蓮子抗性淀粉與乳酸鈉協(xié)同作用對大鼠小腸菌群及代謝產(chǎn)物的影響

尚瑋璇，劉 璐，雷素珍，鄭寶東，張 怡，曾紅亮

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

人體腸道是一個(gè)大型、復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，腸道菌群的數(shù)量、比例、功能等常受到外在因素的影響，如飲食、生活方式等，菌群失調(diào)可能引起機(jī)體天然免疫系統(tǒng)受損、腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，有誘發(fā)腸道炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化或胰島素抵抗的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致2型糖尿病、高血糖等病癥的發(fā)生。小腸是人體消化吸收的重要場所，主要通過酶類物質(zhì)作用糖類、膽固醇、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，小腸微生物數(shù)量遠(yuǎn)低于大腸，然而有研究表明，小腸菌群的失調(diào)在各類疾病的發(fā)生發(fā)展中有著獨(dú)特的作用機(jī)制：1）小腸菌群失調(diào)可能導(dǎo)致小腸絨毛排列不規(guī)則并發(fā)生不同程度的斷裂，使黏膜通透性增加，屏障功能下降；2）小腸上皮細(xì)胞中大量表達(dá)鈉-鉀-ATP酶，該酶在菌群失調(diào)時(shí)含量下降，導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓改變，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞，這兩種機(jī)制可能協(xié)同破壞小腸對糖類、蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)的吸收作用，引發(fā)糖尿病等疾病的發(fā)生。因此通過改善飲食等途徑增加小腸內(nèi)益生菌數(shù)量、控制有害菌繁殖可作為維持小腸穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝、預(yù)防疾病的重要舉措。

抗性淀粉（resistant starch，RS）可作為底物被結(jié)腸微生物發(fā)酵并利用，因此具有促進(jìn)益生菌生長及增強(qiáng)其活性的益生元作用，且能夠與其他益生元如膳食纖維相互作用發(fā)揮其益生元效應(yīng)。近年來，已有許多研究報(bào)道了RS的功能特性，如張亞楠等研究發(fā)現(xiàn)，RS不僅可以增加大鼠體內(nèi)的、等益生菌相對豐度，還有利于預(yù)防肥胖。蓮子補(bǔ)脾益腎，對控制2型糖尿病人血糖和胰島素水平有顯著影響，且蓮子中直鏈淀粉含量高達(dá)42%，是提供RS的良好來源。經(jīng)過壓熱、微波等處理后的蓮子抗性淀粉（lotus seed resistant starch，LRS）表面具有特殊的溝壑狀結(jié)構(gòu)，能提高益生菌在不良腸道環(huán)境的適應(yīng)性，使其更好地利用碳源，促進(jìn)自身增殖，并能通過參與胰島素分泌、調(diào)節(jié)抗氧化活性等各種關(guān)鍵因素的表達(dá)水平發(fā)揮預(yù)防炎癥等益生作用。Qin Renbing等研究發(fā)現(xiàn)，III型RS有利于腸道菌群發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。乳酸鹽是RS經(jīng)腸道菌群發(fā)酵后產(chǎn)生的一種后生元，其益生機(jī)制主要是調(diào)節(jié)宿主菌群、改善腸上皮屏障功能、調(diào)節(jié)全身代謝反應(yīng)等。目前對LRS和乳酸鈉（sodium lactate，SL）的生理功能已進(jìn)行了一定研究，但對于LRS和SL的協(xié)同作用尚鮮有報(bào)道，為研究兩者是否存在協(xié)同益生作用，本實(shí)驗(yàn)以LRS和SL為飲食干預(yù)，研究大鼠小腸菌群、代謝譜的影響，旨在探討LRS及SL影響小腸菌群及代謝的潛在機(jī)制，從飲食干預(yù)角度為調(diào)節(jié)人體代謝、預(yù)防糖尿病等疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級雄性SD大鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號：SYXK（閩）2016-0005。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在福建省福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)經(jīng)福建省中醫(yī)科學(xué)院動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號為FJATCM-IAEC2021002。

