不同生長階段花羔紅點鮭和細鱗鮭腸道菌群結構差異分析

柳鵬，李玲雪，鄭偉，杜曉燕，閆春梅，劉慧吉，高春山

(吉林省水產(chǎn)科學研究院,吉林 長春 130033)

花羔紅點鮭Salvelinusmalma隸屬于鮭形目Salmoniformes鮭科Salmonidae紅點鮭屬Salvelinus，又名花麗羔子，其肉質鮮美、營養(yǎng)價值較高[1]，在中國僅分布于吉林省和黑龍江省，是一種珍稀名貴的冷水性魚類。細鱗鮭Brachymystaxlenok隸屬于鮭形目Salmoniformes鮭科Salmonidae細鱗魚屬Brachymystax,又名細鱗魚，是產(chǎn)于中國北方山地地區(qū)的大型名貴冷水性珍稀魚類，屬中國《國家重點保護野生動物名錄》Ⅱ級保護動物[2]。目前，國內(nèi)外對花羔紅點鮭和細鱗鮭的研究主要集中在生物學、養(yǎng)殖技術、營養(yǎng)生理學和營養(yǎng)免疫學等方面，有關其腸道菌群結構方面的研究尚未見報道。

腸道微生物在宿主生長發(fā)育過程中發(fā)揮著至關重要的作用，穩(wěn)定的腸道菌群結構有助于保護魚類免受病原微生物通過腸道入侵[3]，還可以促進宿主的免疫系統(tǒng)發(fā)育，輔助宿主營養(yǎng)吸收[4-5]。因此，了解魚類腸道菌群的演替和定植過程，對魚類腸道微生態(tài)系統(tǒng)平衡的調(diào)控具有重要意義。

花羔紅點鮭和細鱗鮭為同科珍稀名貴冷水性魚類，其生存環(huán)境與食性相似。近年來，長白山地區(qū)野生花羔紅點鮭和細鱗鮭數(shù)量逐漸減少，長白山周邊養(yǎng)殖場對兩種鮭進行了人工繁育、養(yǎng)殖。兩種鮭在同一流水環(huán)境下養(yǎng)殖，并投喂相同飼料，但其生長速度具有明顯差異。本研究中，通過MiSeq 16S rRNA高通量測序方法，分析了相同養(yǎng)殖環(huán)境下同科不同屬的花羔紅點鮭和細鱗鮭腸道菌群結構及其差異，以期為調(diào)控兩種鮭腸道菌群平衡，配制促進消化吸收和健康生長等功能性飼料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用花羔紅點鮭和細鱗鮭均采自吉林省臨江市金莎冷水魚養(yǎng)殖場。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取 在相同養(yǎng)殖條件下，挑選活力較好、體表完整無傷的1+齡、2+齡花羔紅點鮭各9尾，4+齡細鱗鮭9尾，用體積分數(shù)為75%的乙醇棉擦拭體表，無菌條件下取出整條腸道，再用體積分數(shù)為75%的乙醇棉擦拭腸道外壁，用滅菌手術剪剪開腸道，用解剖刀刮取腸道內(nèi)容物，每3尾魚腸道內(nèi)容物混合作為1個樣品。其中，花羔紅點鮭1+齡3個樣品分別記為HG11、HG12、HG13，2+齡3個樣品分別記為HG21、HG22、HG23，4+齡細鱗鮭3個樣品分別記為XL41、XL42、XL43(表1)，樣品于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 樣品信息Tab.1 Sample information

1.2.2 DNA提取及MiSeq 16S rRNA 高通量測序 按照Power Soil DNA Isolation Kit說明書提取樣品DNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法檢測提取得到的DNA質量和濃度，質檢合格的樣品于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

