豬乙型腦炎傳代細胞活疫苗保護劑的效力試驗

韓 偉 ， 劉艷彬 ， 蔣 利 ， 潘春剛 ， 周建民

(1. 中牧實業(yè)股份有限公司 ， 北京 豐臺 100070 ； 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品與化學藥品重點實驗室 ，北京 海淀 100095 ； 3. 北京市獸用多肽疫苗設計與制備工程技術中心 ， 北京 海淀 100095)

乙型腦炎病毒又稱日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，簡稱乙腦病毒，所引起的疾病稱乙型腦炎，是最常見的以三帶喙庫蚊為主要傳播媒介的病毒性腦炎，它是嚴重威脅人畜健康的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性傳染病[1]。JEV是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一。豬是JEV的重要儲存宿主和擴增宿主，是乙型腦炎的主要傳染源。預防和控制豬乙型腦炎的最有效方法是接種疫苗。而疫苗在保存、運輸和使用過程中均需要使用凍干保護劑。傳統(tǒng)的疫苗保護劑主要配方為脫脂牛奶、蔗糖、明膠等，組方簡單、配制簡便、易溶性良好，但熱穩(wěn)定性和保護功能差，產(chǎn)品的保存條件較為苛刻，大多需要在-15 ℃以下保存。在疫苗生產(chǎn)、運輸和使用過程中，如果冷鏈系統(tǒng)控制不當，疫苗保存環(huán)境溫度升高，常常導致疫苗效力下降或失效，造成免疫失敗。耐熱凍干保護劑比傳統(tǒng)凍干保護劑更周到地考慮了具有生物活性的制品在較高溫度和較長時間保存的情況下，凍干物質(zhì)可能產(chǎn)生的物理和化學變化對活疫苗存活的影響，通過填充、防凍、抗氧化、酸堿調(diào)整、羥基中和等一系列機制，確保病毒在2～8 ℃條件下保存期可達24個月，效價無明顯下降，即使在較高的常溫甚至37 ℃也可以保存10 d以上，因而其保護性能要比傳統(tǒng)保護劑更為優(yōu)良，從而使活苗的儲存、運輸和使用更方便、經(jīng)濟[2]。而JEV在環(huán)境中極不穩(wěn)定，在-20 ℃條件下僅可保存1年，且病毒滴度下降較快。因此研制豬乙型腦炎耐熱凍干保護劑對該疫苗的保存和運輸具有重要的作用和意義，有利于預防該病毒的流行和傳播。

1 材料與方法

1.1 細胞與毒種 Vero細胞、BHK-21細胞和JEV(SA14-14-2株，第10代)、JEV P3株，均由中牧實業(yè)股份有限公司保存、提供。

1.2 實驗動物 ICR小鼠，10～12 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016—0006。

1.3 主要試劑 甲基纖維素，購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶，均購自Gibco公司；結(jié)晶紫、明膠、蔗糖、乳糖、甘氨酸、谷氨酸鈉、海藻糖等試劑，均為北京市化學試劑公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 抗原液的制備 用3 L轉(zhuǎn)瓶將Vero細胞培養(yǎng)72～96 h，接種3 mL JEV毒液(病毒含量為1.2×107PFU/mL)，37 ℃吸附60 min，補加含2%胎牛血清的DMEM維持液(pH 7.8)，35 ℃ 12 r/h旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)96 h后收獲毒液，凍融1次，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 病毒含量的測定 采用病毒蝕斑試驗進行病毒含量的測定。將疫苗用疫苗稀釋液稀釋至1頭份/mL，然后進行10倍系列稀釋，取10-2、10-3和10-4共3個稀釋度，分別接種于生長BHK-21單層細胞的12孔細胞板中，每個稀釋度設3個重復孔，0.1 mL/孔。病毒接種后于37 ℃吸附90 min，加覆蓋物(含1.5%甲基纖維素、2%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基)，5 d后用結(jié)晶紫染色、固定30 min，流水沖洗，干燥后在低倍顯微鏡下計數(shù)各孔蝕斑數(shù)，根據(jù)公式可計算出病毒含量(Log PFU/mL)。

病毒含量(Log PFU/mL)=Log某稀釋度平均蝕斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