大鼠飼料 北京華阜康生物科技股份有限公司；新鮮蓮子 福建綠地有限公司；SL（純度≥98%）上海阿拉丁生化科技有限公司；生理鹽水 江西科倫藥業(yè)有限公司；無水乙醇 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；異丙醇 美國Merck公司；苯丙氨酸 上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒美國AXYGEN公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Centrifuge 5430R型高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；QuantiFluor-ST微型熒光計(jì) 美國Promega公司；Vanquish Horizon system超高效液相色譜系統(tǒng)串聯(lián)Q-Exactive HF-X復(fù)合四極桿-軌道阱質(zhì)譜儀美國Thermo Fisher Scientific公司；HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm） 美國Waters公司；JXDC-20型氮?dú)獯祾邇x 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LRS制備和動(dòng)物分組

LRS參考文獻(xiàn)[14]制備。24 只體質(zhì)量（70±5）g SPF級雄性SD大鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)的聚丙烯籠中，動(dòng)物房溫度（22±2）℃、相對濕度（55±5）%、12 h晝夜循環(huán)。將大鼠隨機(jī)分為4 組：正常對照（normal control，NC）組、LRS、SL組以及LRS+SL組。依照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行灌胃，NC組灌胃2.0 mL/100 g的生理鹽水；LRS組灌胃0.25 g/100 g的III型LRS，SL組灌胃0.018 g/100 gSL；LRS+SL組大鼠每100 g體質(zhì)量灌胃0.25 g的LRS和0.018 g的SL，各組自由攝食飲水干預(yù)4 周，每周記錄體質(zhì)量。對大鼠按劑量40 mg/kg進(jìn)行腹腔注射戊巴比妥鈉，麻醉處死后切開腹腔，取3～5 cm回腸腸段，將內(nèi)容物擠入15 mL無菌離心管中。將含有大鼠小腸內(nèi)容物的離心管置于液氮中，全部處理結(jié)束后轉(zhuǎn)移置于-80 ℃冰箱中凍存。

1.3.2 高通量測序

委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成高通量測序，流程如圖1所示。采用DNA提取試劑盒并按照操作說明對大鼠小腸內(nèi)容物中的總DNA進(jìn)行提取，并用1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳檢測，按指定測序區(qū)域（16S V3～V4區(qū)）合成帶有barcode的特異引物。隨后取特異引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，隨機(jī)選取具有代表性的樣本進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確保在最低循環(huán)數(shù)中使絕大多數(shù)樣本能夠擴(kuò)增出濃度合適的產(chǎn)物?；旌贤粯颖镜腜CR產(chǎn)物并用2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，用Tris-HCl洗脫，再用2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖電泳初步定量。將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)定量，之后按照每個(gè)樣本的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。最后進(jìn)行Miseq文庫構(gòu)建和Miseq測序并計(jì)算Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)。

