轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)組學分析熱空氣處理對桃果實采后冷藏期間糖酸和酚類物質(zhì)代謝的影響

周丹丹，李婷婷，吳彩娥，屠 康

（1.南京林業(yè)大學輕工與食品學院，江蘇 南京 210037；2.南京農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095）

水蜜桃屬于呼吸躍變型果實，采收多集中于高溫高濕的夏季，常溫貯藏過程中受病菌侵染易腐敗變質(zhì)，造成品質(zhì)嚴重劣變。桃果實采后極不耐貯，嚴重限制了桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。低溫有利于延緩桃果實后熟過程，但桃屬于冷敏型果實，低溫貯藏易發(fā)生冷害，從而引起一系列生理生化和品質(zhì)變化，如果實風味變淡、可溶性糖和有機酸含量下降、果肉木質(zhì)化、組織發(fā)生褐變等，影響了果實的正常后熟。采后處理技術等外界因素對果實品質(zhì)具有重要影響，因此，研究釆后保鮮技術對桃果實生理代謝的影響具有重要意義。

熱空氣（hot air，HA）處理指將樣品置于35～50 ℃環(huán)境中進行短時處理，目前已廣泛應用于果蔬的采后貯藏保鮮中。HA處理可以有效延緩果實的成熟衰老，抑制果實的腐敗變質(zhì)，提高果實的抗冷性，延長果實的貨架期。研究表明，HA處理可以通過增強熱激蛋白的表達量協(xié)同提高果實細胞膜的流動性和完整性，從而提高果實的抗冷害能力。同時，HA處理能夠誘導果實次級代謝物的合成和抗氧化酶的活性，激活植物組織的抗病性，從而提高果蔬的抗病能力。

轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組研究可以鑒定基因/蛋白的功能、探索基因/蛋白的調(diào)控過程、鑒定差異基因/蛋白，為探索果實采后生理變化的機理提供有利的工具，目前已在番茄、桃、葡萄、黃皮、石榴和馬鈴薯等果蔬中廣泛應用?？紤]到HA處理激發(fā)桃果實多條代謝途徑的復雜性，本研究采用轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學研究HA處理對桃果實采后糖酸和酚類物質(zhì)代謝的影響，以期從基因水平和蛋白水平揭示HA處理對桃果實采后冷藏過程中的分子調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘霞暉8號’水蜜桃采自江蘇省農(nóng)科園，選取開花后110 d左右的商業(yè)成熟期桃果實于當天采收立即運回實驗室，挑選大小一致，著色均勻，成熟度一致且無病蟲害和機械損傷的果實作為實驗對象（720 個果實），于4 ℃環(huán)境下預冷過夜。

葡萄糖、果糖、蔗糖、檸檬酸、蘋果酸（標品）上海源葉生物科技有限公司；乙腈（色譜純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

CTHI-250B恒溫恒濕箱 施都凱儀器設備（上海）有限公司；BGISEQ-500通用測序儀 深圳華大基因股份有限公司；ABI 7500型定量聚合酶鏈式反應核酸擴增儀 美國Applied Biosystems公司；LC 20AB高效液相色譜 日本島津公司；UltiMate 3000超高效液相色譜、Q Exactive HF X串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國賽默飛公司。

1.3 方法

1.3.1 桃果實分組與處理

熱空氣（HA）組：將桃果實置于聚乙烯（polyethylene，PE）保鮮袋中后于40 ℃、相對濕度90%～95%的恒溫恒濕箱中處理4 h。

對照（CK）組：將桃果實置于PE保鮮袋中后于20 ℃，相對濕度90%～95%的恒溫恒濕箱中處理4 h。

將上述處理后的桃果實于（1±1）℃冷庫中貯藏35 d，每隔7 d取樣進行指標（可溶性糖、有機酸、總酚、總黃酮、花色苷含量）測定。實驗每組處理設置3 個平行，每個平行包含20 個果實，整個實驗重復3 次。將貯藏至第0、7、21、35天的樣品用于轉(zhuǎn)錄組分析，將貯藏至第0、7、35天的樣品用于蛋白質(zhì)組分析。

