莫高組合對環(huán)磷酰胺致小鼠免疫功能低下的影響

蔣海生，張曉云

（1.河北征宇制藥有限公司，河北 石家莊 051430；2.河北省獸用免疫增強劑產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北 石家莊 051430；3.河北省動物專用免疫增強劑技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 051430）

中醫(yī)有云：“正氣內(nèi)存，邪不可干?！彼^正氣就是機體的免疫力，當(dāng)免疫力低下時，免疫系統(tǒng)無法及時消除衰老和受損細(xì)胞以及致病微生物，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。提高免疫力低下者的免疫功能對維持機體的健康和對抗疾病非常重要。

莫力健主要成分包括多種維生素以及可飼用天然植物提取物等，專門用于提高動物機體黏膜免疫力，修復(fù)受損黏膜，維護黏膜完整性，促進黏膜蛋白合分泌，降低機體發(fā)病率。

高免多糖是一種復(fù)合植物多糖免疫增強劑，臨床上主要用于增強機體的免疫功能、發(fā)揮免疫佐劑作用、輔助治療病毒病、降低應(yīng)激反應(yīng)。張洪德等研究發(fā)現(xiàn)，高免多糖有提高雛雞法氏囊指數(shù)的作用，并且能在提高抗體水平的基礎(chǔ)上提高整齊度。褚秀玲等研究發(fā)現(xiàn)，高免多糖可以明顯改善番鴨的生長性能，促進免疫器官的發(fā)育；可以提高特異性免疫抗體水平，促進白細(xì)胞介素-2（IL-2）和γ干擾素（IFN-γ）等細(xì)胞因子的分泌。劉學(xué)彬等研究表明，高免多糖能提高母豬的免疫水平，提高豬瘟抗體效價、血清IFN-γ和IL-2水平；增加母豬所產(chǎn)仔豬的平均斷奶頭數(shù)、提高斷奶成活率和斷奶均重，還能減少仔豬腹瀉的發(fā)生。說明在母豬飲水及日糧中添加高免多糖能提高母豬的生產(chǎn)性能和免疫機能，間接改善哺乳仔豬的生長性能和健康狀況。

基于上述理論基礎(chǔ)，本研究通過小鼠免疫功能低下模型，探討莫高組合對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用及作用機制，旨在為莫高組合的臨床應(yīng)用提供合理的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗動物SPF級C57BL/6小鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22g，6～8周齡，購自河北伊維沃生物科技有限公司（實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2020-002）。

1.2 藥物與試劑莫力健、高免多糖均由河北征宇制藥有限公司提供；環(huán)磷酰胺（756240-1G，購自北京華邁生物科技有限責(zé)任公司）；小鼠溶菌酶（LZM）試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）。

1.3 主要儀器AUW120D電子分析天平，上海島津儀器有限公司；DH36001B電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特儀器有限公司；Centrifuge 5810 R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；101-2EBS電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；SP-756P紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；Infinite F50酶標(biāo)儀，奧地利Tecan有限公司；微量移液器，北京大龍。

2 方法

2.1 試驗分組、造模和給藥將80只小鼠隨機分為8組，每組10只，分別為正常對照組、模型組、莫高0.5g/kg、1g/kg、1.5g/kg、2g/kg、2.5g/kg、3g/kg六 個不同劑量組。適應(yīng)性飼養(yǎng)10d后，除正常對照組外其余各組腹腔注射環(huán)磷酰胺（80mg/kg）制造免疫力低下模型，1次/d，連續(xù)3d，第6天同劑量加強一次；正常對照組動物注射等體積生理鹽水。造模成功后各組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，正常對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)給藥10d。

2.2 一般狀態(tài)觀察每日觀察小鼠精神狀態(tài)，活動、采食、飲水情況，毛發(fā)光滑度等。

2.3 體質(zhì)量變化率的測定

2.4 溶菌酶活性測定末次給藥后正常飲水，禁食12h后將所有組小鼠稱重，眼眶靜脈采血。采集的血液置于37℃恒溫箱中保溫30min，然后置于4℃冰箱中過夜，5000rpm離心10min，用微量移液器分離血清，-20℃保存，備用。采用溶菌酶試劑盒測定溶菌酶含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2.5 免疫器官指數(shù)測定采完血之后，小鼠斷頸處死，取其脾臟、胸腺，用濾紙吸去多余的血液，在電子天平上稱其重量，記錄數(shù)據(jù)，計算免疫器官指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析采用SPSS 26.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Duncan法對試驗結(jié)果進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 莫高組合對免疫功能低下小鼠一般狀態(tài)的影響連用環(huán)磷酰胺3d后，除正常對照組（見圖1）外，其余各組小鼠均表現(xiàn)出毛色無光，精神不振，雙目無神，閉眼昏睡（見圖2），喜歡蜷縮在一旁，活動減少，對外界環(huán)境的動靜反應(yīng)比較遲鈍，小鼠采食量、飲水逐漸減少，體質(zhì)量明顯下降，表明免疫力低下模型造模成功。經(jīng)莫高組給藥治療后，各給藥組小鼠（見圖3）精神狀態(tài)逐漸改善、活動量增加，采食量、飲水、體質(zhì)量均有不同程度的提高。