圖1 測序?qū)嶒?yàn)流程Fig. 1 Flow chart of gene sequencing

1.3.3 超高效液相色譜串聯(lián)復(fù)合四極桿-軌道阱質(zhì)譜分析

參照文獻(xiàn)[15]的方法，取1.3.1節(jié)中所得樣品50 mg，置于2 mL離心管中，加入400 μL含0.02 mg/mL-2-氯苯丙氨酸（內(nèi)標(biāo)）溶液（溶劑為甲醇-水（體積比4∶1）溶液）。然后-10 ℃下用冷凍組織研磨機(jī)50 Hz研磨6 min，接著低溫超聲（5 ℃、40 kHz）30 min。樣品于-20 ℃條件下放置30 min后，4 ℃、13 000×離心15 min，收集上清液備用，并經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。采用Vanquish Horizon system超高效液相色譜系統(tǒng)串聯(lián)Q-Exactive HF-X復(fù)合四極桿-軌道阱質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。色譜條件：HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A為95%水+5%乙腈（含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸），流動(dòng)相B為47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水（含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸）；進(jìn)樣量2 μL；柱溫40 ℃。質(zhì)譜條件：樣品經(jīng)電噴霧電離，分別采用正、負(fù)離子掃描模式采集質(zhì)譜信號。每個(gè)樣品取20 μL上清液，混勻后作為質(zhì)控（quality control，QC）樣本。在分析的過程中，每檢測5～15 個(gè)分析樣本后測定1 個(gè)QC樣本，以考察整個(gè)檢測過程的穩(wěn)定性。代謝組學(xué)分析得到各化合物的保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣，同時(shí)將質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)譜信息與人類代謝組數(shù)據(jù)庫（human metabolome database，HMDB）METLIN數(shù)據(jù)庫以及美吉自建數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Tukey-Kramer檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。采用OriginPro 8.5軟件和GraphPad Prism 8.0軟件作圖。物種組間重疊數(shù)據(jù)采用fastp、FLASH軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）。采用R-3.3.1（stat）軟件分析組間物種差異并繪制Venn圖，通過假設(shè)檢驗(yàn)評估差異的顯著性水平。采用python-2.7軟件進(jìn)行菌群群落分析、群落Circos分析并作圖；采用python-2.7軟件、R-3.3.1（stat）軟件進(jìn)行菌群聚類分析。代謝譜差異數(shù)據(jù)采用ropls（R packages）軟件進(jìn)行正交偏最小方差判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。差異代謝物差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）和變量投影重要性值（variable projection importance value，VIP）采用ropls（R packages）、scipy（Python）軟件計(jì)算。采用ropls（R packages）軟件計(jì)算某一代謝物在兩組間的FC。篩選VIP＞1，＜0.05、FC＜1或FC＞1的差異代謝物與京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，功能通路數(shù)據(jù)采用scipy（Python）軟件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析。采用scipy（Python）軟件對菌群多樣性與代謝譜進(jìn)行皮爾森相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LRS、SL干預(yù)對大鼠腸道菌群多樣性的影響

為描述腸道菌群多樣性和豐富度，分別計(jì)算Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)，結(jié)果表明，相較于NC組，LRS組（＜0.05）、SL組（＜0.01）、LRS+SL組（＜0.05）物種豐富度均有顯著提高，且LRS組多樣性降低（＜0.05），這與林珊的研究結(jié)果一致，SL組無顯著變化（＞0.05），LRS+SL組物種多樣性顯著增加（＜0.05）（圖2A、B），且LRS+SL組相比LRS組（＜0.001）及SL組（＜0.05）物種多樣性均顯著增加，說明LRS和SL協(xié)同有利于增加大鼠小腸菌群的多樣性。各組樣本的PCoA分析如圖2C所示，該差異檢驗(yàn)結(jié)果為0.021，樣本間差異顯著。NC組與LRS組和SL組間重疊少，與LRS+SL組重疊較多，差異性小。如圖2D所示，4 組中共有的物種數(shù)為118 個(gè)，NC組有20 個(gè)特有物種，LRS組有33 個(gè)特有物種，SL組有64 個(gè)特有物種，LRS+SL組有145 個(gè)特有物種。結(jié)果表明，當(dāng)添加LRS和SL時(shí)特有物種數(shù)均有增加，而在LRS與SL協(xié)同作用時(shí)增加效果最為顯著。

圖2 LRS、SL干預(yù)對大鼠腸道菌群多樣性的影響（n＝6）Fig. 2 Effects of LRS and SL intervention on intestinal flora diversity in rats (n = 6)

