南疆與北疆代表性規(guī)?；i場(chǎng)沙門菌耐藥性的比較分析

軒慧勇 ， 陳月月 ， 易海波 ， 徐琦琦 ， 秦 蕾 ， 吳慧敏 ， 夏利寧

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 新疆 烏魯木齊 830052 ； 2. 新疆霍城縣職業(yè)技術(shù)學(xué)校 ， 新疆 霍城 835200 ；3. 新疆昭蘇縣喀夏加爾鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站 ， 新疆 昭蘇 835618)

沙門菌(Salmonella)是腸桿菌科沙門菌屬的兼性厭氧革蘭陰性菌，是一種可以在人畜之間直接或間接傳播的重要人獸共患病原菌[1]，其宿主廣泛，而豬和雞是沙門菌的主要儲(chǔ)存宿主[2]。目前，抗菌藥物是治療細(xì)菌性疾病的重要手段之一，但隨著抗菌藥物的不合理使用，導(dǎo)致耐藥沙門菌甚至是多重耐藥沙門菌的出現(xiàn)[3]。耐藥沙門菌可作為攜帶耐藥質(zhì)粒、整合子和轉(zhuǎn)座子等可轉(zhuǎn)移元件的供體菌，將耐藥基因轉(zhuǎn)移到其他細(xì)菌宿主的基因組或質(zhì)粒中，促進(jìn)更具毒性和耐藥性的分離株出現(xiàn)[4-5]，導(dǎo)致更難以治療的感染發(fā)生，阻礙養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的同時(shí)也對(duì)公共衛(wèi)生健康造成嚴(yán)重威脅。新疆地域遼闊，有南疆和北疆之分，隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，細(xì)菌耐藥問(wèn)題也凸顯出來(lái)，但有關(guān)新疆不同地域沙門菌耐藥現(xiàn)狀的研究報(bào)道較少，因此有必要針對(duì)不同地區(qū)開(kāi)展沙門菌耐藥性調(diào)查，以給予豬場(chǎng)用藥指導(dǎo)。本試驗(yàn)選取新疆南北疆代表性地區(qū)焉耆縣和石河子市豬場(chǎng)分離的豬源沙門菌，比較其對(duì)12種抗菌藥物的耐藥表型，分析其耐藥基因型的差異，結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果可指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物以治療豬源沙門菌病。本試驗(yàn)對(duì)兩地區(qū)不同豬場(chǎng)豬源沙門菌進(jìn)行耐藥性調(diào)研和耐藥基因檢測(cè)，以期為沙門菌的防控工作提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源 2019年5月在新疆北疆地區(qū)石河子市1個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)采集豬肛拭子樣品200份，經(jīng)用藥情況調(diào)研，該豬場(chǎng)曾使用土霉素、氟苯尼考、新諾明、多西環(huán)素、青霉素和恩諾沙星等藥物。2019年10月在新疆南疆地區(qū)焉耆縣1個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)采集豬肛拭子樣品300份，經(jīng)用藥情況調(diào)研，該豬場(chǎng)曾使用氟苯尼考、頭孢噻呋、慶大霉素、二甲氧芐胺嘧啶(敵菌凈)和慶大霉素等藥物。

1.2 培養(yǎng)基與試劑 SS瓊脂培養(yǎng)基和沙門顯色培養(yǎng)基，均購(gòu)自?shī)W博星生物技術(shù)有限公司(北京)；甘油和50×TE緩沖液，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；2 000 DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix、瓊脂糖和核酸染料，均購(gòu)自天根生化科技有限公司(北京)。

1.3 沙門菌的分離鑒定 根據(jù)軒慧勇等[6]使用的方法對(duì)樣品進(jìn)行菌株分離，挑取分離的單菌落于沙門顯色培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。純化后的菌株進(jìn)行沙門菌特異性侵襲基因invA的鑒定[7]，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)加核酸染料的1.0%瓊脂糖凝膠電泳后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)，同源性>96%的判定為沙門菌。在裝有400 μL新鮮菌液的2 mL無(wú)菌EP管中，加入200 μL 60%甘油，一式兩份，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 最小抑菌濃度值測(cè)定 本試驗(yàn)采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)[8]發(fā)布的M100-S23，運(yùn)用瓊脂稀釋法檢測(cè)沙門菌對(duì)12種抗菌藥物的最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)值，以大腸桿菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌株，測(cè)試菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果以敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)3種形式記錄。