1.3.2 可溶性糖和有機酸含量測定

桃果實糖酸含量的測定參考Yu Lina和Tang Mi等的方法并稍作修改。取5 g桃果肉樣品充分研磨，加入30 mL蒸餾水充分溶解，在80 ℃的水浴鍋中采用超聲波提取1 h。將上述樣品8 000×離心10 min后取上清液并用0.45 μm水系濾膜過濾備用。

可溶性糖含量測定：色譜柱為碳水化合物柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為40 ℃，流動相為體積分數(shù)75%乙腈溶液，流速為1 mL/min，采用配有蒸發(fā)光散射檢測器檢測。

有機酸含量測定：色譜柱為Atlantis T3柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為40 ℃，流動相為磷酸二氫鉀（20 mmol/L，pH 2.5），流速為0.6 mL/min。根據(jù)光電二極管陣列檢測器的掃描模式，在210 nm波長處對果實有機酸組分進行檢測。

通過與相應標準品的保留時間比較，對糖和有機酸進行定性和定量，每種化合物含量的單位為mg/g。樣品測定設置3 個重復，每個重復進行3 次平行測定。

1.3.3 總酚和總黃酮含量測定

總酚含量測定采用福林-酚法，以沒食子酸為標準物質(zhì)繪制標準曲線?？傸S酮含量采用NaNO-Al(NO)-NaOH比色法測定，以蘆丁為標準品繪制標準曲線。總酚含量和總黃酮含量單位為mg/g。樣品測定設置3 個重復，每個重復設置3 次平行測定。

1.3.4 花色苷含量測定

桃果實總花色苷含量的采用pH值示差法進行測定，花色苷含量單位為μg/g。樣品測定設置3 個重復，每個重復設置3 次平行測定。

1.3.5 轉(zhuǎn)錄組測序檢測

1.3.5.1 總RNA的提取與cDNA建庫

采用植物總RNA提取試劑盒提取桃RNA，經(jīng)過凝膠電泳和Nanodrop超微量分光光度計測定吸光度以檢測RNA的完整性和濃度，檢測合格的RNA由華大基因通過BGISEQ-500平臺進行測序，構(gòu)建cDNA文庫。每個取樣點樣品分別設置3 個重復。

1.3.5.2 測序數(shù)據(jù)過濾和比對

使用過濾軟件SOAPnuke進行統(tǒng)計，過濾去除低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的reads。得到clean reads后將其比對到參考基因組序列（NCBI_Prunus_persica_NCBIv2），之后再使用FPKM計算基因和轉(zhuǎn)錄本的表達水平。

1.3.5.3 差異表達基因的鑒定

基因表達量采用FPKM值表示，顯著差異表達基因的篩選條件為差異倍數(shù)兩倍以上（即|logFC|＞1）并且≤0.001。

1.3.5.4 差異表達基因的GO分析和京都基因與基因組百科全書分析

使用R軟件中的phyper函數(shù)進行富集分析，計算值，然后進行錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）校正，通常≤0.05的功能視為顯著富集。根據(jù)基因本體（gene ontology，GO）注釋結(jié)果及官方分類，將差異基因進行功能分類。根據(jù)京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）注釋結(jié)果以及官方分類，將差異基因進行生物通路分類。

1.3.5.5 差異表達基因?qū)崟r熒光定量聚合酶鏈式反應分析

隨機選取9 個差異表達的基因進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）分析，利用NCBI數(shù)據(jù)庫查找桃果實相關基因的CDS序列，利用Primer 5.0軟件設計引物（表1），qPCR采用AceQqPCR SYBRGreen Master Mix試劑盒，使用ABI 7500 PCR系統(tǒng)，采用兩步法反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸34 s，共40 個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析以作為內(nèi)參基因，采用2法進行基因相對定量計算。每組處理重復3 次。

表1 qPCR引物設計列表Table 1 Primers used for real time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis

