4種膠體金試紙條檢測牛布魯氏菌病的比較分析

董 浩 ， 李巧玲 ， 孫佳麗 ， 馮 宇 ， 蔣 卉 ， 沈青春 ，許冠龍 ， 朱良全 ， 秦玉明 ， 梁春南

(1.中國食品藥品檢定研究院 ， 北京 大興 102600 ； 2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ， 北京 大興 102618)

膠體金免疫層析法已被作為一種布魯氏菌病(簡稱“布病”)的初篩方法納入我國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《布魯氏菌病診斷》(WS 269—2019)，但是該方法尚未被收入我國動物布魯氏菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)之中。在實(shí)際生產(chǎn)養(yǎng)殖、產(chǎn)地檢疫等情況下，膠體金作為一種快速、敏感的現(xiàn)場檢測方法，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。本試驗(yàn)分別對4種品牌的膠體金試紙條的敏感性、特異性、重復(fù)性進(jìn)行了比較，并使用膠體金試紙條、虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(cELISA)對A19疫苗免疫的牛血清樣品進(jìn)行了檢測，較全面地對4種品牌的膠體金試紙條的牛血清布病抗體檢測性能進(jìn)行評估，以期為畜間布魯氏菌病的防控提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 血清樣品 114份牛A19疫苗免疫血清采自陜西省某奶牛場，牛群免疫前已經(jīng)過cELISA檢測，全部為陰性。該牛群免疫前采集的本底血清為本試驗(yàn)中使用的布病陰性牛血清，用于牛布魯氏菌病標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的稀釋，膠體金的特異性和重復(fù)性比較。牛布魯氏菌病標(biāo)準(zhǔn)陽性血清由國家/世界動物衛(wèi)生組織(OIE)動物布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑 布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原、布魯氏菌試管凝集試驗(yàn)抗原和布魯氏菌病cELISA試劑盒，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；牛布魯氏桿菌病抗體快速檢測試劑盒，購自廣州悅洋生物技術(shù)有限公司；布氏桿菌抗體快速檢測卡，購自深圳市易瑞生物技術(shù)股份有限公司；布魯氏菌抗體金標(biāo)快速檢測卡(競爭法)，購自浙江迪恩生物科技股份有限公司；牛羊布魯氏菌抗體一步法膠體金快速檢測卡，購自上?？祆`生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法 虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和cELISA按照《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》(GB/T18646—2018)進(jìn)行。4種膠體金試紙條按照商品說明書的相關(guān)要求對牛血清樣品進(jìn)行檢測。

1.3.2 敏感性比較 使用布病陰性牛血清將牛布魯氏菌病標(biāo)準(zhǔn)陽性血清依次稀釋至40、20、10、5 IU和2.5 IU，分別使用4種膠體金試紙條和布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原對上述稀釋的牛血清樣品進(jìn)行檢測，每個(gè)稀釋度的血清樣品進(jìn)行3次重復(fù)。

1.3.3 特異性比較 分別使用4種膠體金試紙條對A型口蹄疫疫苗免疫陽性血清、O型口蹄疫疫苗免疫陽性血清、牛沙門菌病疫苗免疫陽性血清和牛巴氏桿菌病疫苗免疫陽性血清進(jìn)行檢測，并比較它們的特異性。除此之外，還使用27份經(jīng)過cELISA檢測為布魯氏菌病抗體陰性的牛血清樣品對4種膠體金的特異性進(jìn)行進(jìn)一步評價(jià)。

1.3.4 重復(fù)性比較 分別使用4種膠體金試紙條對3份布病陰性牛血清和3份布病陽性牛血清進(jìn)行5次重復(fù)檢測，比較4種膠體金試紙條的重復(fù)性。

1.3.5 臨床樣品檢測 分別使用4種膠體金試紙條、虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原、試管凝集試驗(yàn)抗原和布魯氏菌病cELISA試劑盒對114份臨床牛血清進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 不同種膠體金的初步比較 根據(jù)4種膠體金的產(chǎn)品說明書，對4種膠體金的檢測原理、樣品需求量、檢測操作和判定時(shí)間進(jìn)行了初步比較，結(jié)果如表1所示。

表1 4種膠體金的初步比較Table 1 Preliminary comparison of four colloidal gold strips

2.2 不同種膠體金試紙條敏感性的比較 使用4種膠體金試紙條和虎紅平板凝集抗原分別對效價(jià)為40、20、10、5 IU和2.5 IU的牛血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：A公司和B公司的膠體金進(jìn)行3次檢測全為陽性的最低效價(jià)均為2.5 IU；C公司和D公司的膠體金進(jìn)行3次檢測全為陽性的最低效價(jià)均為10 IU。4種膠體金試紙條的敏感性均高于虎紅平板凝集試驗(yàn)。不同效價(jià)牛血清的3次檢測結(jié)果如表2所示。

表2 4種膠體金試紙條和虎紅平板凝集抗原的敏感性比較Table 2 Sensitivity comparison of four colloidal gold strips and rose bengal plate test

2.3 不同種膠體金試紙條特異性的比較 4種膠體金試紙條對A型口蹄疫疫苗免疫陽性血清、O型口蹄疫疫苗免疫陽性血清、牛沙門菌病疫苗免疫陽性血清、牛巴氏桿菌病疫苗免疫陽性血清樣品均不發(fā)生交叉反應(yīng)。采用4種膠體金試紙條對27份臨床布病陰性牛血清進(jìn)行檢測，結(jié)果也全部為陰性，說明4種膠體金試紙條都具有良好的特異性。

