對干旱-復水處理下差異表達的玉米WRKY 基因進行鑒定，并對其蛋白質理化性質、系統(tǒng)進化、染色體分布和復制關系、基因結構和蛋白質保守基序、啟動子區(qū)順式作用元件及干旱-復水條件下的表達量等進行分析，為WRKY基因的進一步利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與干旱處理

供試玉米材料為豫882，選取籽粒飽滿、均勻的種子，滅菌后播種在土壤∶蛭石為3∶1 的混合土樣中，放置于光照培養(yǎng)箱中[溫度28 ℃/22 ℃，光照周期14 h/10 h，光照強度120 μmol/（m2·s），相對濕度60%]。待玉米生長至有3 片展開葉時，將其移栽到霍格蘭（Hoagland）營養(yǎng)液中，營養(yǎng)液每2 d 更換一次。處理組在營養(yǎng)液中加入20%聚乙二醇（PEG）6000 模擬干旱，分別處理60 h 和96 h，復水3 d，記為T60、T96、TR3d；不進行干旱處理的對照組（霍格蘭營養(yǎng)液）分別記為CK60、CK96、CK3d。取葉片立即放入液氮中速凍，然后放置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2 玉米WRKY基因的鑒定

使 用Pfam 數 據 庫（http://pfam.xfam.org/）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）在線網站進一步分析玉米WRKY 基因相對應的蛋白質，去除冗余和重復的基因并刪除缺少完整結構域的蛋白質序列，并將其結構域與WRKY 結構域進行比對，保留含有WRKY 結構域的基因。采用RPKM 值計算基因在對照組與處理組之間的表達量差異倍數，以|log2（差異倍數）|≥1、錯誤率（FDR）＜0.05 為標準，篩選玉米干旱-復水處理中差異表達的WRKY 基因，并 參 考Ensembl Plants（http://plants. ensembl. org/index.html）和MaizeGDB（https://www.maizegdb.org/）數據庫進行命名。

1.3 玉米WRKY基因的生物信息學分析

1.3.1 蛋白質分子質量和等電點 利用在線網站ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）預測和分析玉米WRKY 基因編碼蛋白質的分子質量和等電點。

1.3.2 系統(tǒng)進化 從玉米數據庫MaizeGDB（https://www.maizegdb.org/）中下載51 個WRKY 蛋白序列，從TAIR數據庫（https://www.arabidopsis.org/）中下載擬南芥的WRKY蛋白序列，采用DNAMAN軟件對玉米和擬南芥WRKY 蛋白的氨基酸序列進行比對，篩選出同源序列。采用MEGA 7.0軟件NJ（Neighbor-joining）法構建系統(tǒng)進化樹，步長設置為1 000。

1.3.3 基因在染色體上的分布和復制關系 利用Ensembl Plants 下載玉米基因組注釋信息，使用TBtools分析基因在染色體上的分布和復制關系。

1.3.4 基因結構和蛋白質保守基序（Motif） 利用GSDS（https://gsds.cbi.pku.edu.cn/）在線分析WRKY 基因外顯子-內含子結構。利用MEME Suite 5.4.1（https://meme-suite.org/meme/）在線預測玉米WRKY蛋白的保守基序，Motif 個數設置為10 個，基序長度為6～70 aa，其他參數均為默認值。

1.3.5 啟動子區(qū)順式作用元件 從數據庫Ensembl Plants（http://plants.ensembl.org/index.html）獲取WRKY基 因 上 游2 000 bp 序 列，用Plant CARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對WRKY基因啟動子區(qū)的順式作用元件進行分析。

1.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

根據Ensembl Plants 中檢索到的候選WRKY 基因的cDNA 序列，使用Primer Premier 5.0 進行qRTPCR 引物設計（表1）。利用Trizol 試劑提取葉片總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）反轉錄試劑盒合成cDNA，按照TB GreenPremix ExTaqTMⅡ（TaKaRa）試劑盒說明書進行qRT-PCR，采 用 玉 米18S RNA（GenBank No.AF168884.1）作為內參基因。qRT-PCR 反應體系為20 μL：cDNA 1 μL，TB Green Premix ExTaqTMⅡ10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ddH2O 7.4 μL。qRT-PCR 反應程序：95 ℃30 s；95 ℃5 s、60 ℃30 s，40 個循環(huán)。試驗進行3 次生物學重復，采用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量[24]。