1.3.6 蛋白質(zhì)組學分析

1.3.6.1 蛋白質(zhì)的提取與酶解分離

桃果肉加入2 mL Lysis Buffer 3（含1 mmol/L的苯甲磺酰氟和2 mmol/L的乙二胺四乙酸），渦旋振蕩后靜置5 min，添加0.5 mL 10 mmol/L的二硫蘇糖醇后振蕩2 min。樣品25 000×離心20 min，取上清液加入0.5 mL 10 mmol/L二硫蘇糖醇，56 ℃水浴1 h后加入0.2 mL 55 mmol/L碘乙酰胺暗室靜置45 min。加入4 倍體積冷丙酮，-20 ℃靜置2 h，樣品25 000×離心20 min，向沉淀中加入適量的Lysis Buffer 3，然后超聲處理使沉淀溶解后25 000×離心20 min，取上清液，進行蛋白濃度定量。利用Bradford法和聚丙烯酰胺凝膠電泳法對提取的蛋白質(zhì)進行定量。將符合質(zhì)量要求的蛋白質(zhì)采用胰蛋白酶酶解，將酶解后的肽段利用Strata X柱進行除鹽后取樣品進行分離，采用LC-20AB液相色譜系統(tǒng)，分離柱為Gemini C柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）對樣品進行分離，于214 nm波長處監(jiān)測洗脫峰并分別收集組分，然后凍干。每個取樣點樣品分別設置3 個重復。

1.3.6.2 數(shù)據(jù)依賴采集模式建庫和數(shù)據(jù)非依賴采集定量檢測

將肽段樣品用流動相A（2%乙腈、0.1%甲酸）復溶，20 000×離心10 min后，取上清液通過UltiMate 3000超高效液相色譜儀進行分離。樣品進入trap柱富集并除鹽，隨后與自裝C柱串聯(lián)，以300 nL/min流速通過如下條件進行分離：0～5 min，5%流動相B（98%乙腈、0.1%甲酸）；5～120 min，5%～25%流動相B；120～160 min，25%～35%流動相B；160～170 min，35%～80%流動相B；170～175 min，80%流動相B；175～10 min，5%流動相B。

數(shù)據(jù)依賴采集模式（data independent acquisition，DDA）檢測：經(jīng)過液相分離的肽段離子化后進入到串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測。參數(shù)設置：離子源電壓1.9 kV；一級質(zhì)譜掃描范圍350～1 500/；分辨率為120 000；二級質(zhì)譜起始/固定為100；分辨率30 000。二級碎裂的母離子：電荷2到6。離子碎裂模式為HCD，碎片離子在Orbitrap質(zhì)譜儀中進行檢測。

數(shù)據(jù)非依賴采集（data independent acquisition，DIA）檢測：離子源電壓設置為1.9 kV；一級質(zhì)譜掃描范圍/400～1 250；分辨率設置為120 000；最大離子注入時間50 ms；將/400～1 250均分為50 個窗口進行連續(xù)窗口碎裂及信號采集。離子碎裂模式為HCD，碎片離子在Orbitrap質(zhì)譜儀中進行檢測。

1.3.6.3 質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定與分析

將滿足FDR≤1%的信息用于建立最終的譜圖庫，以差異倍數(shù)≥1和＜0.01作為顯著性差異的標準進行差異表達蛋白篩選，同時對差異表達蛋白進行GO富集分析（http://www.geneontology.org）和KEGG通路（http://www.genome.jp/）功能注釋分析。基于定量結(jié)果，完成不同比較組差異表達蛋白的查找，最后進行相應差異富集蛋白的功能分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2013軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用SAS 9.2軟件Duncan多重比較法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HA處理對桃果實糖酸、總酚、總黃酮含量和花色苷含量的影響

