新孢子蟲分泌蛋白的種類及其功能

吳凱劍 ， 劉 群

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193)

犬新孢子蟲(Neosporacaninum，簡稱新孢子蟲)由Dubey等于1988年鑒定并命名[1]，是多種動物共患原蟲，終末宿主是犬科動物，中間宿主是包括犬在內(nèi)的多種溫血動物，主要寄生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉組織和視網(wǎng)膜等器官組織的有核細(xì)胞中。新孢子蟲病已是公認(rèn)的致牛流產(chǎn)的主要原因之一。新孢子蟲隸屬于頂復(fù)合器亞門、真球蟲目、肉孢子蟲科、新孢子蟲屬，如圖1所示，其具有該類原蟲的三大重要的分泌細(xì)胞器，即微線體、棒狀體和致密顆粒，是蟲體分泌蛋白的主要來源，蟲體的表面蛋白和其他分泌排泄產(chǎn)物也是重要的分泌蛋白。已知分泌蛋白在蟲體黏附、入侵、增殖以及逸出等生命活動中具有重要作用，其中有些蛋白是影響新孢子蟲毒力的重要因子，或是重要的診斷抗原和免疫原。目前已有新孢子蟲的多種分泌蛋白得到鑒定，對它們的功能也有一定的認(rèn)識，本文對新孢子蟲主要分泌蛋白的研究報道進(jìn)行總結(jié)和分析，以期為新孢子蟲的深入研究提供參考資料。

圖1 新孢子蟲分泌蛋白在入侵時的功能A:新孢子蟲的超微結(jié)構(gòu)示意圖; B:新孢子蟲入侵宿主時蛋白分泌示意圖(①:新孢子蟲以低親和力接觸到宿主細(xì)胞膜；②:微線體分泌微線體蛋白，介導(dǎo)蟲體以更強的親和力黏附在細(xì)胞表面；③:棒狀體分泌棒狀體頸部蛋白和棒狀體蛋白；④、⑤：棒狀體頸部蛋白與微線體蛋白形成滑動連接，推動蟲體進(jìn)入宿主細(xì)胞；⑥：新孢子蟲進(jìn)入宿主細(xì)胞后進(jìn)行二分裂，逐漸形成納蟲空泡，蟲體分泌致密顆粒蛋白和棒狀體蛋白修飾納蟲空泡。部分致密顆粒蛋白和棒狀體蛋白能夠定位于宿主細(xì)胞核，向宿主細(xì)胞核傳遞信號，調(diào)控宿主細(xì)胞周期)

1 微線體蛋白(Microneme protein，MICs)

在頂復(fù)亞門不同屬、種和同一蟲種的不同發(fā)育階段中，微線體的數(shù)量差異很大，通常代謝旺盛或滑動活躍的蟲種或發(fā)育階段蟲體含有較多的微線體，而運動較少或不活躍的、非入侵宿主階段的原蟲則含有較少或者沒有微線體。新孢子蟲速殖子含有豐富的微線體蛋白，在運動、黏附和入侵過程中起重要作用。

新孢子蟲的分泌蛋白中，關(guān)于微線體蛋白的研究報道最多。目前，已經(jīng)鑒定出新孢子蟲NcMIC1、NcMIC2、NcMIC3、NcMIC4、NcMIC6、NcMIC8、NcMIC10、NcMIC26、類枯草桿菌絲氨酸蛋白酶1(Subtilisin-like serine protease 1，NcSUB1)、頂膜抗原1(Apical membrane antigen 1，NcAMA1)和NcMIC2的同系物NcMIC2-like等多種微線體蛋白。

1.1 成熟分泌 微線體蛋白有一些共同結(jié)構(gòu)特征，其一是具有前體和成熟體2種形式。除了NcAMA1，大多數(shù)微線體蛋白都為I型跨膜蛋白，含有C端跨膜結(jié)構(gòu)域和N端信號肽。微線體蛋白前體的跨膜結(jié)構(gòu)域會在微線體中或在分泌前被切割成成熟體，然后在信號肽引導(dǎo)下定位到正確位置，切割新孢子蟲微線體蛋白的酶尚不清楚。成熟的微線體蛋白在蟲體入侵細(xì)胞前定位在微線體中，入侵過程或入侵后大量地集中在速殖子后端。