1.4.3 保護劑的配制 耐熱凍干保護劑的配制：根據(jù)凍干活疫苗的質(zhì)量要求和各類型原材料的作用機理，將明膠、蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮K90(PVP-K90)、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇-6000(PEG-6000)、吐溫-80、谷氨酸鈉等物質(zhì)按照一定配方比例溶于注射用水中，116 ℃滅菌 30～40 min，使用前調(diào)pH至7.5。傳統(tǒng)凍干保護劑的配制：明膠20 g、蔗糖100 g，加入注射用水定容至1 000 mL，116 ℃滅菌 30～40 min，于2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 保護劑耐老化試驗 取制備的抗原液與耐熱凍干保護劑按1∶1比例混合，定量分裝，以傳統(tǒng)凍干保護劑作對照，用同一凍干曲線進行凍干。比較耐熱凍干保護劑制備的乙型腦炎活疫苗和傳統(tǒng)凍干保護劑制備的乙型腦炎活疫苗的物理性狀、真空度、剩余水分測定、凍干前后疫苗病毒含量損失(重復3次測定)、2～8 ℃保存24個月后抗原病毒含量下降情況(重復3次測定)、25 ℃常溫保存2個月后疫苗病毒含量下降情況(重復3次測定)、37 ℃保存10 d后抗原病毒含量下降情況(重復3次測定)等指標。

1.4.5 凍干曲線 凍干曲線主要參數(shù)：預凍階段疫苗最低溫度-40 ℃，疫苗達到最低溫度后維持時間2 h；升華干燥階段疫苗最終溫度-20 ℃，疫苗達到最終溫度的運行時間16 h，凍干箱真空控制壓力0.18 mbar；解析干燥階段疫苗的最終溫度28 ℃，凍干箱真空壓力0.005 mbar，運行時間8 h。

1.4.6 對小鼠免疫原性試驗 免疫組取上述耐熱凍干保護劑制備的疫苗(疫苗1)和傳統(tǒng)凍干保護劑制備的疫苗(疫苗2)分別用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行10倍系列稀釋，取10-2、10-3和10-4共3個稀釋度，每個稀釋度取0.1 mL皮下接種ICR小鼠10只，免疫1次，全部小鼠于免疫后14 d用JEV P3株腹腔攻毒，每只小鼠腹腔注射0.3 mL[不低于500 半數(shù)致死量(LD50)]，同時腦內(nèi)空刺，破壞血腦屏障，另設同批次攻毒對照組小鼠10只，不進行免疫，但與免疫組同時進行攻毒。攻毒后3 d內(nèi)死亡小鼠不計，其余觀察14 d，對照組小鼠應出現(xiàn)腦炎綜合癥，且死亡率達80%，計算各免疫組半數(shù)有效劑量(ED50)。

2 結(jié)果

2.1 抗原液的制備和病毒含量測定 用3 L轉(zhuǎn)瓶進行抗原液的培養(yǎng)，抗原液病毒含量為6.8 Log PFU/mL。

2.2 耐熱凍干保護劑配方 按重量百分比計，明膠1.0%～1.4%、蔗糖9%～11%、海藻糖9%～11%、PVP-K90 0.15%～0.35%、山梨醇0.3%～0.8%、甘露醇0.3%～ 0.8%、PEG-6000 0.1%～0.2%、吐溫-80 0.01%～0.02%、谷氨酸鈉0.8%～1.2%，余量為注射用水，并用1 N鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.5，通過高溫滅菌步驟制備耐熱凍干保護劑。

2.3 保護劑耐老化試驗

2.3.1 物理性狀 耐熱凍干保護劑制備的乙型腦炎活疫苗和傳統(tǒng)凍干保護劑制備的乙型腦炎活疫苗均呈現(xiàn)淡紅色、質(zhì)地均勻一致的疏松體(凍干塊無皺縮、分層現(xiàn)象)，復溶后快速溶解為無異物的粉紅色澄清液體。

2.3.2 真空度的測定 按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》[3]對耐熱凍干保護劑制備的乙型腦炎活疫苗和傳統(tǒng)凍干保護劑制備的乙型腦炎活疫苗進行真空度測定，均出現(xiàn)紫色輝光，真空度合格。

2.3.3 剩余水分測定 按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》[3]對耐熱凍干保護劑制備的乙型腦炎活疫苗和傳統(tǒng)凍干保護劑制備的乙型腦炎活疫苗進行剩余水分測定，剩余水分均不超過4.0%，分別為2.7%和3.1%。

2.3.4 凍干前后疫苗病毒含量的測定 耐熱凍干保護劑制備的乙型腦炎活疫苗凍干前后抗原的病毒含量下降不超過0.5 Log PFU/mL，傳統(tǒng)凍干保護劑制備的乙型腦炎活疫苗凍干前后抗原的病毒含量下降超過0.5 Log PFU/mL(表1)。

