接種菌根真菌與施磷對(duì)豆禾混播體系生物量及競(jìng)爭(zhēng)力的影響

臧家藝， 馬玉榮， 梁瑞澤， 李豫悅， 楊 鑫，2*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 寧夏 銀川 750021； 2. 寧夏草牧業(yè)工程技術(shù)研究中心， 寧夏 銀川 750021)

紫花苜蓿(Medicagosativa)與無芒雀麥(Bromusinermis)是我國(guó)北方地區(qū)常見的栽培牧草品種[1]。建植紫花苜蓿-無芒雀麥混播人工草地，可以充分利用不同植物種對(duì)營(yíng)養(yǎng)資源的不同需求和生態(tài)位的互補(bǔ)[2]，提高單位面積草產(chǎn)量和蛋白含量[3]，是解決當(dāng)下草畜不平衡問題的重要途徑之一[4]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于混播草地已開展了大量研究，如混播草地生產(chǎn)力時(shí)間穩(wěn)定性[5]，植物種間相互作用[6]，放牧[7]、刈割[1]等利用方式對(duì)豆禾混播草地的影響等[8]。土壤微生物是影響草地植物生產(chǎn)力[9-10]和間作系統(tǒng)種間關(guān)系[10-11]的重要生物因子之一。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于土壤微生物生態(tài)功能的研究多集中在野生草原植物(如羊草(Leymuschinensis)、蒙古韭(Alliummongolicum)和阿爾泰狗娃花(Heteropappusaltaicus))[9]和間作系統(tǒng)(如小麥(Triticumaestivum)/蠶豆(Viciafaba))[11]，而對(duì)紫花苜蓿/無芒雀麥混播體系的研究鮮見報(bào)道。

叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是一類能與植物形成共生關(guān)系的土壤微生物，能夠與約80%的陸地植物形成互利共生關(guān)系[12]。AMF-植物共生體系的維持取決于植物向AMF提供光合產(chǎn)物和AMF向植物提供磷素的雙向獎(jiǎng)勵(lì)機(jī)制[13]。植物向AMF供給糖類[12,14]、脂肪酸[15]等碳水化合物；AMF能夠幫助植物吸收氮(Nitrogen,N)、磷(Phosphorus,P)等養(yǎng)分[12]。已有研究表明，AMF能夠參與豆禾混播體系的建植[16-17]，調(diào)控植物種間相互作用[16]。施肥可以調(diào)控牧草的生長(zhǎng)發(fā)育及其產(chǎn)量和品質(zhì)，是促進(jìn)豆禾混播草地穩(wěn)定和高產(chǎn)的重要管理措施[1,18]。其中磷肥能促進(jìn)豆科牧草的生長(zhǎng)，在提高紫花苜蓿的固氮活性與結(jié)瘤性方面具有重要作用[19]。已有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)土壤有效氮磷含量能夠改變AMF對(duì)植物生產(chǎn)力的作用強(qiáng)度；低土壤有效磷水平下，AMF促進(jìn)植物群落生產(chǎn)力的提高；高土壤有效磷水平下，AMF對(duì)植物群落生產(chǎn)力無影響或產(chǎn)生抑制作用[20-21]。然而，不同土壤有效磷水平下AMF如何影響豆禾混播體系競(jìng)爭(zhēng)力，還有待深入探索。本試驗(yàn)采用室內(nèi)控制試驗(yàn)的研究方法，通過測(cè)定地上生物量、相對(duì)產(chǎn)量總值、競(jìng)爭(zhēng)率、植物磷含量、植物磷吸收量和菌根侵染率等指標(biāo)，探究土壤有效磷水平與AMF互作對(duì)紫花苜蓿和無芒雀麥(1∶1)混播體系地上生物量及競(jìng)爭(zhēng)力的影響，以期為豆禾混播草地建植及土壤磷肥管理技術(shù)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物品種為紫花苜蓿(品種為‘中苜1號(hào)’，購(gòu)自寧夏遠(yuǎn)聲綠陽林草生態(tài)工程有限公司)和無芒雀麥(購(gòu)自寧夏綠地草業(yè)科技有限公司)。試驗(yàn)選取的AMF菌劑為摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)，菌劑購(gòu)自長(zhǎng)江大學(xué)根系生物學(xué)研究所。AMF菌劑孢子密度為530個(gè)·(10g)-1。供試土壤為灌淤土，取自寧夏銀川市周邊棄耕地0～20 cm土壤，土壤無機(jī)氮含量為6.5 mg·kg-1，土壤速效磷含量為3.5 mg·kg-1。將供試土壤放置于高壓蒸汽滅菌鍋中，121℃高壓蒸汽滅菌2 h，自然冷卻后獲得滅菌土壤。所施用的磷肥為磷酸二氫鉀(P2O5含量為52%)。試驗(yàn)用盆是內(nèi)口徑為15 cm，底徑為13 cm，高為20 cm的加厚樹脂塑料盆。試驗(yàn)前，每盆裝入2 kg滅菌土壤。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)設(shè)置在寧夏大學(xué)農(nóng)科實(shí)訓(xùn)基地，采用室內(nèi)控制試驗(yàn)，采用三因素析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)：因素一為磷添加，磷添加量為0和20 mg·kg-12個(gè)水平，20 mg·kg-1屬于中等供磷強(qiáng)度[22]；因素二為AMF，設(shè)置不接種AMF與接種AMF 2個(gè)水平；因素三是播種方式，設(shè)置紫花苜蓿單播、無芒雀麥單播、紫花苜蓿和無芒雀麥(1∶1)混播3個(gè)水平。共12個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)5次，試驗(yàn)共計(jì)60盆。加P處理，將磷酸二氫鉀肥料與滅菌土壤充分混勻，倒入試驗(yàn)用盆。將AMF菌劑一分為二，一部分在121℃下高壓蒸汽滅菌2 h，作為不接種AMF處理；另一部分作為接種AMF處理。每盆加入10 g滅菌或不滅菌的AMF菌劑，接種AMF處理孢子密度約為530個(gè)·盆-1。