表1 玉米WRKY基因qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences for WRKY genes in maize

2 結果與分析

2.1 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因的鑒定及理化性質分析

本研究在前期研究結果[23]基礎上鑒定出51 個干旱-復水處理下差異表達的玉米WRKY 基因（表2），開放閱讀框（ORF）為690～2 248 bp；編碼的氨基酸數目最多為729 個，最少為99 個；編碼蛋白質分子質量為11.22～78.73 ku。編碼蛋白質等電點最小為4.58，最大為12.26，平均為7.6。其中，有20個小于7，占總數的39.22%；有31 個大于7，占總數的60.78%，說明這51 個差異表達的玉米WRKY基因編碼的蛋白質偏向于堿性。

表2 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因基本信息Tab.2 The basic information of differentially expressed WRKY genes in maize under drought-rewatering treatment

續(xù)表2 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因基本信息Tab.2（Continued） The basic information of differentially expressed WRKY genes in maize under drought-rewatering treatment

2.2 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因系統(tǒng)進化分析

本研究篩選出31個干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY 基因的擬南芥同源基因，構建玉米、擬南芥WRKY 蛋白系統(tǒng)進化樹（圖1）。82 個WRKY蛋白可劃分為3 組，其中，Ⅰ組含有9 個玉米WRKY蛋白，占玉米總數的17.65%；Ⅱ組有28 個玉米WRKY 蛋白，占玉米總數的54.90%，占比最高，說明Ⅱ組可能在玉米進化中占主體地位；Ⅲ組有14個玉米WRKY蛋白，占玉米總數的27.45%。Ⅱ組又可分為5 個亞組（Ⅱa—Ⅱe），其中，Ⅱc 亞組中含有12 個玉米WRKY蛋白，占玉米總數的27.45%。每個組都有擬南芥WRKY 蛋白，說明玉米和擬南芥的WRKY基因存在平行進化。

圖1 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY蛋白與擬南芥同源蛋白系統(tǒng)進化分析Fig.1 Phylogenetic evolution analysis between differentially expressed WRKY proteins in maize under drought-rewatering treatment and part of homologous WRKY proteins in Arabidopsis thaliana

2.3 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因染色體分布與復制關系分析

51個干旱-復水處理下差異表達的玉米WRKY基因不均勻地分布在10 條染色體上（圖2）。其中，第3 和第8 染色體上分布的WRKY 基因較多，分別有10、11個；分布最少的是第2和第10染色體，各分布2 個基因。 發(fā)生了2 對串聯(lián)復制事件（ZmWRKY26/ZmWRKY80、ZmWRKY27/ZmWRKY56），分別發(fā)生在第8 染色體、第3 染色體上。發(fā)生了16對片段復制事件（ZmWRKY102/ZmWRKY109、ZmWRKY73/ZmWRKY82、ZmWRKY106/ZmWRKY86、ZmWRKY87/ZmWRKY52、ZmWRKY43/ZmWRKY57、ZmWRKY27/ZmWRKY80、ZmWRKY74/ZmWRKY86、ZmWRKY48/ZmWRKY124、ZmWRKY25/ZmWRKY38、ZmWRKY29/ZmWRKY111、ZmWRKY43/ZmWRKY115、ZmWRKY56/ZmWRKY26、ZmWRKY103/ZmWRKY111、ZmWRKY82/ZmWRKY68、ZmWRKY57/ZmWRKY115、ZmWRKY74/ZmWRKY106）。其中，7 對片段復制事件（ZmWRKY27/ZmWRKY80、ZmWRKY74/ZmWRKY86、ZmWRKY29/ZmWRKY111、ZmWRKY43/ZmWRKY115、ZmWRKY56/ZmWRKY26、ZmWRKY103/ZmWRKY111、ZmWRKY74/ZmWRKY106））發(fā)生在第3 染色體和第8染色體上，表明第3染色體和第8染色體可能與玉米WRKY家族擴張密切相關。

圖2 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因染色體分布及復制關系Fig.2 Chromosome distribution and duplication of differentially expressed WRKY genes in maize under droughtrewatering treatment