微線體蛋白的分泌受到蟲體內(nèi)鈣離子的調(diào)控，蟲體黏附細(xì)胞后，體內(nèi)鈣離子濃度升高刺激微線體蛋白分泌。NcMIC3比較特殊，其分泌不受鈣離子調(diào)控，并且不嚴(yán)格地定位在微線體上。在胞外或進(jìn)行入侵時，NcMIC3以溫度依賴性形式彌散分布在蟲體表面，隨后向蟲體后端轉(zhuǎn)運，完成入侵后定位于微線體[2]。

1.2 黏附結(jié)構(gòu)域 微線體蛋白的另一個重要特征是大多數(shù)都具有1個或多個黏附結(jié)構(gòu)域，屬于黏附蛋白，能與宿主細(xì)胞直接結(jié)合，便于入侵。目前已經(jīng)鑒定出多種新孢子蟲微線體蛋白的黏附結(jié)構(gòu)域，大多數(shù)與其他真核生物的黏附結(jié)構(gòu)域有較高的同源性。包括整合素樣結(jié)構(gòu)域(I或A結(jié)構(gòu)域)和5個血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)序列(Thrombospondin domains，TSP)、唾液酸結(jié)合黏附重復(fù)結(jié)構(gòu)域(Microneme adhesive repeat，MAR)、表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域(EGF-like domain，EGF)和Apple域[2-3]。在其他的原蟲中，還發(fā)現(xiàn)了包括小隱孢子蟲的黏蛋白樣結(jié)構(gòu)域、瘧原蟲的Duffy樣結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (Duffy binding-like domain，DBL)和泰勒蟲的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域[2,4-5]。

微線體蛋白的黏附結(jié)構(gòu)域與宿主表面受體(糖蛋白或糖脂復(fù)合物)結(jié)合，使蟲體黏附在細(xì)胞表面，這是新孢子蟲入侵宿主細(xì)胞的基礎(chǔ)。微線體蛋白識別的受體包括肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素以及人工硫酸化的糖胺聚糖-葡聚糖硫酸鹽等。已有研究證實，NcMIC1、3、4在體外能夠與宿主細(xì)胞表面的多硫酸化糖胺聚糖(NcMIC1、3)或硫酸軟骨素(NcMIC4)結(jié)合[2,6-7]，干擾硫酸化蛋白多糖的合成或抑制其硫酸化過程。寄生蟲的黏附結(jié)構(gòu)域是潛在的藥物靶點，結(jié)合生物信息學(xué)分析黏附結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)，解析其與宿主細(xì)胞互作的蟲體特異性結(jié)合位點，對結(jié)合位點進(jìn)行突變或者利用虛擬篩選尋找針對結(jié)合位點的小分子抑制劑，有助于研發(fā)有效的弱毒活疫苗或者藥物。已有瘧原蟲DBL結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合位點為DBL3X-DBL4ε[4]，但是在新孢子蟲中相關(guān)的研究還很少。

微線體蛋白和宿主細(xì)胞的結(jié)合與膜肌動蛋白-肌球蛋白運動蛋白互相有關(guān)，對蟲體運動至關(guān)重要。NcMIC2的TRAP樣蛋白結(jié)構(gòu)域(Thrombospondin-related anonymous protein，TLP)是頂復(fù)亞門原蟲滑動體的組件蛋白，參與蟲體運動[4]。NcMIC6通過參與蟲體的滑移運動從而促進(jìn)蟲體從細(xì)胞中逸出[8]。