2.2 LRS、SL干預(yù)對大鼠腸道菌落組成及組間差異的影響

在不同分類學(xué)水平上對物種組成進(jìn)行分析，如圖3A所示，從門水平來看，厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteriota）和變形菌門（Proteobacteria）是各組中的優(yōu)勢菌群，相比NC組，LRS組Firmicutes相對豐度增加，Actinobacteriota相對豐度減??；SL組Firmicutes相對豐度減??；LRS+SL組擬桿菌門（Bacteroidota）相對豐度增加。其中，F(xiàn)irmicutes代謝產(chǎn)物丁酸鹽具有抗炎、改善胰島素抵抗的作用，其相對豐度增加有利于預(yù)防肥胖和2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展，F(xiàn)irmicutes利用或分解乳酸的能力較弱，在SL組中相對豐度下降，這與Policastro等研究結(jié)果一致?？扑揭匀樗釛U菌科（Lactobacillaceae）為主要物種，其次是棒狀桿菌科（Corynebacteriaceae）和消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae），相較于NC組，LRS組乳酸桿菌科、消化鏈球菌科相對豐度上調(diào)，且棒狀桿菌科相對豐度下調(diào)，SL組和LRS+SL組均表現(xiàn)為消化鏈球菌科相對豐度下調(diào)（圖3B）。屬水平上，乳酸桿菌屬（）相對豐度最高，棒狀桿菌屬（）、次之，LRS組上調(diào)而相對豐度下調(diào)，LRS組相對豐度增加，在其余兩組相對豐度降低（圖3C）。對圖3C中相對豐度前15的物種進(jìn)行篩選，其中具有顯著差異的物種如圖3D所示，結(jié)合圖3E和圖3F可知，在LRS組中的相對豐度低于其余3 組，漫游球菌屬（）在LRS組、SL組和LRS+SL組中的水平均極顯著低于NC組（＜0.01）。LRS+SL組相較其余各組表現(xiàn)出顯著促進(jìn)生長（＜0.01）和抑制異桿菌屬（）繁殖（＜0.05）的效果。其中，被認(rèn)為是保護(hù)腸道屏障、調(diào)控免疫應(yīng)答、抗病原菌感染、調(diào)節(jié)代謝、預(yù)防炎癥的益生菌；可通過產(chǎn)生天然類胡蘿卜素（角黃素）發(fā)揮抗氧化、預(yù)防癌癥的作用；與人類腸道感染疾病有關(guān)，類似于腸桿菌屬（）和肉食桿菌屬（）等致病菌。

圖3 群落組成及多組間差異分析結(jié)果Fig. 3 Analysis of intestinal bacterial community composition and differential species among groups

在屬水平上，與NC組相比，LRS組（＜0.01）、（＜0.05）、（＜0.05）、相對豐度顯著或極顯著降低，、相對豐度顯著增加（＜0.05）（圖4A）。有研究表明，被認(rèn)為是人體腸道致病菌之一，其參與了腸道內(nèi)未消化蛋白的發(fā)酵，可能破壞腸道穩(wěn)態(tài)，其產(chǎn)物氨、腐胺等與結(jié)直腸癌的發(fā)生有密切聯(lián)系；被證明在病態(tài)肥胖個(gè)體腸道菌群中相對豐度較高，可能具有潛在的致代謝紊亂作用。SL組相對豐度顯著降低（＜0.05），、相對豐度顯著增加（＜0.05）（圖4B）。LRS+SL組、相對豐度極顯著降低（＜0.01），（＜0.01）、（＜0.05）相對豐度極顯著或顯著增加（圖4C）。此外，Lachnospiraceae和Ruminococcaceae同屬Firmicutes，是人類腸道中常見的菌群，能水解淀粉和糖類從而產(chǎn)生丁酸鹽及短鏈脂肪酸。同時(shí)，LRS組和SL組相對LRS+SL組均表現(xiàn)出顯著較低的相對豐度（＜0.05）和極顯著較高的相對豐度（＜0.01）（圖4D、E）。的相對豐度與ANGPTL4（即一種脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是腸道微生物群和脂肪沉積的循環(huán)介質(zhì)）的表達(dá)呈正相關(guān)，且有實(shí)驗(yàn)表明，高脂飲食處理也使小鼠相對豐度顯著增加。

圖4 兩組間群落組成差異分析結(jié)果Fig. 4 Analysis of differences in intestinal bacterial community composition between two groups

由此可見，LRS和SL的飲食干預(yù)有利于小腸菌群結(jié)構(gòu)的優(yōu)化、維持腸道穩(wěn)態(tài)，這與Zeng Hongliang等研究結(jié)果具有一致性。另外，LRS和SL協(xié)同作用促進(jìn)了的增殖并抑制了的增殖，具有預(yù)防代謝紊亂的潛在功效。

2.3 LRS、SL干預(yù)后大鼠腸道代謝譜差異

代謝譜數(shù)據(jù)的OPLS-DA結(jié)果如圖5所示。在陰離子模式下，LRS組與NC組、LRS+SL組與NC組、LRS組與LRS+SL組、SL組與LRS+SL組代謝模式均可完全分離，表明LRS及LRS與SL協(xié)同作用均可有效干預(yù)代謝模式的變化。

