circ-PKD2靶向miR-372-3p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

何 峰，羅少鋒，王 威，趙 磊，王譯文，張 興

結(jié)直腸癌是全球最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[1]。結(jié)直腸癌患者早期癥狀和體征不明顯，確診時(shí)多已處于中晚期，導(dǎo)致其預(yù)后較差[2]。結(jié)直腸癌的致病因素復(fù)雜，探討結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)臨床預(yù)防和治療具有重要意義。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一種主要存在于細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)源性閉環(huán)RNA，不具有編碼蛋白的功能[3]。circRNA可通過(guò)多種方式影響癌基因或抑癌基因的表達(dá)，參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。近年，circRNA是結(jié)直腸癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道circ-PKD2在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中低表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的惡行生物學(xué)行為密切相關(guān)[5]。目前，circ-PKD2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)、功能及作用機(jī)制鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circ-PKD2在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平，著重探討circ-PKD2通過(guò)靶向調(diào)控miR-372-3p表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，為circRNA臨床靶向治療結(jié)直腸癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年9月～2020年11月華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛(ài)醫(yī)院/武漢市第四醫(yī)院手術(shù)切除的結(jié)直腸癌及癌旁組織44例?；颊咝g(shù)前均未行化療、放療或免疫治療。44例患者中男性33例，女性11例，年齡(56.13±8.57)歲。TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期26例，Ⅲ+Ⅳ期18例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者23例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者21例。

1.2 細(xì)胞系與主要試劑正常腸黏膜上皮細(xì)胞(HIEC)和結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116、HT-29、SW480、LoVo)，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。陰性對(duì)照NC質(zhì)粒(pCMV-6空白質(zhì)粒)、circ-PKD2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-circ-PKD2質(zhì)粒)、miR-NC、miR-372-3p、circ-PKD2野生型重組質(zhì)粒(circ-PKD2-WT)及circ-PKD2突變型重組質(zhì)粒(circ-PKD2-MT)，均購(gòu)自上海碧云天公司。MTS試劑盒和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Promega公司。胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；qRT-PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；Transwell小室和Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)Corning公司；超敏ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。一抗LATS2、CDX2、FOXM1、CTGF、CYR61和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染在37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，正常結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞系均采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT-29細(xì)胞分為2個(gè)轉(zhuǎn)染組，按照Lipofectamine 3000試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照NC質(zhì)粒(NC組)和circ-PKD2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(circ-PKD2組)，轉(zhuǎn)染48 h后收集各組HT-29細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)circ-PKD2和miR-372-3p的表達(dá)水平采用Trizol法提取組織和細(xì)胞系的總RNA，檢測(cè)RNA純度和濃度后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)circ-PKD2和miR-372-3p的表達(dá)水平，circ-PKD2的相對(duì)表達(dá)量以GAPDH為內(nèi)參，miR-372-3p的相對(duì)表達(dá)量以U6為內(nèi)參，以2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)如下，GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；circ-PKD2上游引物：5′-CATTATTTTCCTAGCGTATGCT CAGT-3′，下游引物：5′-CTGTGACATCATCCGGGTG TAG-3′；U6上游引物：5′-GCTTCGGCACATATACTA AAAT -3′，下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGT GTCAT -3′；miR-372-3p上游引物：5′-CGGCGGAG GCAAGATGCTGGCA-3′，下游引物：5′-CAACTGGT GTCGTGGAGTCGG-3′。

