沈陽某豬場(chǎng)大腸桿菌分離、鑒定及藥物敏感新研究

劉耀川，龔商羽，關(guān) 淼，楊揚(yáng)，申貫?zāi)?/p>

（1.遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110164；2.錦州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 錦州 121000）

大腸桿菌是存在于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的一種固有細(xì)菌，大多分布于大腸內(nèi)。絕大多數(shù)情況下，機(jī)體內(nèi)的大腸桿菌不表現(xiàn)出致病力，但當(dāng)機(jī)體處于外傷、感染等免疫力低下時(shí)，大腸桿菌則轉(zhuǎn)變?yōu)闂l件性致病菌。近年來隨著研究的不斷深入，又發(fā)現(xiàn)多種致病性大腸桿菌。因該菌分布廣泛且極易傳播，是公共安全的潛在威脅因素。豬感染致病性大腸桿菌后會(huì)引起仔豬腹瀉、敗血癥、腦膜炎等多種感染性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前獸醫(yī)對(duì)大腸桿菌感染通常使用抗生素治療，但隨著抗生素的不斷使用，大腸桿菌逐漸產(chǎn)生耐藥性，給臨床疾病治療造成困難。

本研究對(duì)遼寧沈陽某生豬養(yǎng)殖場(chǎng)開展大腸桿菌分離、鑒定，并對(duì)確定的大腸桿菌分離株進(jìn)行了抗生素敏感性試驗(yàn)。為該場(chǎng)由大腸桿菌引起的相關(guān)疾病治療方案提供技術(shù)支持，同時(shí)也為該場(chǎng)大腸桿菌防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 樣品來源在沈陽市某生豬養(yǎng)殖場(chǎng)，選取腹瀉病豬100頭（其中仔豬50頭、育肥豬50頭）。采樣豬均與其他健康豬相同條件飼養(yǎng)、免疫，且均未進(jìn)行藥物治療。

1.2 主要儀器立式蒸汽高壓滅菌器（泰田BT-27LD）、恒溫振蕩生化培養(yǎng)箱（華育HS-D60）、恒溫隔水式培養(yǎng)箱（天松-60KD）、無菌工作臺(tái)（SJ-3084S）、50μL、100μL、200μL微 量 移 液 器（ThermoFisher F3）、游標(biāo)卡尺等由遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.3 主要材料普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）、普通固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、麥康凱瓊脂粉購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管購于杭州濱和微生物試劑有限公司；抗菌藥物藥敏紙片（10種）購于杭州微生物試劑有限公司、大腸桿菌質(zhì)控菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC25922）購于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

2 方法

2.1 樣品采集對(duì)采樣豬進(jìn)行恰當(dāng)保定后，對(duì)肛門部位按照碘酊-酒精-碘酊的順序進(jìn)行消毒。用無菌棉拭子插入肛門對(duì)腸內(nèi)容物進(jìn)行蘸取采樣。采樣結(jié)束后將棉拭子頭保存于的5mL離心管中。將標(biāo)記好的離心管置于4℃樣品冷藏保存盒中盡快送至實(shí)驗(yàn)室。

2.2 培養(yǎng)基制備按產(chǎn)品說明說要求，用滅菌dd H2O配置相應(yīng)濃度的培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基于高壓蒸汽滅菌器中121℃滅菌20min。用5mL離心管分裝NB肉湯培養(yǎng)基，用90mm培養(yǎng)皿制作普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基。將制作好的培養(yǎng)基放置于隔水電熱恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)12h，觀察培養(yǎng)基，無菌落生長(zhǎng)、無渾濁的為檢菌合格。將檢菌合格的培養(yǎng)基置于4℃冰箱中保存待用。

2.3 大腸桿菌初步分離在潔凈工作臺(tái)中，用蕩混勻儀對(duì)盛放肛門棉拭子頭的離心管進(jìn)行充分震動(dòng)、混勻，取其中的生理鹽水混勻液100μL接種于檢菌合格的NB肉湯中。將NB肉湯放置于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，180min轉(zhuǎn)培養(yǎng)12h。