圖5 組間代謝差異OPLS-DA評分圖Fig. 5 OPLS-DA score plots for differential metabolites between groups

在VIP＞1，＜0.05、FC＜1或FC＞1的條件下，將所篩選出的差異代謝物與KEGG數(shù)據(jù)庫比對分類，結(jié)果如圖6所示，具體差異代謝物見表1。

圖6 組間KEGG差異代謝物分析結(jié)果Fig. 6 KEGG differential metabolite analysis between groups

由表1可知，相對于NC組，LRS極顯著或顯著地促進(jìn)了()-硫辛酸（＜0.01）、-姜黃素（＜0.05）、17,18-乙醇酰胺（＜0.05）、銀杏內(nèi)酯A（＜0.01）、17--雌二醇3-硫酸鹽-17-(--葡萄糖醛酸)（＜0.01）、油酰乙醇酰胺（＜0.05）、類固醇激素（雌三醇、雌激素、皮質(zhì)甾酮）（＜0.05）等代謝物的上調(diào)，以及磷脂（LysoPC(17:0)）、氨基酸（-絲氨酸）等的顯著下調(diào)（＜0.05），表明LRS對體內(nèi)脂類、氨基酸代謝有調(diào)節(jié)作用。其中，-姜黃素是改善脂質(zhì)代謝、保護(hù)腸道健康，降低血液膽固醇水平的重要代謝物。LysoPC(17:0)可能通過氧化應(yīng)激在機(jī)體損傷過程中發(fā)揮重要作用。-絲氨酸為非必需氨基酸，絲氨酸的從頭合成在提高機(jī)體免疫功能方面有積極影響。在SL作用下，大鼠體內(nèi)磷脂代謝有明顯變化（LysoPC(18:1(9))、LysoPC(20:2(11,14))顯著下調(diào)（＜0.05），LysoPC(24:1(15))顯著上調(diào)（＜0.05）），油酰乙醇酰胺、類固醇激素（脫氫表雄酮、皮質(zhì)醇、糖皮質(zhì)類固醇激素、皮質(zhì)甾酮、雄烯二酮）水平顯著上調(diào)（＜0.05）。LRS與SL協(xié)同作用時(shí)，大鼠體內(nèi)氨基酸代謝變化（-組氨酸、-色氨酸下調(diào)，瓜氨酸上調(diào)）顯著（＜0.05），同時(shí)表現(xiàn)出3a,7a-二羥基-5b-膽甾烷、維生素（泛酸）水平顯著上調(diào)（＜0.05）和磷脂（LysoPC(17:0)）水平下調(diào)。此外，與LRS單獨(dú)作用相比，該協(xié)同作用對維生素代謝的調(diào)節(jié)（煙酸、抗壞血酸顯著下調(diào)（＜0.05））有更顯著的影響；相較于SL單獨(dú)作用，二者協(xié)同對17-羥基亞麻酸、LysoPC(16:1(9)/0:0)水平有上調(diào)作用，對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、山柰酚等代謝物有下調(diào)作用。其中，瓜氨酸在機(jī)體氮素循環(huán)中發(fā)揮重要作用，在體內(nèi)吸收后可轉(zhuǎn)化為精氨酸，具有提高機(jī)體的免疫力、保持正常的膽固醇水平、平衡正常的血糖水平、清除自由基等作用。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是一種引起機(jī)體免疫抑制和腸道菌群紊亂的毒素，對腸道屏障功能有破壞作用。綜上所述，LRS和SL均有利于類固醇激素的合成，且LRS單獨(dú)作用時(shí)可促進(jìn)大鼠體內(nèi)()-硫辛酸、銀杏內(nèi)酯A、-姜黃素等物質(zhì)水平的增加，有利于調(diào)節(jié)氨基酸和脂質(zhì)代謝；SL干預(yù)可調(diào)節(jié)類固醇激素及磷脂等代謝物水平；二者共同作用時(shí)，對氨基酸代謝和維生素代謝的調(diào)節(jié)作用更為明顯，并可能提高機(jī)體對有害代謝物的抵抗作用。