用引物338F(5′ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 3′)和806R(5′GGACTACNNGGGTATCTAAT 3′)擴增細菌16Sr RNA基因的V3～V4區(qū)。使用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的目的條帶大小，再用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。用PCR產(chǎn)物構建微生物多樣性測序文庫，由北京奧維森基因科技有限公司使用Illumina Miseq PE300高通量測序平臺進行Paired-end 測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Vsearch 2.7.1軟件的Uparse算法對優(yōu)質序列進行OTU聚類(operational taxonomic units)，相似性閾值為97%。將OTU聚類結果使用RDP Classifier算法與Silva128數(shù)據(jù)庫進行比對，得到每個OTU對應的物種分類信息。再利用QIIME1 1.8.0軟件進行α多樣指數(shù)分析(包括Shannon、Simpson 和Chao1等指數(shù))?；谖锓N注釋及相對豐度結果，使用R 3.6.0軟件進行物種組成柱狀圖分析。使用Phython 2.7軟件進行LefSe分析[6]。

2 結果與分析

2.1 稀釋性曲線

從圖1可見，測序條數(shù)在30 000以下時，隨著測序條數(shù)的增加，花羔紅點鮭和細鱗鮭的腸道內(nèi)容物中有大量的菌群被發(fā)現(xiàn)。測序條數(shù)在30 000之后，曲線基本保持平直，更多的測序數(shù)據(jù)量對發(fā)現(xiàn)新的OTUs貢獻較小，說明此次測序結果基本覆蓋了花羔紅點鮭和細鱗鮭腸道內(nèi)容物的菌群。

圖1 樣品稀釋性曲線Fig.1 Sample dilution curve

2.2 兩種鮭腸道菌群多樣性差異分析

從表2可見：9個樣品的觀測深度值均大于0.99，說明本次測序結果能夠代表樣本中菌群的真實情況；采用Chao1指數(shù)衡量物種豐富度差異，HG11樣品中的Chao1值最大，說明其腸道內(nèi)容物中菌種種類最多，HG22樣品中的Chao1值最小，說明其腸道內(nèi)容物中菌種種類較少；采用PD-whole-tree和Shannon指數(shù)衡量物種多樣性時，HG11樣品中的PD-whole-tree值最大，HG12樣品中的Shannon值最大，說明HG11、HG12腸道菌群多樣性較高。

表2 不同樣品的Alpha多樣性指數(shù)Tab.2 Alpha diversity indices of different samples

綜合3種指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，4+齡細鱗鮭腸道中菌群多樣性介于1+齡和2+齡花羔紅點鮭之間。

2.3 兩種鮭腸道菌群組成差異分析

從圖2(a)可見：在門水平上，H1組優(yōu)勢菌群依次為柔膜菌門Tenericutes(占47.5%)、變形菌門Proteobacteria(占34.4%)、厚壁菌門Firmicutes(占4.1%)、螺旋菌門Spirochaetae(占3.8%)和放線菌門Actinobacteria(占2.4%)；H2組優(yōu)勢菌群依次為柔膜菌門(占55.8%)、放線菌門(占25.6%)、變形菌門(占10.3%)、螺旋菌門(占3.8%)和厚壁菌門(占3.0%)；X4組優(yōu)勢菌群依次為厚壁菌門(占57.3%)、變形菌門(占32.1%)、藍藻門Cyanobacteria(占4.2%)、放線菌門(占2.2%)和柔膜菌門(占2.2%)。表明在門水平上，同種鮭優(yōu)勢菌群種類相同，但豐度不同；不同種鮭優(yōu)勢菌群種類不同，豐度亦不相同。

從圖2(b)可見：在屬水平上，H1組優(yōu)勢菌群為支原體屬(占47.5%)，H2組優(yōu)勢菌群為支原體屬Mycoplasma(占55.8%)，X4組優(yōu)勢菌群為芽孢桿菌屬Bacillus(占35.9%);一些未確定的菌群在花羔紅點鮭和細鱗鮭腸道中的占比僅次于優(yōu)勢菌群。表明在屬水平上，同種鮭優(yōu)勢菌群種類相同，但豐度不同;不同種鮭優(yōu)勢菌群種類不同。

圖2 各組樣品門、屬水平菌群組成分析Fig.2 Analysis of the bacterial composition of samples in each group on the phylum and genus levels