抗菌藥物包括環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、阿米卡星(Amikacin，AMK)、慶大霉素(Gentamicin，GEN)、氨芐西林(Ampicillin，AMP)、頭孢噻呋(Ceftiofur，CEF)、頭孢曲松(Ceftriaxone，CRO)、亞胺培南(Imipenem，IPM)、四環(huán)素(Tetracycline，TET)、氟苯尼考(Florfenicol，F(xiàn)FC)、多黏菌素(Polymyxin，CL)、磺胺異噁唑(Sulfaisoxazole，SMZ)和磷霉素(Fosfomycin，F(xiàn)OS)，上述藥物均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.5 耐藥基因檢測(cè) 通過(guò)煮沸法進(jìn)行DNA模板的制備[9]，制備好的DNA模板于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?duì)分離鑒定菌株進(jìn)行blaTEM、blaCMY-2、oqxB、qnrS、oqxA、tetA、tetB、sul1、aadA2、ant(3″)-Ia、floR和aac(6′)-Ib共12種耐藥基因的檢測(cè)，根據(jù)參考文獻(xiàn)[10-14]合成所需要的引物。反應(yīng)體系(20 μL)：2×TaqMaster Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板0.5 μL，加滅菌超純水8.5 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，對(duì)獲取的序列上傳至NCBI進(jìn)行比對(duì)，以同源性大于96.0%的結(jié)果判定為基因比對(duì)結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 不同地區(qū)豬場(chǎng)的耐藥差異性采用SPSS 20軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析，以P<0.05表示有顯著性差異，以P>0.05表示無(wú)顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同豬場(chǎng)豬源沙門菌的分離鑒定 經(jīng)SS培養(yǎng)基、沙門菌顯色培養(yǎng)基和invA基因鑒定，北疆地區(qū)石河子市沙門菌的分離率為40.5%(81/200)，南疆地區(qū)焉耆縣沙門菌的分離率為9.0%(27/300)。

2.2 不同豬場(chǎng)豬源沙門菌的藥敏試驗(yàn) 不同豬場(chǎng)豬源沙門菌對(duì)被檢藥物的耐藥率結(jié)果如表1所示，焉耆縣豬場(chǎng)分離的豬源沙門菌對(duì)磺胺異噁唑的耐藥率高達(dá)100.0%，對(duì)氟苯尼考(55.6%)和四環(huán)素(40.7%)的耐藥率也超過(guò)40.0%；石河子市豬場(chǎng)分離的豬源沙門菌對(duì)磺胺異噁唑耐藥率高達(dá)100.0%，對(duì)環(huán)丙沙星、氨芐西林、氟苯尼考和四環(huán)素的耐藥率超過(guò)70.0%。不同地區(qū)豬場(chǎng)分離的豬源沙門菌均對(duì)阿米卡星、頭孢曲松、亞胺培南、多黏菌素和磷霉素高度敏感，無(wú)耐藥菌株檢出。經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析，石河子市豬場(chǎng)豬源沙門菌對(duì)環(huán)丙沙星、氨芐西林、頭孢噻呋和四環(huán)素的耐藥率顯著高于焉耆縣豬場(chǎng)豬源沙門菌(P<0.05)；焉耆縣豬場(chǎng)豬源沙門菌對(duì)慶大霉素的耐藥率顯著高于石河子市豬場(chǎng)豬源沙門菌(P<0.05)；不同地區(qū)豬場(chǎng)豬源沙門菌對(duì)氟苯尼考和磺胺異噁唑耐藥率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表1 不同豬場(chǎng)豬源沙門菌的耐藥率比較Table 1 Comparison of drug resistance rates of Salmonella strains from different pig farms

2.3 不同豬場(chǎng)豬源沙門菌多藥耐藥性 不同豬場(chǎng)豬源沙門菌對(duì)被檢抗菌藥物的多藥耐藥性結(jié)果如圖1所示，不同豬場(chǎng)豬源沙門菌對(duì)被檢12種抗菌藥物的多藥耐藥在1～6耐分布，焉耆縣豬場(chǎng)豬源沙門菌多藥耐藥以5耐為主(14.8%，4/27)，單藥耐藥占48.2%(13/27)；石河子市豬場(chǎng)豬源沙門菌多藥耐藥主要集中在5耐(59.2%)和6耐(17.3%)，占76.5%。

圖1 不同地區(qū)豬場(chǎng)豬源沙門菌多重耐藥性Fig.1 Multidrug resistance of Salmonella strains from different pig farms不同地區(qū)比較，*：P<0.05;下圖同Comparison of different regions,*：P<0.05. The same as below