表1 LRS組、SL組、LRS＋SL組與NC組及LRS組、SL組與LRS＋SL組小腸差異代謝物對比Table 1 Differential metabolites in small intestine of LRS, SL and LRS + SL versus NC groups, and LRS and SL versus LRS + SL groups

續(xù)表1

LRS組、SL組、LRS+SL組與NC組間及LRS組、SL組與LRS+SL組之間差異顯著的功能通路如圖7所示。其中，橫軸表示通路中代謝物在通路中的相對重要性，氣泡大小代表通路重要性值。NC組與LRS組有2 條差異較大的功能通路：類固醇激素（steroid hormone）、半胱氨酸和蛋氨酸代謝（cysteine and methionine metabolism）通路（圖7A）。類固醇激素功能通路與雌激素、皮質(zhì)甾酮、脫氫表雄酮等類固醇及其衍生物有關(guān)，并與一種調(diào)節(jié)膽汁酸代謝及脂質(zhì)代謝的細(xì)菌豐度呈正相關(guān)。NC與SL組有4 條差異較明顯的功能通路：類固醇降解（steroid degradation）、類固醇激素生物合成（steroid hormone biosynthesis）、初級膽汁酸合成（primary bile acid synthesis）、谷胱甘肽代謝（glutathione metabolism）通路（圖7B）。其中，初級膽汁酸合成對抗膽汁淤積有重要作用。谷胱甘肽代謝是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化和代謝調(diào)節(jié)的途徑，能夠清除氮氧自由基、預(yù)防肝臟疾病。對照組與LRS+SL組有3 條差異較明顯的功能通路：氨酰tRNA生物合成（aminoacyl-tRNA biosynthesis）、-丙氨酸代謝（-alanine metabolism）、星孢菌素生物合成（staurosporine biosynthesis）通路（圖7C）。LRS組與LRS+SL組間有2 條差異較大的功能通路：谷胱甘肽代謝（Glutathione metabolism）、抗壞血酸和醛酸代謝（ascorbate and aldarate metabolism）（圖7D）。SL組與LRS+SL組間有3 條差異較大的功能通路：黃酮和黃酮醇（flavone and flavonol）、類黃酮生物合成（flavonoid biosynthesis）和甘油磷脂代謝（glycerophospholipid metabolism）通路（圖7E）。-丙氨酸代謝等氨基酸代謝通路及甘油磷脂代謝等脂質(zhì)代謝通路均與預(yù)防代謝綜合征等疾病有關(guān)。綜上，LRS及SL單獨(dú)作用時(shí)均表現(xiàn)出氨基酸代謝和激素代謝調(diào)節(jié)的重要作用，SL還在優(yōu)化肝功能、增強(qiáng)肝防御系統(tǒng)方面有促進(jìn)作用；二者協(xié)同作用時(shí)有利于維持脂質(zhì)代謝、維生素代謝穩(wěn)定并促進(jìn)生物活性物質(zhì)的合成和表達(dá)。

圖7 組間功能通路差異拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果Fig. 7 Topological analysis of differential functional pathways between groups

2.4 菌群多樣性與代謝譜相關(guān)性分析結(jié)果

圖8 腸道菌群-代謝相關(guān)性分析結(jié)果Fig. 8 Correlation analysis between intestinal flora and metabolism