試驗(yàn)于2020年5月18日開始，將紫花苜蓿和無芒雀麥種子放置于育苗盤，育苗2周。選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的種苗，按照3種播種方式進(jìn)行移栽。每個(gè)試驗(yàn)盆共4株種苗，紫花苜蓿單播處理為4株紫花苜蓿，無芒雀麥單播處理為4株無芒雀麥，混播處理為2株紫花苜蓿和2株無芒雀麥。種苗移栽為等距分布，混播體系中紫花苜蓿與無芒雀麥為對(duì)角等距分布。采用稱重法每周定期澆水，使供試土壤含水量為田間持水量的80%。試驗(yàn)期間，每個(gè)花盆完全隨機(jī)放置，每?jī)芍茈S機(jī)移動(dòng)一次位置，減少溫室環(huán)境異質(zhì)性對(duì)植物生長(zhǎng)的影響。

1.3 指標(biāo)測(cè)定及方法

(1)地上生物量：于2020年9月20日(紫花苜蓿處于分枝期，無芒雀麥處于分蘗期)對(duì)各處理的植物地上部分分種刈割并稱其鮮重(g)，將地上分裝紙袋放置于烘箱中，在105℃殺青30 min，然后在65℃烘48 h至恒重并稱其干重(g)，研究以測(cè)定牧草樣品的干物質(zhì)量來表示生物量。

(2)相對(duì)產(chǎn)量總值 (Relative yield total, RYT)：

式中，M代表紫花苜蓿、B代表無芒雀麥。YMB為混播下有B存在時(shí)M的產(chǎn)量，YBM為混播下有M存在時(shí)B的產(chǎn)量。YM是單播下M的產(chǎn)量，YB是單播下B的產(chǎn)量。RYT計(jì)算采用植物地上生物量數(shù)據(jù)。

RYT值可表明豆禾混播體系對(duì)單播體系的相對(duì)優(yōu)勢(shì)。其中，RYT<1.0表明單播體系優(yōu)于混播體系，無間作優(yōu)勢(shì)；RYT>1.0表明混播體系優(yōu)于單播體系，有間作優(yōu)勢(shì)；RYT=1.0表明單播體系與混播體系優(yōu)勢(shì)相同[23]。