取100μL擴(kuò)增后的NB肉湯，在潔凈工作臺(tái)中用三角玻璃棒將其均勻涂布于檢菌合格的普通瓊脂培養(yǎng)基中，正置片刻待菌液完全吸收后倒置于37℃隔水恒溫電熱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h。選取大小、形態(tài)、生長(zhǎng)特性不同的單獨(dú)菌落，于NB肉湯中擴(kuò)增。

取100μL單獨(dú)菌落培養(yǎng)NB肉湯，用同樣的方式涂布于檢菌合格的麥康凱瓊脂平皿中，過夜培養(yǎng)并記錄培養(yǎng)結(jié)果。

2.4 大腸桿菌生化反應(yīng)鑒定觀察培養(yǎng)后的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，選取其中具有金屬紅色光澤、圓形、獨(dú)立生長(zhǎng)的單獨(dú)菌落。在潔凈工作臺(tái)中，按照生化反應(yīng)鑒定試劑盒套裝說明書要求，對(duì)其進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定。細(xì)菌接種于微量鑒定管后，用注射器加入液體石蠟封閉，并用封口膜封口，放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。

2.5 藥物敏感性測(cè)試將鑒定后的大腸桿菌分離株NB肉湯培養(yǎng)液100μL均勻涂布于檢菌合格的固體瓊脂平皿中，待菌液完全吸收后用鑷子將藥敏紙片均勻放置于平皿內(nèi)。藥敏紙片間應(yīng)預(yù)留出足夠距離，以便測(cè)量抑菌環(huán)直徑。將平皿放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)，用游標(biāo)卡尺對(duì)抑菌環(huán)直徑進(jìn)行測(cè)量。取3次測(cè)量結(jié)果的平均值為該藥物對(duì)病原菌分離株的抑菌直徑，并與參考值進(jìn)行比較，評(píng)估病原分離株對(duì)藥物的敏感性。

3 結(jié)果

3.1 大腸桿菌初步分離結(jié)果100份棉拭子樣本，經(jīng)并病原菌NB肉湯擴(kuò)增、普通瓊脂培養(yǎng)基單獨(dú)分離、麥康凱鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)，共得到大腸桿菌疑似分離株82株。其中在50份仔豬肛門棉拭子樣本中得到疑似分離株48株、在50份育肥豬肛門棉拭子樣本中得到疑似分離株34株。

3.2 大腸桿菌生化反應(yīng)鑒定結(jié)果82株疑似大腸桿菌分離株經(jīng)腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管反應(yīng)，并根據(jù)培養(yǎng)后的顏色反應(yīng)對(duì)其進(jìn)行賦碼、比對(duì)，最終確定大腸桿菌分離株61株，大腸桿菌的總體分離率為61%（61/100）。其中仔豬病例樣本中得到大腸桿菌39株，育肥豬病例樣本中得到大腸桿菌22株，其分離率分別為78%（39/50）及44%（22/50）。

3.3 大腸桿菌分離株藥物敏感性結(jié)果對(duì)61株臨床分離的大腸桿菌分離株及1株質(zhì)控菌標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行藥敏紙片法測(cè)定其藥物敏感性，當(dāng)質(zhì)控菌抑菌環(huán)直徑在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)時(shí)，認(rèn)定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可信，記錄并統(tǒng)計(jì)分離株耐藥性情況。結(jié)果表明，61株臨床分離株對(duì)10種受試抗生素耐藥性由高至低分別為磺胺甲基異惡唑、阿奇霉素、紅霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、強(qiáng)力霉素、青霉素、頭孢曲松、氨芐青霉素及頭孢拉定，耐藥率（見表1）。

對(duì)不同樣本來源得到的大腸桿菌進(jìn)行分析，其耐藥情況也不盡相同。在39株仔豬源大腸桿菌中，耐藥性由高到低分別為磺胺甲基異惡唑、阿奇霉素、頭孢曲松、紅霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、強(qiáng)力霉素、青霉素、氨芐青霉素及頭孢拉定，耐藥率（見表1）在22株育肥豬源大腸桿菌中，耐藥性由高到低分別為磺胺甲基異惡唑、紅霉素、四環(huán)素、阿奇霉素、青霉素、復(fù)方新諾明、強(qiáng)力霉素、氨芐青霉素、頭孢拉定及頭孢曲松，耐藥率分離株對(duì)10種受試藥物敏感性測(cè)試結(jié)果（見表1）及（圖1）。