如表2所示，共檢測到3 種可溶性糖，分別為蔗糖、葡萄糖和果糖，其中蔗糖的含量最高。不同處理組隨著貯藏時間的延長，蔗糖含量呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，而葡萄糖和果糖含量呈現(xiàn)明顯上升的趨勢。與CK組相比，HA處理顯著抑制了桃蔗糖含量的下降（＜0.05），并抑制了果糖和葡萄糖含量的上升，這與Yu Lina等的研究結(jié)果是一致的。檸檬酸和蘋果酸是桃果實中的主要有機酸，不同處理組2 種有機酸隨著貯藏時間的延長整體呈現(xiàn)下降的趨勢，其中CK組檸檬酸含量下降了0.17 mg/g，蘋果酸含量下降了0.41 mg/g。與CK組相比，HA處理可在第7、14、28、35天顯著抑制檸檬酸含量的下降（＜0.05）。經(jīng)過HA處理14～35 d后桃果實蘋果酸的含量顯著高于CK組（＜0.05）。Chen Ming等研究表明HA處理可以顯著抑制椪柑果實檸檬酸和蘋果酸含量的下降。總酚含量和總黃酮含量整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，CK組和處理組桃果實總酚含量于貯藏第21天達到最大值，分別為0.80 mg/g和1.07 mg/g，CK組總黃酮含量于貯藏第14天達到最大值（1.43 mg/g），而處理組總黃酮含量于第21天達到最大值，為1.93 mg/g。與對照組相比，HA處理顯著提高桃果實總酚含量和總黃酮含量，這與Wei Yingying等的研究結(jié)果一致。對照組桃果實花色苷含量變化比較穩(wěn)定，而HA處理組花色苷含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，HA處理顯著提高了桃果實花色苷含量。Zhou Dandan等研究結(jié)果表明，HA處理可顯著提高桃果肉花色苷含量不僅與苯丙烷代謝途徑關鍵酶活力有關，同時與果實中可溶性糖和有機酸含量密切相關。研究表明，蔗糖、葡萄糖和果糖與果實花色苷的合成呈現(xiàn)正相關性，糖不僅是合成花色苷重要的前體物質(zhì)，也是調(diào)節(jié)花色苷合成的重要信號物質(zhì)。Liu Xiaojuan等研究表明，蔗糖可以通過調(diào)控和轉(zhuǎn)錄因子，從而促進蘋果花色苷的積累和果實色澤形成。有機酸含量決定了果實液泡內(nèi)pH值的變化，花色苷以陽離子的形式存在于果實液泡內(nèi)，顏色隨液泡中的pH值改變而變化。Noro等研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸和蘋果酸是蘋果花色苷合成的潛在刺激物。本研究表明，HA處理顯著提高桃果肉花色苷的含量與蔗糖、檸檬酸含量和蘋果酸含量密切相關，HA處理可以通過抑制桃果實蔗糖、檸檬酸和蘋果酸的降解從而提高花色苷的含量。

表2 HA處理對桃果實可溶性糖、有機酸和酚類物質(zhì)含量的影響Table 2 Effect of HA treatment on the contents of soluble sugars,organic acids and phenolic compounds in peach fruit

2.2 轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果

2.2.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量

對桃果實測序后進行統(tǒng)計，總共獲得了518.05 Mb 個原始的reads片段，過濾后的clean reads片段為478.02 Mb 個，包含了47.81 Gb 個堿基數(shù)。其中過濾后質(zhì)量不低于20的reads比例大于97%，不低于30的reads比例約為90%。由此可以看出，測序質(zhì)量較好，可以滿足后續(xù)數(shù)據(jù)組裝及處理的要求。同時，利用qPCR驗證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準確性，由圖1可知，qPCR檢測的9 個基因的相對表達量與轉(zhuǎn)錄組檢測的FPKM值具有較高的相關性，的最低值為0.795 1，最高值0.975 9，說明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)可靠性較高。