2.4 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因結構和蛋白質保守基序分析

干旱-復水處理下51 個差異表達玉米WRKY基因結構如圖3 所示，玉米WRKY 基因的外顯子數是1～12 個，含有3 個外顯子的占62.74%。除ZmWRKY25基因外，其余WRKY 基因均含有內含子。大部分同一組或亞組的WRKY 基因具有相對保守的外顯子數，如Ⅱc 中除了ZmWRKY30和ZmWRKY108基因外，均含有3 個外顯子，Ⅱd 亦是如此。而Ⅰ中外顯子數量變化較大，介于2～8個，其中 有 3 個 基 因（ZmWRKY115、ZmWRKY43和ZmWRKY1）含有5 個外顯子，2 個基因（ZmWRKY83和ZmWRKY62）含 有3 個 外 顯 子，ZmWRKY92、ZmWRKY87、ZmWRKY57、ZmWRKY52分別含有2、4、6、8 個外顯子；Ⅲ中ZmWRKY25只含有1 個外顯子，ZmWRKY65含有12個外顯子。

圖3 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因結構和蛋白質保守基序分析Fig.3 Analysis of differentially expressed WRKY gene structure and encoded protein conserved motif in maize under drought-rewatering treatment

41個玉米WRKY 蛋白含有2～4個保守基序，占80.39%。同一組中的WRKY 成員具有相似的基序組成，例如，Ⅰ中都含有Motif1、Motif2、Motif4 和Motif9；Ⅱc 中 除ZmWRKY100（含 有Motif1 與Motif4）外 其 余 成 員 都 含 有Motif1、Motif2 和Motif4。

2.5 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因啟動子順式作用元件分析

為進一步預測玉米WRKY 基因的功能，對51個玉米WRKY 基因上游2 000 bp 啟動子區(qū)域進行順式作用元件分析。由圖4 可知，51 個玉米WRKY 基因啟動子區(qū)域含有ABA 響應元件（ABRE）、生長素響應元件（AuxRR-core、TGA-element）、水楊酸響應元件（TCA-element）、赤霉素響應元件（GAREmotif、P-box、TATC-box）、茉 莉 酸 甲 酯 響 應 元 件（CGTCA-motif、TGACG-motif）、防衛(wèi)和脅迫響應元件（TC-rich repeats）、低溫響應元件（LTR）、干旱響應元件（MBS）、缺氧誘導有關元件（GC-motif）等植物激素及非生物脅迫相關的順式作用元件。其中，AREB、LTR、MBS、TCA-element 和TGACG-motif 分布較多，而GARE-motif、P-box、TC-rich 和TATCbox 分 布 較 少。 除 了ZmWRKY1、ZmWRKY52、ZmWRKY96和ZmWRKY106外，其余基因均含有ABRE。 含 有 CGTCA-motif 較 多 的 基 因 有ZmWRKY15、ZmWRKY29、ZmWRKY40、ZmWRKY53、ZmWRKY92和ZmWRKY104；ZmWRKY28、ZmWRKY52、ZmWRKY108和ZmWRKY115等24個基因含有MBS；88.24%的ZmWRKY基因含有TGACGmotif，其 中ZmWRKY38、ZmWRKY43、ZmWRKY53、ZmWRKY92、ZmWRKY96和ZmWRKY99含 有4 個 及以上。以上結果說明玉米WRKY 基因在激素信號轉導和非生物脅迫響應中可能起著重要的作用。

圖4 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因啟動子區(qū)順式作用元件分析Fig.4 Analysis of cis-acting elements in the promoter region of differentially expressed WRKY genes in maize under drought-rewatering treatment

2.6 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因的表達分析

依據轉錄組結果，在干旱-復水處理下，51個玉米WRKY基因呈現不同的表達模式（圖5）。在干旱處理60 h、96 h 和復水3 d 3 個處理時間點，上調表達的基因數分別為25、19、3 個，下調表達的基因數分 別 為26、32、48 個。ZmWRKY1、ZmWRKY10、ZmWRKY16、ZmWRKY28、ZmWRKY30、ZmWRKY33、ZmWRKY42、ZmWRKY65、ZmWRKY68、ZmWRKY78、ZmWRKY96、ZmWRKY99、ZmWRKY100、ZmWRKY102和ZmWRKY111在干旱處理下，其表達量高于對照組，在復水處理后，其表達量低于對照組，說明這15個基因正向響應干旱脅迫。ZmWRKY87基因在干旱處理下下調表達，復水處理后，表達量高于對照組，是負向響應干旱脅迫基因。其他基因的表達模式無規(guī)律，如ZmWRKY15、ZmWRKY52、ZmWRKY103等。