1.5 MTS法檢測(cè)circ-PKD2對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的影響取各組HT-29細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種于96孔板中，每孔200 μL細(xì)胞懸液，在培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5天。每天相同時(shí)間點(diǎn)，每孔加25 μL MTS試劑(濃度為5 mg/mL)，在培養(yǎng)箱中處理3 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A490)值，繪制HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.6 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HT-29細(xì)胞的遷移能力取各組HT-29細(xì)胞以6×105個(gè)/孔接種于6孔板，待HT-29細(xì)胞匯合度為95%，利用10 μL槍頭在6孔板底部垂直劃痕，采用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基洗3次，每孔加入2 mL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。于倒置顯微鏡下觀察并測(cè)量劃痕寬度，記為W1。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，于倒置顯微鏡下觀察并測(cè)量劃痕寬度，記為W2。HT-29細(xì)胞劃痕愈合率=(W1-W2)/ W1×100%。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HT-29細(xì)胞的侵襲能力在冰上預(yù)鋪Matrigel基質(zhì)膠至Transwell小室上室，培養(yǎng)箱內(nèi)充分凝固。取各組HT-29細(xì)胞采用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸后，以3×104個(gè)/孔接種于Transwell小室上室，每孔200 μL細(xì)胞懸液。每孔加入600 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基至Transwell小室下室。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，采用多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染液染色，流水輕輕沖洗，棉簽擦去未穿膜的細(xì)胞，在倒置顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.8 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證circ-PKD2的靶基因根據(jù)circRNA生物信息學(xué)網(wǎng)站starBase v2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/starbase2/index.php)預(yù)測(cè)circ-PKD2的靶基因?yàn)閙iR-372-3p，分析circ-PKD2與miR-372-3p之間的作用序列。將HT-29細(xì)胞接種于24孔板中，circ-PKD2野生型重組質(zhì)粒(circ-PKD2-WT)及circ-PKD2突變型重組質(zhì)粒(circ-PKD2-MT)聯(lián)合miR-NC、miR-372-3p共轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，HT-29細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.9 Western blot法檢測(cè)HT-29細(xì)胞中靶基因表達(dá)水平收集各組HT-29細(xì)胞，使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白。各組取等量蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，分別加入一抗CDX2(稀釋比1 ∶1 000)、FOXM1(稀釋比1 ∶2 000)、CTGF(稀釋比1 ∶2 000)、CYR61(稀釋比1 ∶2 000)和GAPDH(稀釋比1 ∶1 000)孵育過(guò)夜，洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(稀釋比1 ∶10 000)孵育2 h，洗膜后采用超敏ECL發(fā)光試劑盒曝光、顯影。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織中circ-PKD2的表達(dá)水平結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中circ-PKD2的表達(dá)量分別為1.28±0.14和6.38±0.29。與癌旁組織相比，結(jié)直腸癌組織中circ-PKD2的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01，圖1)。

圖1 結(jié)直腸癌和癌旁組織中circ-PKD2的表達(dá)水平：與癌旁組織比較，*P<0.01

2.2 結(jié)直腸癌組織中circ-PKD2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系本組44例以結(jié)直腸癌組織中circ-PKD2表達(dá)水平的均數(shù)1.28為界值，circ-PKD2表達(dá)水平≥1.28為高表達(dá)，<1.28為低表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，circ-PKD2表達(dá)與患者年齡、性別無(wú)關(guān)(P>0.05)；與結(jié)直腸癌TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.01，表1)。

表1 結(jié)直腸癌組織中circ-PKD2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 結(jié)直腸癌細(xì)胞系中circ-PKD2的表達(dá)水平正常腸黏膜上皮細(xì)胞(HIEC)和結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116、HT-29、SW480、LoVo)中circ-PKD2的表達(dá)量分別為1.00±0.03、0.42±0.05、0.19±0.03、0.82±0.03和0.61±0.08。與HIEC細(xì)胞比較，結(jié)直腸癌細(xì)胞系中circ-PKD2的表達(dá)水平顯著降低(P均<0.01，圖2)，HT-29細(xì)胞中的表達(dá)量最低(P<0.01，圖2)。因此，選擇HT-29細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 結(jié)直腸癌細(xì)胞和正常腸黏膜上皮細(xì)胞中circ-PKD2的表達(dá)水平：與HIEC細(xì)胞相比，*P<0.01