圖1 基因表達量的qPCR驗證分析Fig. 1 qPCR validation analysis of gene expression

2.2.2 差異表達基因的篩選

桃果實采后貯藏期間差異表達基因數(shù)量如圖2所示。以采收當天的桃果實（CK0）為對照，分析不同貯藏時間下的差異表達基因。由圖2A可知，隨著貯藏時間的延長，差異表達基因的數(shù)量不斷上升，CK0 vs CK7、CK0 vs CK21、CK0 vs CK35 3 組差異基因總數(shù)分別為8 182、11 345、11 884 個。且隨著貯藏時間的延長，下調(diào)差異基因總數(shù)始終高于上調(diào)差異基因總數(shù)，其中CK0 vs CK7、CK0 vs CK21和CK0 vs CK35分別有3 059、3 257 個和3 721 個基因上調(diào)，有5 123、8 088 個和8 163 個基因下調(diào)。圖2B為同一貯藏時間下CK組與HA處理組差異表達基因的數(shù)量，隨著貯藏時間的延長，CK組與HA處理組差異基因表達總數(shù)逐漸減少，CK7 vs HA7、CK21 vs HA21和CK35 vs HA35分別為2 424、2 287 個和746 個。貯藏前期（7 d），HA處理下調(diào)表達的差異基因數(shù)量高于上調(diào)的差異基因數(shù)量，但是在貯藏中期（21 d）和貯藏后期（35 d），HA處理上調(diào)的差異基因數(shù)量高于下調(diào)的差異基因數(shù)量。

圖2 桃果實貯藏過程中差異表達基因數(shù)量（A）和HA處理與對照組差異表達基因數(shù)量（B）Fig. 2 Number of DEGs in control group among storage times (A) and number of DEGs between HA treated and control groups (B)

2.2.3 差異表達基因GO功能分析結(jié)果

將上述差異基因進一步進行GO功能分析，主要分為貯藏期間差異基因GO分析以及CK組和HA處理組差異基因GO分析。這些GO信息被進一步被歸納為基因的分子功能、細胞組分、生物學過程3大類。圖3為對照組與HA組差異基因的GO分析結(jié)果，主要對比了CK7 vs HA7、CK21 vs HA21和CK35 vs HA35。由圖3可知，對于生物進程中，差異基因主要聚集于細胞代謝過程、生物調(diào)控、刺激響應和代謝過程這4 個亞類中。對于細胞組分歸類中，差異基因主要聚集于細胞、細胞膜、細胞膜組分和細胞器這4 個亞類中。對于分子功能，差異基因主要聚集于結(jié)合功能和催化活性這2 個亞類中。

圖3 桃果實HA組和對照組差異表達基因GO功能分類Fig. 3 Gene ontology (GO) term assignment of DEGs between control and HA-treated groups

2.2.4 差異表達基因代謝通路富集

通過KEGG通路分析可以進一步了解相關基因的生物功能和相互間的作用。KEGG分類主要包括6大類，分別為細胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、代謝和有機體系統(tǒng)。圖4為CK組和HA處理組差異基因的KEGG富集分析。CK組和HA處理組的差異基因在KEGG數(shù)據(jù)庫中共映射到20 個不同的代謝通路。在6 個分類中，CK組和HA處理組差異基因在代謝中占比最多，其次為遺傳信息處理。在代謝這一分類中，差異基因主要集中在總概，其次為碳水化合物代謝、次級產(chǎn)物代謝、氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝。在遺傳信息處理分類中，差異基因主要聚集在翻譯、折疊、分類和降解。此外HA處理組和CK組差異基因在信號轉(zhuǎn)導途徑中占比也較多。

圖4 桃果實HA組和CK組差異表達基因KEGG代謝途徑分類分析Fig. 4 KEGG classification of DEGs between control and HA-treated groups

2.2.5 參與調(diào)控糖酸和酚類物質(zhì)代謝的差異基因

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，對集中于糖酸代謝和酚類物質(zhì)代謝的差異基因的表達量進行了進一步的分析。圖5為參與調(diào)控果實可溶性糖、有機酸和酚類物質(zhì)代謝的差異表達基因。