2.4 不同豬場(chǎng)豬源沙門菌的耐藥基因檢測(cè) 不同豬場(chǎng)豬源沙門菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，焉耆縣豬場(chǎng)豬源沙門菌中檢出所有被檢耐藥基因，其中floR耐藥基因檢出率最高，達(dá)40.7%，ant(3″)-Ia和sul1基因檢出率次之，均為33.3%，其余耐藥基因的檢出率介于3.7%～22.2%；石河子市豬場(chǎng)豬源沙門菌的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示：除blaCMY-2和tetA基因未檢出外，其他被檢耐藥基因的檢出率均高于焉耆縣，對(duì)blaTEM(74.1%)、tetB(76.5%)、oqxA(77.8%)、aadA2(77.8%)、ant(3″)-Ia(77.8%)和sul1(77.8%)基因的檢出率均在70.0%以上，對(duì)floR、qnrS、oqxB和aac(6′)-Ib基因的檢出率依次為66.7%、64.2%、53.1%和49.4%。

圖2 不同地區(qū)豬場(chǎng)豬源沙門菌耐藥基因檢測(cè)Fig.2 Detection of drug resistance genes in Salmonella strains from different pig farms

3 討論

3.1 沙門菌的耐藥性 沙門菌作為人獸共患病病原菌可引起人和動(dòng)物的多種疾病，隨著耐藥沙門菌的出現(xiàn)，對(duì)人類健康造成威脅，且延長(zhǎng)動(dòng)物疾病治療時(shí)間，增加治療成本。新疆地廣人稀，南北疆路途遙遠(yuǎn)，不同地域之間動(dòng)物源沙門菌耐藥性是否存在差異值得研究。本試驗(yàn)中新疆南北疆地區(qū)不同豬場(chǎng)豬源沙門菌對(duì)磺胺異噁唑的耐藥率均高達(dá)100.0%，耐藥率結(jié)果高于段瑤等[15](73.32%)和彭斌等[16](61.5%)報(bào)道的沙門菌對(duì)磺胺異噁唑的耐藥率；本試驗(yàn)中，不同豬場(chǎng)豬源沙門菌對(duì)氟苯尼考的耐藥率均超過(guò)50.0%，說(shuō)明有必要對(duì)耐藥菌株進(jìn)行深入研究與緊急預(yù)防。

值得注意的是，新疆南北疆地區(qū)不同豬場(chǎng)豬源沙門菌整體耐藥結(jié)果趨勢(shì)相同，都有環(huán)丙沙星、氨芐西林、四環(huán)素、氟苯尼考和磺胺異噁唑耐藥菌株檢出。但北疆地區(qū)石河子市豬源沙門菌耐藥情況更嚴(yán)峻，對(duì)氨芐西林和環(huán)丙沙星的耐藥率均高達(dá)80.0%以上，對(duì)四環(huán)素和氟苯尼考的耐藥率也超過(guò)70.0%，該結(jié)果低于加春生[14]的研究結(jié)果(對(duì)氨芐西林耐藥率達(dá)到100.0%，對(duì)四環(huán)素耐藥率達(dá)到88.0%)。此外，北疆地區(qū)石河子市豬場(chǎng)豬源沙門菌對(duì)環(huán)丙沙星、氨芐西林、頭孢噻呋和四環(huán)素這4種抗菌藥物的耐藥率均顯著高于南疆地區(qū)焉耆縣豬場(chǎng)豬源沙門菌，造成這種現(xiàn)象的原因可能是：石河子市作為新疆重要的畜牧養(yǎng)殖地，養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展趨于集約化大規(guī)模養(yǎng)殖，長(zhǎng)期處于低劑量的抗菌藥物選擇壓力下，更易于耐藥菌的產(chǎn)生。而焉耆縣作為回族自治縣，養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展較滯后，抗菌藥物的使用頻率和劑量較少，因此耐藥率低于石河子市豬源沙門菌。焉耆縣和石河子市豬場(chǎng)豬源沙門菌均對(duì)慶大霉素具有較好的敏感性，焉耆縣豬場(chǎng)豬源沙門菌對(duì)慶大霉素的耐藥率為11.1%，石河子市豬場(chǎng)豬源沙門菌對(duì)慶大霉素完全敏感。不同地區(qū)豬場(chǎng)豬源沙門菌均無(wú)阿米卡星、頭孢曲松、亞胺培南、多黏菌素和磷霉素耐藥菌株檢出，與曹陽(yáng)等[17]報(bào)道的耐藥結(jié)果一致。