2.4 PCA分析

從圖3可見：第三象限板塊中花羔紅點鮭H1組一個樣品和H2組全部樣品的腸道菌群群落形成一個組群，說明這些樣品腸道菌群群落結構差異較??；第四象限板塊中只包含細鱗鮭X4組樣品；第一象限、第二象限分別有花羔紅點鮭H1組的一個樣品。表明同種魚類腸道菌群群落結構比較接近，但個體間存在差異；不同種魚類腸道菌群群落結構存在明顯差異。

圖3 PCA分析圖Fig.3 PCA analysis chart

2.5 LefSe分析

基于LefSe分析發(fā)現(xiàn)：Solibacteres綱、Solibacteracae subgroup 3科和JTB255 marine benthic group科菌在H1組中的豐度與H2、X4組有顯著性差異(P<0.05);Firmicutes門、Bacilli綱、Sporomusa屬和Sporacetigenium屬菌在X4組中的豐度與H1、H2組有顯著性差異(P<0.05)(圖4、圖5)。

圖4 基于分類信息LefSe分析的LDA分布柱狀圖Fig.4 Histogram of LDA distribution based on LefSe analysis of classification information

圖5 基于分類信息LefSe分析的進化分枝圖Fig.5 Evolutionary branch diagram of LefSe analysis based on classification information

3 討論

3.1 兩種鮭腸道菌群種類豐度及多樣性差異分析

OTU數(shù)量可反映魚類腸道內(nèi)容物菌群的豐富度。李存玉[7]對池塘養(yǎng)殖大菱鲆Paralichthysolivaceus腸道菌群分析發(fā)現(xiàn)，其腸道內(nèi)容物OTU總數(shù)為367。黃麗麗等[8]對哲羅鮭Huchotaimen、細鱗鮭和黑斑狗魚Esoxreicherti3種新疆冷水魚腸道菌群分析發(fā)現(xiàn)，這3種魚腸道內(nèi)容物OTU總數(shù)為242。徐晟云等[9]對不同環(huán)境的鱧Channamaculate腸道菌群群落結構研究顯示，鱧腸道內(nèi)容物樣品OTU總數(shù)為585。與上述魚類相比，本研究中，花羔紅點鮭和細鱗鮭OTU總數(shù)分別為3 896和1 675，表明花羔紅點鮭和細鱗鮭腸道菌群物種豐富度很大，這可能是因為生存的水環(huán)境不同,導致魚類腸道菌群的數(shù)量和群落結構不同。今后筆者將通過對養(yǎng)殖水環(huán)境微生物進行測序分析，了解這兩種魚腸道菌群結構與其生存水環(huán)境中微生物結構的關系。

本研究中，Alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn)，1+齡花羔紅點鮭腸道菌群多樣性高于2+齡，這可能是隨著年齡增長，魚體機能不斷完善，菌群在腸道定植完成的結果。細鱗鮭腸道菌群多樣性介于1+齡和2+齡花羔紅點鮭之間，這可能是因為細鱗鮭與花羔紅點鮭同為鮭科冷水魚，且兩種鮭取自同一養(yǎng)殖場，其養(yǎng)殖環(huán)境相同所致。也暗示了品種和養(yǎng)殖環(huán)境對魚類腸道菌群多樣性影響較大。

3.2 兩種鮭腸道優(yōu)勢菌群組成差異分析

魚類腸道中主要的細菌為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門[10-14]。本研究中，花羔紅點鮭和細鱗鮭優(yōu)勢菌門(厚壁菌門、變形菌門和放線菌門)均為魚類腸道主要的細菌門類。通常情況下，淡水魚消化道中常見的細菌屬有氣單胞菌屬Aeromonas、鄰單胞菌屬Plesiomonas、腸桿菌屬Enterobacter和假單胞菌屬Pseudomonas等，而海水魚消化道中常見的則有弧菌屬Vibrio、假單胞菌屬和不動桿菌屬Acinetobacter等[15]。本研究中，花羔紅點鮭優(yōu)勢菌屬為支原體屬，細鱗鮭優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬，這與淡水魚腸道中常見的菌群不同，表明魚類腸道菌群結構因品種和養(yǎng)殖環(huán)境不同而有所差異。