圖5 參與桃果實糖代謝（A）、有機酸代謝（B）和酚類物質(zhì)代謝（C）的差異表達基因Fig. 5 DEGs involved in the metabolisms of soluble sugars (A), organic acids (B) and phenols (C) in peach fruit

如圖5A所示，共檢測到22 個參與調(diào)控桃果實糖代謝的差異表達基因，差異基因主要為、、、I、、和。蔗糖合酶（sucrose synthase，SS）和蔗糖磷酸合酶（sucrose phosphate synthase，SPS）可以促進葡萄糖和果糖轉(zhuǎn)化為蔗糖，而蔗糖可在轉(zhuǎn)化酶的催化下降解生成葡萄糖和果糖；己糖激酶（hexokinase，HK）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）和磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）參與果實糖酵解途徑，與果糖和葡萄糖的磷酸化反應密切相關。貯藏前期，HA處理上調(diào)了、、、基因的表達量，其logFC均大于1；貯藏中后期，HA處理上調(diào)了基因的表達量。同時，HA處理抑制了桃果實和基因的表達量，其logFC均小于1。Yu Lina等研究表明，HA處理可以抑制桃蔗糖含量的降解主要與低表達量的和基因密切相關，同時HA處理抑制了葡萄糖和果糖含量的上升與高表達量的和密切相關。與上述結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)HA處理可以通過抑制和基因的表達，提高、和基因的表達，從而抑制了蔗糖的降解并抑制了葡萄糖和果糖的合成。

如圖5B所示，共檢測到29 個參與桃有機酸代謝的差異基因，主要參與蘋果酸和檸檬酸的代謝，差異基因主要為、、、、、和?？梢源呋瘷幟仕岬暮铣?，而和促進檸檬酸的降解，和參與檸檬酸的轉(zhuǎn)運。和參與果實蘋果酸的合成，而促進了蘋果酸的降解。貯藏前期，HA處理提高了桃果實、、、和基因的表達量，同時HA處理顯著抑制了、和基因的表達量。以上結(jié)果表明，HA處理通過提高桃果實、和基因的表達量，并抑制基因的表達量從而抑制桃果實檸檬酸含量的下降。對于蘋果酸代謝的影響，HA處理通過上調(diào)和的表達量，并抑制基因的表達，從而抑制桃蘋果酸含量的下降。

參與調(diào)控酚類物質(zhì)代謝的差異基因共檢測到24 個，主要集中于苯丙烷代謝途徑中，差異基因主要為、、、、、、、、和。、、可以催化果實苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為酚酸類物質(zhì)，后經(jīng)過、和進一步催化生成黃酮類和黃烷醇類物質(zhì)，、和參與果實花色苷的合成，促進果實顏色的積累。本研究表明HA處理上調(diào)酚類代謝相關基因的表達量，尤其是在貯藏的前期。對、、和基因表達量影響較為顯著，logFC均大于2。以上結(jié)果表明，HA處理可以通過調(diào)控基因的表達量從而促進桃果實苯丙氨酸向酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時通過上調(diào)、、和基因的表達量從而提高果實黃酮類物質(zhì)的含量，最后通過提高、和基因的表達量，從而促進桃果實花色苷的合成。

2.3 蛋白質(zhì)組學分析結(jié)果

2.3.1 差異表達蛋白的篩選

桃果實采后貯藏期間差異表達蛋白數(shù)量如圖6所示。以采收當天的桃果實為對照，分析了不同貯藏時間下的差異表達蛋白。由圖6A可知，隨著貯藏時間的延長，差異表達蛋白的數(shù)量不斷上升，CK0 vs CK7組和CK0 vs CK35組的差異表達蛋白總數(shù)分別為160 個和951 個。在貯藏前期，上調(diào)蛋白數(shù)量和下調(diào)蛋白數(shù)量基本相等，貯藏后期，下調(diào)蛋白數(shù)量明顯高于上調(diào)蛋白的數(shù)量。圖6B為同一貯藏時間下CK組與HA處理組差異蛋白的數(shù)量，隨著貯藏時間的延長，CK組與HA處理組差異表達蛋白總數(shù)逐漸減少，CK0 vs HA7組和CK0 vs HA35組分別為401 個和339 個。貯藏前期和貯藏后期，HA處理下調(diào)表達的差異表達蛋白數(shù)量高于上調(diào)的差異表達蛋白的數(shù)量。