表1 使用不同保護劑凍干前后病毒含量的變化Table 1 Changes of virus content before and after freeze-drying with different lyophilized protective agents (Log PFU/mL)

2.3.5 2～8 ℃保存24個月后抗原病毒含量的測定 經(jīng)2～8 ℃保存24個月后,耐熱凍干保護劑制備的乙型腦炎活疫苗的抗原病毒含量下降不超過1.0 Log PFU/mL，傳統(tǒng)凍干保護劑制備的乙型腦炎活疫苗的抗原含量下降超過3.0 Log PFU/mL(表2)。

表2 使用不同保護劑2～8 ℃保存24個月后病毒含量的變化Table 2 Changes of virus content after 24 months of storage at 2-8 ℃ with different lyophilized protective agents (Log PFU/mL)

2.3.6 25 ℃保存2個月后抗原病毒含量的測定 經(jīng)25 ℃保存2個月后,耐熱凍干保護劑制備的乙型腦炎活疫苗的抗原病毒含量下降不超過1.0 Log PFU/mL，傳統(tǒng)凍干保護劑制備的乙型腦炎活疫苗的抗原含量下降約2.0 Log PFU/mL(表3)。

表3 使用不同保護劑25 ℃保存2個月后病毒含量的變化Table 3 Changes of virus content after 2 months of storage at 25 ℃ with different lyophilized protective agents (Log PFU/mL)

2.3.7 37 ℃保存10 d后抗原病毒含量的測定 經(jīng)37 ℃保存10 d后,耐熱凍干保護劑制備的乙型腦炎活疫苗的抗原病毒含量下降不超過1.5 Log PFU/mL，傳統(tǒng)凍干保護劑制備的乙型腦炎活疫苗的病毒含量下降超過1.5 Log PFU/mL(表4)。

表4 使用不同保護劑37 ℃保存10 d后病毒含量的變化Table 4 Changes of virus content after 10 d of storage at 37 ℃ with different lyophilized protective agents (Log PFU/mL)

2.4 對小鼠免疫原性試驗 使用耐熱凍干保護劑制備的活疫苗(疫苗1)和使用傳統(tǒng)凍干保護劑制備的活疫苗(疫苗2)對小鼠的免疫原性相當，半數(shù)有效劑量分別為10-3.12/0.1 mL和10-3.11/0.1 mL(表5)。

表5 接種小鼠死亡情況及半數(shù)有效劑量測定Table 5 Death of inoculated mice and half effective dose determination

3 討論

豬乙型腦炎是由JEV引起的一種動物和人類共患的傳染病，疫苗接種是防控豬乙型腦炎的最有效方法之一。我國已批準的豬乙型腦炎活疫苗(SA14-14-2株)在2～8 ℃條件下的有效期只有6個月[4]。疫苗耐熱性能差，使得保存、運輸和使用效果大大降低。目前，國內(nèi)大多采用傳統(tǒng)的疫苗保護劑，主要配方為脫脂牛奶、蔗糖、明膠等，組方簡單、配制簡便、易溶性良好，但熱穩(wěn)定性和保護功能差，產(chǎn)品大多在-15 ℃以下保存。國外采用低聚糖、多元醇、蛋白、抗氧化劑、緩沖劑、填充劑等復合組方配伍的耐熱凍干保護劑，制備的凍干活疫苗在2～8 ℃條件下保存期可達24個月[5]，其保護性能比傳統(tǒng)保護劑更優(yōu)良，使活苗的儲存、運輸和使用更方便、經(jīng)濟。已有耐熱保護劑應用于乙型腦炎疫苗的制備中，潘春剛等[2]研制了一種豬JEV活疫苗耐熱凍干保護劑，將其與豬JEV活疫苗病毒液混合，冷凍干燥后即得凍干疫苗，疫苗凍干前后病毒含量下降不超過1.0 Log PFU/mL，疫苗經(jīng)2～8 ℃保存24個月后抗原病毒含量下降不超過1.0 Log PFU/mL，疫苗經(jīng)37 ℃保存10 d后抗原病毒含量下降不超過1.5 Log PFU/mL，同本試驗結(jié)果一致。耐熱凍干保護劑配方簡單，制備簡易，適于大規(guī)模生產(chǎn)，對疫苗具有良好的保護功效。巢偉等[6]研發(fā)了一種活疫苗的耐熱凍干保護劑，與傳統(tǒng)的保護劑相比，其更能有效地保護疫苗中病毒的活力，37 ℃耐熱超過20 d，2～8 ℃能保存2年以上，每頭份病毒含量均高于國家標準[每頭份病毒含量≥105.7半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量(TCID50)][3]，同本試驗結(jié)果一致。