1.3 微線體蛋白復(fù)合物 微線體蛋白在運輸和分泌過程中均以復(fù)合物形式發(fā)揮作用。在弓形蟲中已經(jīng)報道了4種互作的微線體蛋白復(fù)合物：TgMIC1/4/6、TgMIC2/M2AP(MIC2相關(guān)蛋白)、TgMIC3/8和TgAMA1/RON2/4/5/8(棒狀體頸部蛋白2/4/5/8)，并且證明了AMA1/RON2/4/5/8復(fù)合物與運動連接(Moving junction，MJ)結(jié)合，對入侵至關(guān)重要[9]。在新孢子蟲中，通過免疫共沉淀已經(jīng)鑒定出NcMIC1/4/6和NcMIC3/NcMIC8兩對復(fù)合物[8,10]。與弓形蟲不同的是，新孢子蟲NcMIC6不影響NcMIC1和NcMIC4的定位，說明了新孢子蟲和弓形蟲入侵的機制存在差異[8]。

關(guān)于新孢子蟲微線體蛋白如何參與蟲體入侵過程及微線體蛋白復(fù)合體的功能仍有待深入研究。

2 棒狀體蛋白(Rhoptry protein，ROPs)

棒狀體位于新孢子蟲前端，其數(shù)量與生活史階段有關(guān)。棒狀體又分為頸部和球部，分別分泌棒狀體頸部蛋白(Rhoptry neck protein，RONs)和棒狀體蛋白(Rhoptry protein，ROPs)。新孢子蟲中關(guān)于RONs的研究很少。

2.1 定位與功能 棒狀體蛋白是頂復(fù)亞門原蟲特有的蛋白家族，在寄生蟲侵入細(xì)胞前后分泌，其功能與定位相關(guān)。有些棒狀體蛋白定位于納蟲空泡膜(Parasitophorous vacuole membrane，PVM)，在入侵時與宿主蛋白互作，或在胞內(nèi)與致密顆粒蛋白一起修飾和維持納蟲空泡膜和納蟲空泡網(wǎng)絡(luò)(Parasitophorous vacuole network，PVN)；有些定位于宿主細(xì)胞核，通過納蟲空泡(Parasitophorous vacuole,PV)向宿主細(xì)胞核傳遞信號調(diào)節(jié)寄生蟲的毒力；另一些定位在宿主細(xì)胞質(zhì)，發(fā)揮重塑宿主的肌動蛋白細(xì)胞骨架的功能。棒狀體蛋白為新孢子蟲重要的毒力因子，也是抵御宿主防御系統(tǒng)的關(guān)鍵。

2.2 ROP2蛋白家族 根據(jù)棒狀體蛋白的功能，分為不同蛋白家族。最大的棒狀體蛋白家族為ROP2家族，也被稱為棒狀體激酶家族(Rhoptry kinases，ROPKs)，分為激酶和假激酶。新孢子蟲ROPs中，已報道的NcROP2Fam-1、NcROP2、NcROP5、NcROP16、NcROP18和NcROP40都屬于ROP2家族。雖然弓形蟲和新孢子蟲的許多ROPKs具有同源性，但是兩者編碼毒力因子的結(jié)構(gòu)域有顯著的差別，ROPKs的表達(dá)水平也不同。不同蟲株、寄生蟲不同生活史階段的ROPKs表達(dá)水平也存在顯著差異。這是導(dǎo)致寄生蟲毒力差異的關(guān)鍵。

ROP2家族的共同特征是在信號肽切割位點后含有富含精氨酸(R-rich)的結(jié)構(gòu)域，另外還有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(NTE)。前者是由3個R-rich結(jié)構(gòu)域組成，其核心是1個疏水性α螺旋，影響ROP2家族蛋白與納蟲空泡膜的結(jié)合[11]。后者決定了ROPKs的激酶磷酸化活性。但是并非所有ROPKs都含關(guān)鍵的催化殘基，而許多假激酶已經(jīng)進(jìn)化出替代磷酸化的方式[12]。真核生物的蛋白激酶起到介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，所以棒狀體激酶家族是非常重要的毒力家族，也是很有前途的免疫抗原，發(fā)掘更多的ROPKs及研究其功能對研究新孢子蟲病的致病機理至關(guān)重要。