圖6 桃果實貯藏過程中差異表達蛋白數(shù)量（A）和HA處理與CK組差異表達蛋白數(shù)量（B）Fig. 6 Number of DEPs in control group among storage times (A) and number of DEGs between HA treated and control groups (B)

2.3.2 差異表達蛋白GO功能分析結(jié)果

將CK組與HA處理組差異基因進行GO功能分析，這些GO信息被進一步歸納為基因的分子功能、細胞組分、生物學過程3大類。圖7為CK組與HA處理組差異表達蛋白的GO功能分析結(jié)果，主要對比了CK7 vs HA7和CK35 vs HA35。在3大類中，CK組和HA處理組差異表達蛋白數(shù)量在生物學過程中最多，其次為細胞組分，分子功能中差異表達蛋白數(shù)量最少。在43 個亞類中，細胞代謝過程、代謝過程、細胞、細胞組分、結(jié)合和催化活性中差異表達蛋白數(shù)量較多。

圖7 桃果實HA組和對照組差異表達蛋白GO功能分類分析Fig. 7 Gene ontology (GO) term assignment of DEPs between control and HA-treated groups

2.3.3 差異表達蛋白代謝通路富集

KEGG分類主要包括細胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、代謝和有機體系統(tǒng)6大類。CK組和HA處理組差異表達蛋白的KEGG富集分析如圖8所示。CK組和HA處理組的差異表達蛋白共映射到20 個不同的代謝通路。在6 個分類中，代謝中差異基因的占比最多，差異表達蛋白主要參與了碳水化合物代謝、其他次級產(chǎn)物代謝、氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝等代謝途徑。差異表達蛋白在遺傳信息處理分類中占比也較多，主要集中在翻譯、折疊、分類和降解。

圖8 桃果實HA組和CK組差異表達蛋白KEGG代謝途徑分類Fig. 8 KEGG classification of DEPs between control and HA-treated groups

2.3.4 參與調(diào)控碳水化合物和次級代謝物代謝的差異表達蛋白

圖9為參與桃果實碳水化合物代謝和次級代謝物代謝的差異表達蛋白，共鑒定出44 個具有差異表達的蛋白，其中碳水化合物代謝差異表達蛋白有28 個，次級代謝物代謝差異表達蛋白有16 個。

圖9 參與桃果實碳水化合物（A）和次級代謝物（B）代謝的差異表達蛋白Fig. 9 DEPs involved in the metabolisms of carbohydrates (A) and secondary metabolites (B) in peach fruit

碳水化合物代謝中，差異表達蛋白主要集中在糖代謝、有機酸代謝及果實抗病防御系統(tǒng)酶。在果實抗病防御系統(tǒng)中，果膠乙酰酯酶（pectin acetylesterase，PAE），酸性內(nèi)切幾丁質(zhì)酶（acidic chitinase，ACHI）和葡聚糖內(nèi)-1,3--葡萄糖苷酶（glucan endo-1,3-glucosidase，-GAL）主要參與了植物抗病脅迫進程，經(jīng)過HA處理后的桃果實CHI和-GAL的表達量高于CK組，說明HA處理可以誘導果實的抗病性。在糖代謝過程中，鑒定到的差異表達蛋白主要包括SS、淀粉酶、HK、PFK、6-磷酸葡萄糖脫氫酶（glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）、UDP糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycosyltransferase，UDP-GT）和UDP-葡萄糖脫氫酶（UDP-glucose dehydrogenase，UDP-GDH）。與CK組相比，HA處理上調(diào)了SS、PFK、UDP-GT和UDP-GDH蛋白的表達量，說明HA處理可以抑制蔗糖含量的降解，并促進果糖和葡萄糖的代謝。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)分析，共有3 個糖代謝差異表達蛋白與相應的差異表達基因變化相同，分別為HK（18792370、ONI32405.1）、PFK（18771749、ONH97891.1）和PK（18777684、ONI06129.1）。在有機酸代謝過程中，差異表達蛋白主要參與檸檬酸和蘋果酸的代謝，鑒定的差異表達蛋白主要為蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）、檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）、檸檬酸裂解酶（ctric acid lyase，ACL）和蘋果酸異丙酯脫氫酶（isopropyl malate dehydrogenase，IMDH）。HA處理上調(diào)了MDH和CS蛋白的表達量，并下調(diào)了IDH、ACL和IMDH蛋白的表達量。其中MDH、IDH和CS蛋白的表達量變化與轉(zhuǎn)錄組中CS（18782404）、NAD-IDH（18781889）和MDH（18773149）基因的表達量變化相同，HA均提高了MDH和CS的表達，并抑制了IDH的表達。