耐熱凍干保護劑應用前景廣闊，國外許多生物疫苗公司都會加入耐熱凍干保護劑制備疫苗[7]。國內(nèi)獸用生物制品保護劑的研發(fā)相對滯后，近幾年也有許多科研單位正致力于耐熱保護劑的研究并取得了一定的成果。王穎等[8]選用谷氨酸鈉、L-精氨酸鹽酸鹽、D-山梨醇、酶解酪蛋白、海藻糖、明膠、蔗糖、牛血清白蛋白等組分配制耐熱保護劑凍干豬偽狂犬病病毒，經(jīng)37 ℃保存7 d及2～8 ℃保存24個月，三批疫苗病毒滴度分別下降0.55、0.62、0.47 Log TCID/0.1 mL及0.47、0.51、0.41 Log TCID/0.1 mL，表明該疫苗熱穩(wěn)定性良好。趙艷紅等[9]采用耐熱凍干保護劑凍干鴨肝炎病毒，于37 ℃保存10 d、15 d，病毒損失分別為0.35 Log、0.61 Log，于2～8 ℃可保存2年。孫德君等[10]應用海藻糖、葡萄糖、明膠、硫脲和聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP-K30)等組分制備雞傳染性支氣管炎活疫苗，使凍干時間由48 h縮短至24 h，且耐熱后疫苗病毒滴度下降減少，疫苗2～8 ℃保存期達36個月，疫苗的效力更加穩(wěn)定，安全性更好。孫德君等[11]應用海藻糖、甘露醇、多聚蛋白胨等制備雞痘耐熱保護劑活疫苗，使凍干時間縮短至24 h，疫苗在2～8 ℃條件下可以保存36個月，耐熱后疫苗病毒滴度下降減少，效力更加穩(wěn)定。陳生雷等[12]應用耐熱凍干保護劑制備雞新城疫、支氣管炎二聯(lián)活疫苗，置37 ℃ 10 d后病毒含量下降幅度均不超過1個滴度，保護劑的性能穩(wěn)定。李自波等[13]應用耐熱凍干保護劑制備雞新城疫活疫苗(Lasota株)，其可在2～8 ℃保存24個月，且在37 ℃可至少保存1周，可有效減少運輸、使用過程中的損失。萬成燕等[14]應用明膠、海藻糖、蔗糖、L-谷氨酸鈉、精氨酸、PVP-K30、甘露醇等組分制備偽狂犬耐熱凍干活疫苗，37 ℃放置15 d病毒含量降低小于0.3個滴度，滴度降低少，保存時間長。張述斌等[15]應用聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、谷氨酸鈉等制備羊口瘡活疫苗，使得活疫苗凍干粉在25 ℃可保存2個月，2～8 ℃條件下可保存24個月。丁旭娜等[16]應用明膠、海藻糖、L-精氨酸、谷氨酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮等組分制備豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)凍干活疫苗，在37 ℃放置14 d后病毒含量下降不超過0.5個滴度，在2～8 ℃保存30個月后，疫苗仍保持凍干后的外形，病毒含量仍≥105.0TCID50/mL。

疫苗免疫小鼠后用強毒進行攻擊，為傳統(tǒng)的乙腦疫苗免疫效果評價的方法之一?？讒悑怺17]使用市售弱毒SA14-14-2株疫苗免疫小鼠后腹腔攻毒，保護率為70%，結(jié)果表明該疫苗具有很好的免疫原性。賈麗麗等[18]用小鼠保護力試驗測定乙腦活疫苗SA14-14-2株對國內(nèi)外不同野毒株的攻擊保護作用，結(jié)果表明該疫苗具有廣譜和良好的免疫原性。岳廣智等[19]比較乙型腦炎活疫苗與滅活疫苗對小鼠的免疫原性，結(jié)果表明活疫苗免疫后小鼠中和抗體水平雖然很低，但仍有很強的保護力。本試驗采用耐熱凍干保護劑制備的乙型腦炎活疫苗與上述報道一致，可以刺激小鼠機體產(chǎn)生良好的免疫應答，對小鼠有免疫保護作用。

本試驗制備的耐熱凍干保護劑能夠減少疫苗制品在冷凍干燥過程中各種理化因素對病毒活性的損傷，使凍干后病毒的損失率降低，不超過1.0 Log PFU/mL。有效解決了傳統(tǒng)保護劑活疫苗需冷凍運輸、儲存不便等問題。