在養(yǎng)殖大菱鲆[7]、鰱Hypophthalmichthysmolitrix、鯽Carassiusauratus、鯉Cyprinuscarpio和草魚Ctenopharyngodonidellus[16]腸道中均發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌屬。近年來，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上芽孢桿菌屬作為益生菌被廣泛使用，其產(chǎn)生的消化酶可促進養(yǎng)殖產(chǎn)品的消化功能，還可分泌抑菌物質，提高養(yǎng)殖動物的免疫力[17]。馮雪等[18]對草魚和異育銀鯽Carassiusauratusgibelio腸道產(chǎn)消化酶細菌的研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌可分泌胞外消化酶。Boonthai等[19]對黑虎蝦Penaeusmonodon的攻毒試驗表明，芽孢桿菌能提高黑虎蝦的免疫力，從而提高蝦的存活率。由此可見，芽孢桿菌屬在細鱗鮭體內(nèi)可能有分泌胞外消化酶、提高魚體免疫力的作用，可作為益生菌添加在細鱗鮭的人工飼料中，提高細鱗鮭的養(yǎng)殖效益。

支原體屬是隸屬于柔膜菌綱Tenericutes的革蘭氏陰性菌[20-21]，是能夠在宿主之外進行自我復制的最小生命體，廣泛存在于從植物到高等動物的各種生命體中[22]。有研究報道，在養(yǎng)殖及野生大馬哈魚Oncorhynchusketa腸道中首次發(fā)現(xiàn)支原體屬菌的存在且占主要成分[23]，之后在長嘴蝦虎魚Gillichthysmirabilis[24]、東海帶魚Trichiurusspp.[25]和養(yǎng)殖大菱鲆[26]等魚類腸道中均發(fā)現(xiàn)了支原體屬菌的存在。雖然過去一直認為支原體菌具有致病性，但是近年來研究發(fā)現(xiàn)，支原體屬菌在某些魚類中是其腸道正常菌群的一部分，并在魚類生理和健康中發(fā)揮著未知的作用。本研究中，花羔紅點鮭腸道內(nèi)容物優(yōu)勢菌屬為支原體屬，但其是否具有致病性及發(fā)揮特定的作用，均需進一步研究。

3.3 兩種鮭腸道菌群的群落結構差異分析

Li等[27]研究表明，相同飼養(yǎng)環(huán)境下，鰱、草魚、鳙Aristichthysnobilis和團頭魴Megalobramaamblycephala4種不同魚類腸道主要菌群的群落結構組成差異顯著。對白鱘Psephurusgladius和花鰱幼魚的研究表明，盡管這兩種魚養(yǎng)殖在相同的魚塘，且攝食相似的浮游生物，但實際檢測到其腸道菌群存在種類特異性，白鱘的腸道菌群多樣性明顯低于花鰱[28]。本研究中發(fā)現(xiàn)，相同養(yǎng)殖環(huán)境下，不同年齡花羔紅點鮭腸道菌群的群落結構總體上比較接近，但與細鱗鮭腸道菌群的群落結構有差異，這表明魚類腸道菌群結構會隨宿主種類發(fā)生變化。

本研究中，對組間豐度有顯著差異的物種進行分析發(fā)現(xiàn)，H1組JTB255 marine benthic group科豐度顯著高于其他組,X4組鼠孢菌屬顯著高于其他組。有研究表明，JTB255 marine benthic group是深海表層沉積物中微生物群落的普遍核心成員[29]，其在花羔紅點鮭中的功能尚不可知。鼠孢菌屬是產(chǎn)乙酸型細菌屬[30]，田璐[31]研究鹽度對黃姑魚Nibeaalbiflora生存、生長、非特異性免疫及腸道菌群的影響時發(fā)現(xiàn)，鼠孢菌屬在鹽度為42試驗組中的豐度顯著高于對照組。這表明鼠孢菌屬可能與魚體所處水體環(huán)境的鹽度有關，其在細鱗鮭中的具體作用機制有待進一步研究。

4 結論

1)相同養(yǎng)殖環(huán)境下，同種魚類腸道內(nèi)容物微生物菌群結構相似，不同種魚類腸道內(nèi)容物微生物菌群結構差異較大。

2)芽孢桿菌屬可作為益生菌添加到細鱗鮭人工飼料中。