對小腸菌群差異菌屬與差異代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析，所得結(jié)果如圖8所示，球鏈菌屬（）、羅斯氏菌屬（）、紅球菌（）、、、不動(dòng)桿菌（）、與LysoPC(24:1(15))（＜0.05）、去氫催吐蘿鞭木醇（＜0.001）、辣椒素、油酰乙醇酰胺、皮質(zhì)甾酮、雌激素、()-硫辛酸、雌三醇、銀杏內(nèi)酯A（＜0.05）呈顯著正相關(guān)，與-絲氨酸、降胭脂木酯、LysoPC(20:2(11,14))、LysoPC(18:1(9))呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）。與LysoPC(24:1(15))（＜0.05）、去氫催吐蘿鞭木醇（＜0.001）、辣椒素（＜0.05）、油酰乙醇酰胺（＜0.01）、皮質(zhì)甾酮（＜0.01）呈顯著正相關(guān)。與雌激素、()-硫辛酸、銀杏內(nèi)酯A呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01）。與瓜氨酸呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），與LysoPC(17:0)、組氨酸等維生素呈顯著正相關(guān)（＜0.05）。其中，銀杏內(nèi)酯A參與血清和肝組織TC與TG含量的調(diào)控，降低肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)蓄積程度，有效預(yù)防非酒精性脂肪性肝病。有研究表明，()-硫辛酸能調(diào)節(jié)線粒體功能和脂肪細(xì)胞胰島素敏感性，是改善胰島素抵抗和相關(guān)代謝紊亂的潛在有效營養(yǎng)素。肝臟是雌激素代謝的主要部位，也是雌激素作用的主要非生殖靶器官；雌激素調(diào)節(jié)肝臟蛋白質(zhì)的合成、肝臟能量穩(wěn)態(tài)，參與脂質(zhì)和葡萄糖代謝的肝臟基因以及肝細(xì)胞的增殖和凋亡，對肝功能有重要調(diào)節(jié)作用。辣椒素是從辣椒中提取的主要活性成分，研究表明其不僅具有抗氧化、清除活性氧自由基和改善線粒體活性等功能，還在改善肝細(xì)胞膨大、氣球樣變及脂肪空泡等病理損傷方面發(fā)揮積極作用。油酰乙醇酰胺作為一種天然存在的脂質(zhì)信號分子，主要通過改善脂肪酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，預(yù)防非酒精性脂肪性肝病。與銀杏內(nèi)酯A呈正相關(guān)的可以降解脂肪酶、腈水合酶和膽固醇氧化酶為丁酸、丙酸等短鏈脂肪酸，對促進(jìn)脂肪氧化、改善代謝健康有重要作用。也是一種產(chǎn)丁酸的細(xì)菌，在調(diào)節(jié)腸道能量代謝、防止腸道微生態(tài)失衡方面有重要作用。結(jié)合小腸菌群和代謝譜差異可得，LRS單獨(dú)作用時(shí)不僅有利于促進(jìn)等有益菌的增殖，增加銀杏內(nèi)酯A、()-硫辛酸、油酰乙醇酰胺、辣椒素等有益代謝物的產(chǎn)生，促進(jìn)和產(chǎn)短鏈脂肪酸細(xì)菌的繁殖，降低等有害菌相對豐度，起到調(diào)節(jié)氨基酸、激素、脂類代謝的作用。LRS和SL協(xié)同作用時(shí)，可通過降低相對豐度，調(diào)節(jié)維生素代謝，可能對維持體內(nèi)代謝平衡、預(yù)防代謝綜合征有潛在效果。

3 結(jié) 論

本研究探討了LRS及SL對大鼠的小腸道菌群結(jié)構(gòu)及代謝的影響。通過小腸菌群結(jié)構(gòu)、代謝物組成及其相關(guān)性的分析，結(jié)果表明，LRS的飲食干預(yù)促進(jìn)了的增殖并降低了相對豐度，與辣椒素、油酰乙醇酰胺、雌激素、()-硫辛酸、銀杏內(nèi)酯A正相關(guān)，影響了類固醇激素和半胱氨酸和蛋氨酸代謝代謝通路，可能在調(diào)節(jié)氨基酸、激素代謝等方面發(fā)揮積極作用；SL的干預(yù)提高了、的相對豐度，影響了初級膽汁酸合成及谷胱甘肽代謝通路，具有預(yù)防膽汁酸堆積、增強(qiáng)肝功能的潛在效果；當(dāng)二者協(xié)同作用時(shí)，能夠增加小腸菌群多樣性，同時(shí)促進(jìn)的增殖并降低的相對豐度，與瓜氨酸呈負(fù)相關(guān)并與LysoPC(17:0)呈正相關(guān)，能夠富集維生素、脂質(zhì)、氨基酸代謝通路，與LRS和SL單獨(dú)作用相比，其在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)方面有著更為顯著的效果。研究結(jié)果可為益生元及其后生元協(xié)同效應(yīng)的研究提供一定的理論依據(jù)。