目前已經(jīng)報道了幾種重要的ROP2家族毒力因子，最先被表達(dá)克隆的是NcROP2，定位于PVM，通過與宿主互作參與寄生蟲入侵過程[11]，另一個ROPs家族蛋白NcROP2Fam-1也影響蟲體的入侵過程，但是由于NcROP2Fam-1缺乏必要的激酶催化殘基，所以尚未清楚其是否有激酶活性。

TgROP18是第1個被報道的弓形蟲毒力因子，與TgROP17和假激酶TgROP5形成復(fù)合物，受到TgGRA7的調(diào)控，使免疫相關(guān)的GTPase家族(IGRs)磷酸化，發(fā)揮免疫逃避作用[12]。NcROP18卻是1個假基因[13]，ROP18基因的不同是造成弓形蟲和新孢子蟲毒力差異的關(guān)鍵因素。

NcROP5是新孢子蟲的毒力因子之一[14]，能抑制IGRs的鳥苷酸結(jié)合蛋白GBP1和GBP2向納蟲空泡聚集，抵御宿主對新孢子蟲的泛素化和降解納蟲空泡。缺失NcROP5會影響NcROP17和NcGRA7的轉(zhuǎn)錄水平。

NcROP16也是重要的毒力因子之一[15]，定位于宿主細(xì)胞核和細(xì)胞漿，由磷酸激酶介導(dǎo)在宿主細(xì)胞中磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)，誘導(dǎo)宿主的凋亡。

3 致密顆粒蛋白(Dense granule protein，GRAs)

目前，已經(jīng)報道的致密顆粒蛋白有NcGRA1、NcGRA2、NcGRA3、NcGRA4、NcGRA6、NcGRA7、NcGRA9、NcGRA11、NcGRA12、NcGRA14、NcGRA17、NcGRA23、核苷水解酶(NcNTPase)和基質(zhì)抗原1(Matrix antigen 1，NcMAG1)等。

3.1 分泌與定位 大多數(shù)致密顆粒蛋白都包含1個N端信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，并且具有翻譯后修飾。致密顆粒蛋白分泌前定位于致密顆粒，在PVM形成初期以類似于胞吐的方式從寄生蟲頂端、側(cè)面和后部分泌，其分泌機制尚不清楚。已知致密顆粒蛋白的分泌不受鈣離子調(diào)控，卻受溫度影響[16]，原因未知。

致密顆粒蛋白分泌后有3種定位形式：定位于納蟲空泡膜、定位于納蟲空泡腔和定位于納蟲空泡中的網(wǎng)管狀纖維網(wǎng)絡(luò)。

3.2 功能及機制 致密顆粒蛋白主要功能是修飾PVM，維持納蟲空泡的形態(tài)穩(wěn)定，促進(jìn)速殖子在納蟲空泡中的營養(yǎng)攝取和物質(zhì)交換，維持新孢子蟲在宿主細(xì)胞中的正常生長和復(fù)制。Yang等[17]證明了NcGRA17的α螺旋是維持納蟲空泡的形態(tài)的必要條件。董井泉[18]發(fā)現(xiàn)，NcGRA2、NcGRA4、NcGRA6和NcGRA9能形成一種與PVN結(jié)構(gòu)相關(guān)的復(fù)合體，其核心是NcGRA2，但是對該復(fù)合體的功能沒有做進(jìn)一步研究。有些致密顆粒蛋白可能存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號，參與PV與宿主ER細(xì)胞器的招募/結(jié)合；有些能介導(dǎo)PV與宿主細(xì)胞線粒體的結(jié)合；還有些能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞核，調(diào)控宿主細(xì)胞周期。

NcGRA7是第1個被報道的致密顆粒蛋白，被研究得最多。早期對NcGRA7的研究主要集中在定位、血清學(xué)診斷和免疫活性分析上?？筃cGRA7抗體具有特異性，與弓形蟲缺乏交叉反應(yīng)，是很強的診斷標(biāo)志物[19]。NcGRA7參與宿主的細(xì)胞和體液免疫，是重要的疫苗候選蛋白。