2.4 各組HT-29細(xì)胞中circ-PKD2的表達(dá)NC組和circ-PKD2組HT-29細(xì)胞中circ-PKD2的表達(dá)量分別為1.02±0.11和12.02±1.08，circ-PKD2組中circ-PKD2的表達(dá)是NC組的11.78倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示轉(zhuǎn)染成功。

2.5 circ-PKD2對(duì)HT-29細(xì)胞增殖能力的影響與NC組相比，circ-PKD2組HT-29細(xì)胞在第2、3、4、5天的吸光度值降低(P均<0.05)，提示circ-PKD2可抑制結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞增殖。在第1天，兩組細(xì)胞吸光度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)。

圖3 circ-PKD2對(duì)HT-29細(xì)胞增殖能力的影響：與NC組相比，#P<0.05，*P<0.01

2.6 circ-PKD2對(duì)HT-29細(xì)胞遷移能力的影響NC組和circ-PKD2組HT-29細(xì)胞劃痕愈合率分別為(69.65±5.99)%和(25.58±4.33)%。與NC組相比，circ-PKD2組HT-29細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示circ-PKD2可抑制結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞的遷移(圖4)。

圖4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HT-29細(xì)胞的遷移能力

2.7 circ-PKD2對(duì)HT-29細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NC組和circ-PKD2組HT-29細(xì)胞侵襲數(shù)分別為(89.28±11.07)個(gè)和(41.20±10.33)個(gè)。與NC組相比，circ-PKD2組HT-29細(xì)胞侵襲數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示circ-PKD2可抑制結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞的侵襲(圖5)。

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HT-29細(xì)胞的侵襲能力：A.NC組，B.circ-PKD2組

2.8 circ-PKD2與miR-372-3p的靶向關(guān)系starBase v2.0預(yù)測(cè)顯示，circ-PKD2的靶基因可能是miR-372-3p，其與circ-PKD2可能的結(jié)合位點(diǎn)及突變位點(diǎn)詳見(jiàn)圖6。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，與共轉(zhuǎn)染miR-NC和circ-PKD2-WT組相比，共轉(zhuǎn)染miR-372-3p和circ-PKD2-WT組的相對(duì)熒光素酶活性顯著下調(diào)(P<0.01)。與共轉(zhuǎn)染miR-NC和circ-PKD2-MT組相比，共轉(zhuǎn)染miR-372-3p和circ-PKD2-MT組的相對(duì)熒光素酶活性無(wú)明顯變化(P>0.05，圖7)。對(duì)結(jié)直腸癌組織中circ-PKD2及靶基因的表達(dá)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)直腸癌組織中circ-PKD2與miR-372-3p的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.01，圖8)。

圖6 circ-PKD2與miR-372-3p基因mRNA 3’UTR互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)及突變位點(diǎn)

圖7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證circ-PKD2互補(bǔ)結(jié)合miR-372-3p基因mRNA 3’UTR：與共轉(zhuǎn)染miR-NC和circ-PKD2-WT組相比，*P<0.01

圖8 結(jié)直腸癌組織中circ-PKD2與miR-372-3p表達(dá)的相關(guān)性

2.9 circ-PKD2與miR-372-3p表達(dá)的相關(guān)性NC組和circ-PKD2組HT-29細(xì)胞中miR-372-3p的表達(dá)量分別為1.00±0.05和0.22±0.07，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示circ-PKD2可有效抑制miR-372-3p的表達(dá)。NC組和circ-PKD2組HT-29細(xì)胞中大腫瘤抑制因子2(large tumor suppresser homolog 2，LATS2) mRNA的表達(dá)量分別為1.01±0.09和6.55±0.54，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示circ-PKD2可上調(diào)LATS2 mRNA的表達(dá)。