圖5 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因的表達分析Fig.5 Expression analysis of differentially expressed WRKY genes in maize under drought-rewatering treatment

為驗證轉錄組數據的可靠性，隨機挑選了8 個WRKY 基因（ZmWRKY1、ZmWRKY16、ZmWRKY30、ZmWRKY34、ZmWRKY48、ZmWRKY68、ZmWRKY82、ZmWRKY102）進行qRT-PCR 分析。由圖6 可知，ZmWRKY1、ZmWRKY16、ZmWRKY30、ZmWRKY68、ZmWRKY102在干旱處理60 h 和96 h 條件下表達量上升，復水3 d 后表達量下降，正向響應干旱脅迫。其中，ZmWRKY1、ZmWRKY30、ZmWRKY68在3 個處理時間點下均達到顯著差異水平。ZmWRKY1、ZmWRKY16、ZmWRKY30、ZmWRKY34、ZmWRKY48、ZmWRKY68、ZmWRKY82、ZmWRKY102這8 個基因在3 個處理時間點的qRT-PCR 結果和轉錄組結果趨勢基本一致，進一步驗證了轉錄組結果的準確性。

圖6 干旱-復水處理下部分差異表達玉米WRKY基因的表達驗證Fig.6 Expression validation of partial differentially expressed WRKY genes in maize under drought-rewatering treatment

3 結論與討論

玉米是高需水、需肥作物，而我國玉米主產區(qū)大多都存在水資源不足問題，尤其是近年來全球氣候變暖，干旱導致玉米產量降低的問題日益突出。玉米生長發(fā)育進程中，經常處于干旱-濕潤-干旱的動態(tài)環(huán)境中，尤其是河南省夏季，雨量分配不均。夏玉米播種期或苗期，經常遭遇干旱，而生育中期或后期，降雨量偏多。適宜播期遇旱導致出苗較差，缺苗斷壟，苗期干旱導致發(fā)育受阻。因此，發(fā)掘抗旱基因，培育抗旱品種，提高玉米自身的抗旱能力對玉米生產的發(fā)展尤為重要。本研究在轉錄組結果分析的基礎上，鑒定篩選出響應干旱-復水處理的51 個差異表達的WRKY 基因。通過生物信息學分析發(fā)現，51 個WRKY 基因不均勻地分布在10條染色體上，部分基因存在片段復制關系，暗示著這些基因在玉米WRKY 基因家族進化中發(fā)揮重要作用[25]。進化樹分析結果顯示，51 個WRKY 基因分成了3 個組，與小麥、擬南芥[26]分類結果一致，進一步說明WRKY 轉錄因子家族具有平行進化關系。51 個玉米WRKY 基因的啟動子區(qū)域含有多個與植物激素和逆境脅迫相關的順式作用元件，如ABRE、TGACG-motif、TGA-element、LTR、MBS 等，進而更加證明WRKY 轉錄因子在植物逆境脅迫響應中起重要的調控作用。

逆境脅迫下，植物自身通過激活或抑制基因的表達來適應環(huán)境條件的變化，進而達到一種平衡。HU 等[27]研究發(fā)現，在超表達陸地棉GhWRKY1-like基因的擬南芥植株中，GhWRKY1-like 與ABA 生物合 成 所 必 需 的AtNCED2、AtNCED5、AtNCED6和AtNCED9基因啟動子的W-box 順式作用元件結合，促進這些靶基因的表達，從而提高植株的抗旱性。XIONG 等[3]研究發(fā)現，超表達文冠果XsWRKY20基因通過ABA 途徑提高煙草的抗旱性。本研究發(fā)現，在干旱-復水處理下，51 個玉米WRKY 基因呈現出不 同 的 表 達 模 式。ZmWRKY1、ZmWRKY10、ZmWRKY16、ZmWRKY28、ZmWRKY30、ZmWRKY33、ZmWRKY42、ZmWRKY65、ZmWRKY68、ZmWRKY78、ZmWRKY96、ZmWRKY99、ZmWRKY100、ZmWRKY102和ZmWRKY111這15 個正向響應干旱脅迫基因與1個負向響應干旱脅迫基因（ZmWRKY87）是今后深入研究ZmWRKY家族干旱脅迫響應的候選基因，可為玉米抗旱分子育種以及培育玉米新品種奠定基礎。