本試驗(yàn)多藥耐藥結(jié)果顯示，石河子市豬場(chǎng)豬源沙門菌的多藥耐藥以5耐為主，焉耆縣豬場(chǎng)豬源沙門菌多藥耐藥雖然也以5耐為主，但其數(shù)量遠(yuǎn)低于石河子市豬場(chǎng)豬源沙門菌的多藥耐藥，其單藥耐藥沙門菌數(shù)量占主導(dǎo)。因此不同地區(qū)豬場(chǎng)可結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果，合理選用抗菌藥物提高療效，以降低耐藥菌的出現(xiàn)。

3.2 沙門菌的耐藥基因 耐藥基因的攜帶不僅使細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性升高，并且會(huì)造成環(huán)境污染，導(dǎo)致更嚴(yán)重的耐藥性產(chǎn)生。本試驗(yàn)?zāi)退幓驒z測(cè)結(jié)果顯示，焉耆縣和石河子市不同豬場(chǎng)豬源沙門菌中耐藥基因攜帶率不同，石河子市豬場(chǎng)豬源沙門菌耐藥基因攜帶率高，10種耐藥基因檢出率都超過(guò)49.0%；而焉耆縣豬場(chǎng)豬源沙門菌耐藥基因攜帶種類更多，12種耐藥基因都有檢出，但耐藥基因檢出率均低于41.0%。結(jié)合耐藥結(jié)果可以看出，耐藥基因攜帶率與耐藥率呈正相關(guān)。有趣的是，焉耆縣豬場(chǎng)豬源沙門菌耐藥率和多藥耐藥率都低于石河子市，盡管基因的檢出種類高于石河子市，但檢出基因的攜帶率都遠(yuǎn)低于石河子市。比較發(fā)現(xiàn)，焉耆縣豬場(chǎng)豬源沙門菌對(duì)四環(huán)素的耐藥性是由tetA(22.2%)和tetB(29.7%)這2種基因共同作用的結(jié)果，而石河子市豬場(chǎng)豬源沙門菌對(duì)四環(huán)素的耐藥性主要是由tetB(76.5%)基因介導(dǎo)。焉耆縣豬場(chǎng)豬源沙門菌對(duì)氨芐西林的耐藥性主要由blaTEM和blaCMY-2基因共同介導(dǎo)，但石河子市豬場(chǎng)豬源沙門菌對(duì)氨芐西林的耐藥性主要由blaTEM基因介導(dǎo)。以上結(jié)果說(shuō)明，雖然對(duì)同一種抗菌藥物耐藥，但不同地區(qū)豬場(chǎng)主要流行的耐藥基因型不同。不同地區(qū)豬場(chǎng)豬源沙門菌對(duì)酰胺醇類耐藥基因floR的檢出率均在40.0%以上，遠(yuǎn)低于王剛等[18]報(bào)道的西藏地區(qū)豬源沙門菌floR耐藥基因的檢出率(96.96%)，氟苯尼考作為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)使用的動(dòng)物專用抗菌藥，臨床中的長(zhǎng)期使用不僅導(dǎo)致沙門菌對(duì)其耐藥率提高，相關(guān)耐藥基因的攜帶率也升高。在養(yǎng)殖過(guò)程中，需要實(shí)時(shí)跟蹤細(xì)菌耐藥情況的變化，制備更科學(xué)的治療方案。

此外，腸道作為耐藥基因的儲(chǔ)存庫(kù)，腸道菌群在獲得耐藥性后，往往可以通過(guò)多種方式將耐藥性傳播，如喹諾酮類耐藥基因可通過(guò)質(zhì)粒進(jìn)行傳遞，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥現(xiàn)象[19]，還可通過(guò)轉(zhuǎn)座子和整合子在不同細(xì)菌之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，而新型耐藥基因的發(fā)現(xiàn)[如已報(bào)道的tet(X5)、tet(X6)等]證實(shí)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的速度極快[20]。因此研究沙門菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播，對(duì)于耐藥菌株的追蹤溯源和預(yù)防控制具有重要意義。

綜上所述，新疆石河子市豬場(chǎng)豬源沙門菌對(duì)環(huán)丙沙星、氨芐西林和四環(huán)素的耐藥率高于焉耆縣豬場(chǎng)豬源沙門菌，在進(jìn)行沙門菌病治療時(shí)，可選用敏感性高的抗菌藥物，如慶大霉素、頭孢曲松等。石河子市豬場(chǎng)豬源沙門菌耐藥基因攜帶率高，但焉耆縣豬場(chǎng)豬源沙門菌耐藥基因攜帶種類更多，且耐藥率與耐藥基因呈正相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果可為不同地區(qū)豬場(chǎng)豬源沙門菌病的治療和合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。