‘古田紅’杜鵑花離體快繁體系建立與優(yōu)化

杜鵑花（Rhododendron simsii Planch.） 為杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（Rhododendron）的木本觀賞植物，是世界三大高山花卉和我國十大名花之一。杜鵑花傳統(tǒng)育苗方式多采用扦插、嫁接法來進(jìn)行繁殖，但這些技術(shù)因為長期無性繁殖會導(dǎo)致病毒累積，導(dǎo)致品種退化，失去其商品價值。而且這些育苗方式還會受到母株材料、季節(jié)性等很多條件的限制，無法實現(xiàn)周年生產(chǎn)，甚至有些品種生根困難，難以擴(kuò)大規(guī)模、進(jìn)行商品化操作。因此，杜鵑花離體培養(yǎng)方式也成為杜鵑花一種重要的繁殖方式。如今，對杜鵑花離體培養(yǎng)主要是從外植體選擇、表面消毒時間、培養(yǎng)基種類、植物生長調(diào)節(jié)劑、培養(yǎng)條件等方面開展，而且也取得了一定成果[1-3]。但不同基因型的杜鵑花在離體培養(yǎng)時，所用的激素種類和濃度并不一致，因此，該研究以自行選育的‘古田紅’杜鵑花新品種為材料，開展離體快繁體系研究，為加速杜鵑花新品種推廣及實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以‘古田紅’杜鵑花帶有頂芽和腋芽的幼嫩枝條為材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌體系建立。將杜鵑花枝條剪成3 cm 左右莖段，先用洗衣粉水浸泡10 min，然后流水沖洗30 min。用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒30 s，以0.1% HgCl2為消毒劑，設(shè)置不同消毒時間（6、8、10、12、14 min），篩選出最佳消毒時間，重復(fù)3 次。

1.2.2 不定芽誘導(dǎo)。以WPM 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過添加不同濃度 ZT（1.0、2.0、3.0 mg/L）、TDZ（0.5、1.0、1.5 mg/L）與NAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）組合進(jìn)行杜鵑花不定芽誘導(dǎo)，pH調(diào)整為5.2 左右，3 周后統(tǒng)計不定芽誘導(dǎo)率，重復(fù)3 次。

1.2.3 增殖培養(yǎng)。將誘導(dǎo)出來的不定芽接種到WPM 培養(yǎng)基中，附加 ZT 1.0 mg/L 和不同濃度的 NAA（0、0.1、0.3、0.5 mg/L），培養(yǎng)3 周后觀察小苗的生長情況，并統(tǒng)計增殖系數(shù)，重復(fù)3 次。

1.2.4 生根培養(yǎng)。將經(jīng)過壯苗培養(yǎng)后的組培苗切割成單苗，接種到添加不同濃度 NAA（0.1、0.5、1.0 mg/L）的培養(yǎng)基中，4 周后觀察生根情況，并統(tǒng)計生根培養(yǎng)基上組培苗的生根率、平均生根數(shù)，篩選出最佳生根培養(yǎng)基。

1.2.5 馴化移栽。當(dāng)杜鵑花無菌苗根長達(dá)到1.0 cm 左右時進(jìn)行馴化。先將無菌苗放到溫室內(nèi)，然后旋開瓶蓋，7 d后去除瓶蓋。將無菌苗取出后清洗掉根部瓊脂，將杜鵑花移栽到用800 倍多菌靈消毒的草炭土∶珍珠巖（2∶1）基質(zhì)中，移栽后做好保溫保濕，重復(fù)3 次。一個月后統(tǒng)計苗的存活率。

組培苗存活率= 存活組培苗數(shù)目/ 移栽組培苗數(shù)目×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每種處理重復(fù)3 次，除了不同激素組合對杜鵑花試管苗生根的影響采用DPS 軟件分析，其他記錄數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時間對外植體的影響