近年來對NcGRA7的研究多集中在致病機制上。一方面，NcGRA7通過調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)調(diào)控新孢子蟲病的發(fā)病機制。NcGRA7與NcGRA6、NcGRA14參與調(diào)控NF-κB、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和cAMP-PKA信號通路的激活[20]，影響宿主細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，如IFN-γ、IL-1β、IGPs和IRGs[19]，能夠抑制宿主IRGa6向PVM募集，從而逃避宿主免疫反應(yīng)。NcGRA7還能調(diào)控多種與宿主細(xì)胞周期、泛素化、RAS信號相關(guān)的蛋白的表達(dá)。另一方面，NcGRA7影響新孢子蟲自身的復(fù)制，調(diào)節(jié)多種新孢子蟲基因的表達(dá)，包括代謝、轉(zhuǎn)運蛋白和抗原、泛素化、剪切和翻譯后修飾相關(guān)的基因[19]。因此，NcGRA7是新孢子蟲毒力的關(guān)鍵因子。NcGRA7與新孢子蟲中其他分子或宿主因子的互作、對基因調(diào)控的影響尚未見報道。

NcGRA6是第2個被報道的致密顆粒蛋白，具有抗原特異性，可用作新孢子蟲病的血清學(xué)診斷抗原。它同時以可溶性和跨膜形式存在，定位于PV和IVN。Zhao等[21]發(fā)現(xiàn)敲除NcGRA6會顯著抑制新孢子蟲的早期增殖，證明了NcGRA6是新孢子蟲感染早期的重要毒力因子，但是對NcGRA6的毒力機制沒有進(jìn)一步研究。

NTPase具有NDPK(核苷二磷酸水解酶)活性，為I型核苷三磷酸水解酶(NTPDase)，屬于致密顆粒蛋白。該酶在速殖子階段大量分泌到PV，由PV中的二硫醇化合物或二硫醇氧化還原酶激活，能夠影響ATP的合成和蟲體分化，維持蟲體的營養(yǎng)獲取和介導(dǎo)GRA蛋白定位到PV和PVN[22]，維持PV的形態(tài)。NcNTPase缺乏NDPK活性，并且在強毒株中表達(dá)量更高。NcNTPaes和NcGRA7在入侵和逸出早期會上調(diào)并磷酸化[16]，說明二者可能在參與蟲體分裂周期中起到協(xié)同調(diào)控作用。

4 其他分泌蛋白

除了上述三大分泌蛋白，近年來報道的菱形蛋白酶(Rhomboids，ROM)也是重要的分泌蛋白，菱形蛋白酶作為一種絲氨酸蛋白酶，對蟲體入侵起關(guān)鍵作用，是重要的疫苗靶點。

目前在包括泰勒蟲、巴貝斯蟲、瘧原蟲和弓形蟲等多種頂復(fù)亞門原蟲中都有菱形蛋白酶的報道[23]，弓形蟲菱形蛋白酶能夠識別和切割黏附素，使蟲體不再黏附于宿主表面，從而進(jìn)入宿主細(xì)胞中。菱形蛋白酶還在線粒體融合、生長因子信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[24]。目前尚未有關(guān)于新孢子蟲菱形蛋白的報道，但是ROM基因的氨基酸序列在頂復(fù)門原蟲中保守，其功能可能也相似。

5 展望

新孢子蟲病對養(yǎng)牛業(yè)危害嚴(yán)重，是近年來備受重視的寄生蟲病，至今沒有有效的藥物和疫苗用于該病的防控。分泌蛋白在新孢子蟲的生命活動中發(fā)揮重要作用，有些重要蛋白可能是研制新孢子蟲的藥物和疫苗的重要靶點。目前關(guān)于許多新孢子蟲分泌蛋白的研究較為淺顯，對其功能、機制及其在新孢子蟲病防控中的作用均需深入研究。當(dāng)前，新的生物學(xué)技術(shù)不斷開發(fā)和應(yīng)用，為新孢子蟲病的深入研究提供了更好的機會，新孢子蟲分泌蛋白的鑒定、功能及其作用機制的深入研究，能夠為全面解析其致病機制和防控技術(shù)的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。