圖1 大腸桿菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

表1 大腸桿菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

近年來發(fā)現(xiàn)多種致病性大腸桿菌如腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸聚集性大腸桿菌（EAggEC）及腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）等，不僅對(duì)養(yǎng)殖業(yè)危害巨大，也威脅人類健康。該病病原廣泛、發(fā)病率高、癥狀復(fù)雜且極易造成病豬死亡，給生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前抗生素仍是最主要的治療手段，但長(zhǎng)期使用產(chǎn)生的耐藥性，給疾病治療造成很大困難。如王旭等報(bào)道，在四川地區(qū)仔豬黃痢病例中分離到的大腸桿菌，其對(duì)頭孢呋辛、頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢唑林、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、復(fù)方新諾明、呋喃唑酮、卡那霉素、慶大霉素、哌拉西林、羧芐西林、丁胺卡那霉素、氯霉素、米諾環(huán)素等19種藥物敏感；對(duì)多西環(huán)素、克林霉素、多粘菌素、新霉素中度敏感；對(duì)青霉素、氨芐西林、苯唑西林、紅霉素、麥迪霉素、四環(huán)素、萬古霉素耐藥。李沛麗等報(bào)道，貴州地區(qū)11個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)中，大腸桿菌對(duì)慶大霉素、大觀霉素、四環(huán)素敏感；對(duì)氨芐西林、氟苯尼考、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、氧氟沙星、多西環(huán)素、金霉素中度敏感；對(duì)奧格門丁、頭孢他啶、頭孢噻呋、亞胺培南、粘菌素耐藥。黃顯曄等對(duì)黑龍江某豬場(chǎng)仔豬腹瀉病例研究發(fā)現(xiàn)，分離到的大腸桿菌對(duì)頭孢噻呋、頭孢曲松敏感；對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星及四環(huán)素耐藥。于新友等對(duì)山東濱州地區(qū)仔豬腹瀉病例研究發(fā)現(xiàn)，分離到的大腸桿菌對(duì)頭孢噻呋、恩諾沙星、復(fù)方新諾明和阿莫西林高度敏感；對(duì)青霉素G、氟苯尼考、四環(huán)素、紅霉素、慶大霉素、阿米卡星表現(xiàn)出不同程度的耐藥。丁建華等對(duì)安徽、江蘇、山東、河北、廣西等地分離到的大腸桿菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，94.4%的分離株耐受至少3種以上抗菌藥物，對(duì)青霉素、多西環(huán)素、復(fù)方新諾明、甲氧芐氨嘧啶、阿莫西林、氨芐西林、四環(huán)素、頭孢氨芐、卡那霉素、氟苯尼考、鏈霉素、頭孢曲松的耐藥率均在70%以上；對(duì)多粘菌素B和多粘菌素E較為敏感。孫起榮的報(bào)答，安徽地區(qū)豬源大腸桿菌對(duì)青霉素、甲氧芐氨嘧啶、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、氨芐西林、阿莫西林高度耐藥。谷振等報(bào)道，豫西地區(qū)豬源大腸桿菌對(duì)硫酸粘菌素、阿米卡星、恩諾沙星高度敏感；對(duì)頭孢噻呋中度敏感。孫偉等報(bào)道，銅仁地區(qū)豬源大腸桿菌對(duì)四環(huán)素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、磺胺嘧啶、慶大霉素耐藥性較高。劉雪松等報(bào)道，齊齊哈爾周邊仔豬腹瀉大腸桿菌對(duì)頭孢曲松、環(huán)丙沙星及阿奇霉素敏感性較強(qiáng)。

與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)比較，本次在沈陽地區(qū)豬腹瀉病例中分離到的大腸桿菌對(duì)磺胺類藥物耐藥性最高，對(duì)頭孢菌素類藥物相對(duì)較為敏感?？赡芘c地區(qū)差異、用藥習(xí)慣、藥物選擇差異等因素有關(guān)，建議該飼養(yǎng)場(chǎng)根據(jù)病原鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果制定針對(duì)性治療方案。