圖1 正常對照組

圖2 免疫低下模型組

圖3 給藥治療組

3.2 莫高組合對免疫功能低下小鼠采食量、體質(zhì)量變化率的影響結(jié)果如表1所示，與正常對照組相比，模型組小鼠采食量減少（P＞0.05），體質(zhì)量變化率顯著下降（P＜0.05）。與模型組相比，各個劑量莫高給藥組采食量、體質(zhì)量變化率均有所增加（P＞0.05），并且在0.5g/kg劑量時均顯著升高（P＜0.05）。

表1 莫高組合對免疫低下小鼠采食量、體質(zhì)量的影響（n=10）

3.3 莫高組合對免疫功能低下小鼠溶菌酶活性的影響結(jié)果（見表2），與正常對照組比較，模型組小鼠血清溶菌酶活性顯著下降（P＜0.05）。與模型組比較，各個劑量莫高組小鼠血清溶菌酶活性均顯著提高（P＜0.05），其中0.5g/kg莫高組作用效果最好。

表2 莫高組合對免疫低下小鼠溶菌酶活性的影響（n=10）

3.4 莫高組合對免疫功能低下小鼠免疫器官指數(shù)的影響結(jié)果（見表3），與正常對照組比較，模型組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，各劑量莫高組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均有不同程度的提高，其中0.5g/kg莫高組作用效果最好（P＜0.05）。

表3 莫高組合對免疫低下小鼠免疫器官指數(shù)的影響（n=10）

4 討論

4.1 莫高組合對免疫功能低下小鼠一般狀態(tài)、采食量、體質(zhì)量變化率的影響環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）在藥理學(xué)等研究領(lǐng)域中常用于制造免疫功能低下或免疫功能抑制狀態(tài)的動物模型，在臨床應(yīng)用中已經(jīng)非常成熟。康慧琳等研究結(jié)果表明，高劑量（80mg/kg）CTX通過抑制DNA的復(fù)制、促進細(xì)胞凋亡，降低T、B細(xì)胞增殖指數(shù)及巨噬細(xì)胞吞噬功能，從而降低免疫細(xì)胞功能，使機體處于免疫抑制狀態(tài)。因此，本實驗采用環(huán)磷酰胺（80mg/kg）腹腔注射造模，制備小鼠免疫功能力低下模型。

本實驗研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠均表現(xiàn)出毛色無光，精神不振，雙目無神，閉眼昏睡，喜歡蜷縮在一旁，活動減少，對外界環(huán)境的動靜反應(yīng)比較遲鈍，采食量、飲水逐漸減少，體質(zhì)量明顯下降，這與高敏、魏琳等人用環(huán)磷酰胺制備小鼠免疫力低下模型相一致。經(jīng)莫高組給藥治療后，各給藥組小鼠精神狀態(tài)逐漸改善、活動量增加，以及采食量、飲水、體質(zhì)量均有不同程的提高。由此說明莫高組合對由環(huán)磷酰胺導(dǎo)致免疫功能低下的小鼠具有很好的免疫保護作用，其具體作用機制還有待進一步研究。

4.2 莫高組合對免疫功能低下小鼠血清溶菌酶活性的影響巨噬細(xì)胞是動物機體自然抵抗力和非特異性免疫的一個重要組成部分，在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和體液免疫中都發(fā)揮著重要作用，血清溶菌酶水平是評估機體非特異性免疫功能強弱的一個重要指標(biāo)。溶菌酶是單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的產(chǎn)物，主要由單核細(xì)胞-吞噬細(xì)胞釋放到血清中。作為一種存在于動物正常體液和組織中的非特異性免疫物質(zhì)，溶菌酶具有多種藥理作用，如抗菌、抗病毒、抗腫瘤、激活補體和促進吞噬作用。

本試驗研究表明，與模型組相比，0.5～3g/kg劑量莫高組均可顯著提高免疫功能低下小鼠血清溶菌酶含量，增強非特異性免疫功能，其中0.5g/kg劑量莫高組作用效果最明顯。同時，小鼠血清溶菌酶活性的提高表明莫高組合可能激活血液中吞噬細(xì)胞的活性。激活的吞噬細(xì)胞可以分泌一些酶類（溶酶體水解酶、溶細(xì)胞酶）、TNF、NO等活性分子，這些活性物質(zhì)對腫瘤細(xì)胞和致病細(xì)胞有強大的殺傷力，提高機體的體液免疫和細(xì)胞免疫功能，促進機體的免疫保護機制，進而從機體免疫系統(tǒng)的多個層次調(diào)節(jié)免疫功能。關(guān)于莫高組合提高小鼠血清溶菌酶活性，增強非特異性免疫功能的機制還有待于進一步研究。

4.3 莫高組合對免疫功能低下小鼠免疫器官指數(shù)的影響免疫器官的重量和功能與其中所含免疫細(xì)胞的數(shù)量密切相關(guān)，從器官指數(shù)可以看出淋巴細(xì)胞的增殖，也可以粗略估計免疫功能的強弱。與模型組相比，各個劑量水平莫高組合（0.5g/kg、1g/kg、1.5 g/kg、2g/kg、2.5g/kg、3g/kg）均可提高小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)，其中0.5g/kg莫高組的作用明顯優(yōu)于其他組，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。這表明莫高組合能夠有效對抗由環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的免疫器官損傷或萎縮，改善由環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的免疫功能低下小鼠的免疫機能。

5 結(jié)論

莫高組合（0.5～3g/kg）可以提高小鼠體質(zhì)量變化率、血清溶菌酶的活性、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，改善由環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的免疫功能低下小鼠的免疫機能，增強機體的免疫防御能力，其中0.5g/kg莫高組的作用效果最好。