2.4 不同種膠體金試紙條重復(fù)性的比較 4種膠體金試紙條在對3份已知布病陽性牛血清的5次檢測中均為陽性，對3份已知布病陰性牛血清的5次檢測中均為陰性。

2.5 不同種膠體金試紙條檢測臨床牛血清效果的比較 檢測結(jié)果如表3所示，在4種膠體金試紙條中，A公司膠體金檢出了97份陽性和17份陰性；B公司膠體金檢出了96份陽性和18份陰性樣品；C公司膠體金檢出了99份陽性和15份陰性樣品；D公司膠體金檢出了88份陽性和26份陰性樣品。

根據(jù)《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》(GB/T18646—2018)，虎紅平板凝集試驗(yàn)是應(yīng)用最廣泛的動物布魯氏菌病初篩方法，試管凝集試驗(yàn)和cELISA可作為動物布魯氏菌病血清學(xué)檢測的確診方法，因此本試驗(yàn)同時(shí)采用了虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和cELISA對上述牛A19疫苗免疫血清樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測出了85份陽性和29份陰性樣品；試管凝集試驗(yàn)檢測出了81份陽性和33份陰性樣品；cELISA檢測出了97份陽性和17份陰性樣品。

為了進(jìn)一步評價(jià)4種膠體金試紙條的效果，本試驗(yàn)分別計(jì)算了4種膠體金試紙條與cELISA結(jié)果的符合率。結(jié)果表明，A公司膠體金與cELISA的符合率為90.35%；B公司膠體金與cELISA的符合率為92.11%；C公司膠體金與cELISA的符合率為87.72%；D公司膠體金與cELISA的符合率為85.09%；虎紅平板凝集試驗(yàn)與cELISA的符合率為86.84%；試管凝集試驗(yàn)與cELISA的符合率為84.21%(表4)。

表4 不同檢測方法與cELISA的符合率Table 4 Coincidence rates of different methods with cELISA (%)

3 討論

布魯氏菌病是一種危害嚴(yán)重的人獸共患病，也是我國法定檢疫和撲殺被感染家畜的3種重大動物疫病(口蹄疫、布魯氏菌病和結(jié)核病)之一[1]。便捷、準(zhǔn)確的檢測方法是家畜布病防控的重要技術(shù)保障。目前，血清學(xué)檢測方法是布病檢測的主要方法，而病原學(xué)檢測方法雖然是布病檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，因?yàn)榇嬖诓僮鲝?fù)雜、實(shí)驗(yàn)周期長、生物安全風(fēng)險(xiǎn)較高、細(xì)菌分離率低等問題，應(yīng)用非常有限。

現(xiàn)行的動物布魯氏菌病檢測國家標(biāo)準(zhǔn)《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》(GB/T18646—2018)，布魯氏菌病的血清學(xué)檢測方法主要有虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、乳環(huán)試驗(yàn)、間接ELISA、cELISA和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等。虎紅平板凝集試驗(yàn)因其操作簡單、成本低廉等原因，廣泛應(yīng)用于基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的布病初篩。但是，虎紅平板凝集試驗(yàn)作為一種初篩試驗(yàn)，它的敏感性偏低，該方法最低可以檢測到22.5 IU的布病抗體。

膠體金免疫層析法是近幾年來新興起的一種檢測方法，該方法操作簡單，且在極短的時(shí)間內(nèi)即可讀取結(jié)果，十分適合動物疫病的現(xiàn)場檢測。目前，已經(jīng)有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了布病診斷用膠體金試紙條的研發(fā)[2-5]和布病膠體金試紙條與其他檢測方法的檢測效果比較[6-8]。

奚德華等[9]采用ELISA方法和膠體金方法分別對奶牛布魯氏菌病進(jìn)行了檢測，其結(jié)果表明膠體金方法的敏感性、特異性和準(zhǔn)確度均可以滿足布病檢測的需求，而且與ELISA 方法相比，膠體金方法不需要專業(yè)的實(shí)驗(yàn)條件，更適用于對奶牛養(yǎng)殖場現(xiàn)場的初篩。董浩等[10]采用膠體金試紙條和虎紅平板凝集試驗(yàn)對658份牛血清樣品進(jìn)行檢測時(shí)，膠體金試紙條比虎紅平板凝集試驗(yàn)多檢測出26份陽性樣品。這些數(shù)據(jù)表明膠體金試紙條比常規(guī)的虎紅平板凝集試驗(yàn)具有更高的敏感性，更利于檢測到動物群體中的弱陽性個(gè)體，也更有利于陽性動物的早期診斷和盡早剔除。

和以往比較不同類型布魯氏菌病檢測方法的研究不同，本試驗(yàn)不僅將膠體金與不同檢測方法之間的效果進(jìn)行比較，還首次對4種不同品牌的膠體金試紙條檢測牛血清樣品的效果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明4種膠體金試紙條的敏感性、特異性和重復(fù)性都比較好。值得注意的是，由于本試驗(yàn)使用的臨床樣品主要是犢牛的A19疫苗免疫血清樣品，而免疫動物的布病抗體滴度往往較低，部分血清樣品的抗體滴度可能會接近膠體金和cELISA的最低檢測限，這就會一定程度上影響膠體金和cELISA之間的符合率。在日常臨床檢測中，進(jìn)行自然感染或者混合感染布病的牛血清檢測時(shí)，理論上膠體金試紙條與cELISA的符合率會更高?？梢姡z體金免疫層析法是一種比較可靠的牛布病血清學(xué)檢測方法。因此，建議相關(guān)部門盡快將膠體金免疫層析法納入動物布病診斷的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中，以提高動物布病的檢測能力，促進(jìn)家畜布病的防控與凈化。