2.10 LATS2蛋白和Hippo信號(hào)通路蛋白的表達(dá)Western blot法檢測(cè)結(jié)果表明，circ-PKD2組HT-29細(xì)胞LATS2蛋白表達(dá)明顯增加，Hippo信號(hào)通路蛋白如CDX2、FOXM1、CTGF、CYR61表達(dá)明顯增加(圖9)。

圖9 Western blot法檢測(cè)LATS2蛋白和Hippo信號(hào)通路蛋白的表達(dá)

3 討論

circRNA通過(guò)特殊反向剪接形成的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易受核酸酶影響，具有較好的穩(wěn)定性[6]。circRNA在多種人類腫瘤中表達(dá)差異顯著，在不同的腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮不同作用，廣泛參與調(diào)控腫瘤的進(jìn)程[7]。circ-TBL1XR1[8]、circ-UBAP2[9]、circ-CCDC66[10]等circRNA在結(jié)直腸癌中表達(dá)明顯增加，可作為促癌circRNA調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。circ-FNDC3B[11]、circ-SMARCA5[12]、circ-0106714[13]等circRNA在結(jié)直腸癌中表達(dá)明顯降低，可作為抑癌circRNA下調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。有研究報(bào)道，circ-PKD2在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)circ-PKD2可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，下調(diào)circ-PKD2可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[5]。目前，circ-PKD2在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)及其影響尚不明確。本組結(jié)果顯示，circ-PKD2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，circ-PKD2在結(jié)直腸癌細(xì)胞系表達(dá)明顯低于正常腸黏膜上皮細(xì)胞，circ-PKD2表達(dá)與結(jié)直腸癌TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，circ-PKD2在結(jié)直腸癌細(xì)胞中可能發(fā)揮抑癌作用。

本文以結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞系為分析對(duì)象，通過(guò)MTS法、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)circ-PKD2可顯著抑制HT-29細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，circ-PKD2在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)不完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合靶基因信使RNA(mRNA)，促進(jìn)mRNA的降解或者直接抑制其翻譯，從而負(fù)向調(diào)控靶基因的表達(dá)[14]。circRNA能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，抑制miRNA對(duì)下游靶基因表達(dá)的干擾作用，上調(diào)miRNA靶基因的表達(dá)[15]。本實(shí)驗(yàn)采用生物信息學(xué)軟件starBase v2.0預(yù)測(cè)顯示，circ-PKD2和miR-372-3p能夠互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染野生型circ-PKD2表達(dá)載體和miR-372-3p后細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性明顯降低。結(jié)直腸癌組織中circ-PKD2和miR-372-3p表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，證實(shí)miR-372-3p是circ-PKD2的靶基因。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步顯示，circ-PKD2可負(fù)向調(diào)控miR-372-3p的表達(dá)。miR-372-3p在肺鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，可顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[16-17]。Peng等[14]研究表明，miR-372-3p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著增加，其表達(dá)水平與腫瘤大小和分化程度密切相關(guān)，miR-372-3p表達(dá)水平較高的患者生存期較短，下調(diào)miR-372-3p表達(dá)可顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。miR-372-3p通過(guò)下調(diào)LATS2基因的表達(dá)，阻滯Hippo信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，LATS2是miR-372-3p的靶基因。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot法檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染circ-PKD2的HT-29細(xì)胞中LATS2蛋白和Hippo信號(hào)通路蛋白如CDX2、FOXM1、CTGF、CYR61蛋白表達(dá)明顯增加，進(jìn)一步提示circ-PKD2主要通過(guò)負(fù)調(diào)控miR-372-3p表達(dá)發(fā)揮作用。

綜上所述，circ-PKD2在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中低表達(dá)，circ-PKD2通過(guò)靶向下調(diào)miR-372-3p表達(dá)，促進(jìn)LATS2蛋白表達(dá)和Hippo信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。circ-PKD2及其靶基因miR-372-3p有望為結(jié)直腸癌的臨床治療提供新的分子靶點(diǎn)。