使用0.1%HgCl2對杜鵑花莖段進(jìn)行消毒處理，結(jié)果表明，隨著消毒時間的延長，杜鵑花外植體的污染率和存活率均呈下降趨勢（表1）。在消毒12 min 時，污染率最低，為（8.34±1.21）%，而且存活率比較高，達(dá)到了（84.12±1.89）%。因此，最佳消毒時間為12 min。

表1 不同消毒時間對‘古田紅’杜鵑花污染率及成活率影響

2.2 不同激素組合對不定芽誘導(dǎo)的影響

由表2 可以看出，不同激素配比對杜鵑花不定芽誘導(dǎo)影響比較大。其中以3.0 mg/L ZT +0.5 mg/L NAA 效果最好，不定芽誘導(dǎo)率可以達(dá)到98.3%，但由于激素濃度過高，在后期培養(yǎng)過程中葉片會出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，而1.0 mg/L ZT +0.5 mg/L NAA 雖然誘導(dǎo)率低一些，但不定芽長勢比較好。而TDZ 總體對不定芽誘導(dǎo)效果不如ZT。因此，不定芽誘導(dǎo)可以采用3.0 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA 激素組合，但在后期培養(yǎng)時將激素濃度降低。

表2 不同激素組合對‘古田紅’杜鵑花不定芽誘導(dǎo)的影響

2.3 激素組合對增殖培養(yǎng)的影響

將誘導(dǎo)出來的不定芽接種到增殖培養(yǎng)基中，結(jié)果表明，低濃度的NAA 有利于杜鵑花增殖（表3）。1.0 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA 激素配比最有利于杜鵑花增殖，增殖系數(shù)為4.35，且植株比較健壯。隨著NAA 濃度增加，增殖系數(shù)有所降低，而且長勢比較弱，并出現(xiàn)愈傷組織。

表3 不同激素組合對‘古田紅’杜鵑花增殖的影響

2.4 生根培養(yǎng)及馴化移栽

將經(jīng)過壯苗培養(yǎng)后的組培苗切割成單苗，進(jìn)行生根培養(yǎng)。隨著NAA 濃度增加，根系誘導(dǎo)率也增加，在1.0 mg/L NAA 時生根率最高，為76.51%，數(shù)量為5.08 條，比較健壯。說明1.0mg/L NAA 有利于杜鵑花生根。

當(dāng)杜鵑花無菌苗根長達(dá)到1.0 cm 左右時進(jìn)行馴化移栽。將杜鵑花移栽到用800 倍多菌靈消毒的草炭土∶珍珠巖（2∶1）基質(zhì)中，移栽后做好保溫保濕，其存活率可以高達(dá)98.46%。

表4 不同激素組合對‘古田紅’杜鵑花生根的影響

3 討論與結(jié)論

基因型是影響植物離體培養(yǎng)的內(nèi)在因素之一。雖然杜鵑花離體快繁體系已經(jīng)有了很多研究，但是不同基因型的杜鵑花所使用的培養(yǎng)基配方不一致[4-5]。而且，生長素與細(xì)胞分裂素的不同配比影響著器官分化方向，在植物培養(yǎng)階段所需激素種類及配比也不一致。有研究表明，使用一定濃度NAA 有利于不定芽誘導(dǎo)增殖和分化[6]，因此該研究中使用NAA 作為首選生長素進(jìn)行研究，與一定濃度ZT 或者TDZ 組合，能夠誘導(dǎo)出不定芽并且增殖，尤其是與ZT 組合效果更好，這與前人研究結(jié)果相一致[5]。因此，該研究最終建立了‘古田紅’杜鵑花離體快繁體系：使用0.1% HgCl2消毒 12 min 消毒效果最好，WPM+3.0 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6.5 g/L 瓊脂粉有利于不定芽誘導(dǎo)，WPM+1.0 mg/L ZT+ 0.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6.5 g/L 瓊脂粉有利于杜鵑花增殖，WPM+1.0 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6.5 g/L 瓊脂粉有利于生根，草炭土∶珍珠巖（2∶1）基質(zhì)可以作為馴化移栽基質(zhì)。