圖9B為參與桃果實次級代謝物代謝的差異表達蛋白，共鑒定到16 個具有差異表達的蛋白，主要為苯丙烷代謝途徑關鍵蛋白和糖苷轉(zhuǎn)移蛋白，差異表達蛋白主要為黃酮醇合酶（flavonol synthase，F(xiàn)S）、黃烷醇-3-羥化酶（flavanol-3-hydroxylase，F(xiàn)3H）、9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素加氧酶（9-epoxy carotenoid oxygenase，NCED）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CADH）、花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）和類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（flavonoid glycosyltransferase，UFGT）。與CK組相比，HA處理提高了FS、PAL、UFGT等蛋白的表達量，從而促進了桃果實苯丙氨酸向花色苷類物質(zhì)的合成。其中，PAL蛋白（ONI03046.1）與基因（18772065）的表達量變化一致；UFGT蛋白（ONI25885.1）和基因（18785045）表達量的變化相同，說明HA處理均能顯著提高PAL和UFGT蛋白和基因的表達。同時，HA處理明顯下調(diào)了ADH、NCED的表達量，說明HA處理可以顯著抑制果實類胡蘿卜素等物質(zhì)的降解。

3 結(jié) 論

HA處理（40 ℃、4 h）對桃果實糖代謝、有機酸代謝和酚類物質(zhì)代謝影響較大。HA處理可以有效抑制蔗糖、檸檬酸和蘋果酸含量的下降，并抑制了葡萄糖和果糖含量的上升。同時，HA處理顯著提高了桃果實總酚、總黃酮和總花色苷的含量。轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學分析結(jié)果表明，大多數(shù)的差異表達基因和蛋白主要集中在碳水化合物代謝和次級代謝物代謝途徑中。對于糖代謝途徑，HA處理通過抑制酸性轉(zhuǎn)化酶（acid invertase，AI）和中性轉(zhuǎn)化酶（neutral invertase，NI）的表達，并上調(diào)SS、SPS和PFK表達，從而抑制桃果實蔗糖含量的降解及果糖和葡萄糖含量的上升。對于有機酸代謝，檸檬酸和蘋果酸是桃果實的主要有機酸，HA處理通過上調(diào)CS表達并下調(diào)IDH和烏頭酸酶（aconitase，ACO）的表達量，從而抑制檸檬酸含量的下降，同時HA處理通過上調(diào)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）和MDH并下調(diào)ME的表達量，從而抑制桃果實蘋果酸含量的下降。對于酚類和花色苷代謝，HA處理可以通過上調(diào)PAL和肉桂酸羥化酶（cinnamate hydroxylase，C4H）的表達量，從而促進苯丙氨酸向下游酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化，通過上調(diào)查耳酮合成酶（chalcone synthase，CHS）、查耳酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）和F3H表達量促進桃果實黃酮類物質(zhì)的合成，并通過上調(diào)二氫黃酮醇還原酶（dihydroflavonol reductase，DFR）、ANS和UFGT表達量，從而提高桃果實花色苷的含量。