(3)競(jìng)爭(zhēng)率 (Competition ratio, CR)：

式中，PM為混播中M的比例，PB為混播中B的比例，其中PM+PB=1。CR計(jì)算采用植物地上生物量數(shù)據(jù)。

CR可用來進(jìn)一步比較兩物種競(jìng)爭(zhēng)力的大小，CRM>1說明M的競(jìng)爭(zhēng)力比B的競(jìng)爭(zhēng)力要大；CRM=1說明M和B的競(jìng)爭(zhēng)力相當(dāng)；CRM<1說明M的競(jìng)爭(zhēng)力小于B的競(jìng)爭(zhēng)力[24]。

(4)植物地上磷含量及磷吸收量：采用鉬藍(lán)法，分別測(cè)定混播處理中紫花苜蓿與無芒雀麥地上磷含量。根據(jù)各處理植物地上生物量與磷濃度的乘積，計(jì)算植物地上磷吸收量[22]。

(6)植物菌根侵染率：將每盆植物混合根系鮮樣切成1 cm根段，充分混勻后在10% KOH溶液中90℃水浴2小時(shí)，使植物根系脫色；脫色根系樣品在2% HCl中酸化5 min后，使用5%曲利苯藍(lán)溶液染色30 min，再用乳酸甘油溶液進(jìn)行脫色。每個(gè)試驗(yàn)處理，隨機(jī)選擇30個(gè)根段放置在載玻片上，使用蓋玻片壓制后，放置在光學(xué)顯微鏡下觀察AMF的菌絲、叢枝與泡囊結(jié)構(gòu)，計(jì)算各處理的菌根侵染率[26]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用三因素方差分析(Three-way ANOVA)檢驗(yàn)施磷、接種AMF和播種方式單獨(dú)及交互作用對(duì)紫花苜蓿和無芒雀麥生物量和種間關(guān)系的影響。用配對(duì)樣本T檢驗(yàn)來比較不接種AMF與接種AMF處理下，無芒雀麥與紫花苜蓿的地上生物量、相對(duì)產(chǎn)量總值和競(jìng)爭(zhēng)率的差異。所有數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件匯總，采用SigmaPlot 12.0軟件作圖，數(shù)據(jù)分析采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMF與P對(duì)紫花苜蓿和無芒雀麥單播及混播體系地上生物量的影響

AMF與播種方式的主效應(yīng)對(duì)單播和混播體系地上生物量無顯著影響(表1)。P肥添加顯著促進(jìn)單播與混播體系地上生物量增加(圖1，P：P<0.01)，播種方式與AMF存在顯著的交互作用(表1，AMF×Mix：P<0.01)。配對(duì)樣本T檢驗(yàn)的結(jié)果表明：不施磷處理下，接種AMF顯著增加紫花苜蓿單播體系地上生物量，降低無芒雀麥單播與混播體系地上生物量；而施加P肥后，AMF對(duì)單播及混播體系地上生物量無顯著影響(圖1)。不施磷和施磷處理下，混播體系與單播體系地上生物量無顯著差別(圖1)。

表1 不同播種方式(Mix)、叢枝菌根真菌(AMF)、磷添加 (P)及其交互作用對(duì)植物地上生物量影響的方差分析結(jié)果Table 1 Analysis of variance for the effects of planting patterns (Mix),arbuscular mycorrhizal fungi (AMF),P addition(P) and their interactions on plant shoot biomass

圖1 AMF與磷添加對(duì)紫花苜蓿和無芒雀麥單播及 混播體系地上生物量的影響Fig.1 Effects of AMF and P addition on aboveground biomass of M. sativa and B. inermis monoculture and mixed sowing system注：M-M代表紫花苜蓿單播，B-B代表無芒雀麥單播，M-B代表紫花苜蓿與無芒雀麥混播；+P代表施加P肥；AMF代表接種叢枝菌根真菌，Non-AMF代表不接種叢枝菌根真菌；Mix表示播種方式；* * 磷添加主效應(yīng)、播種方式與接種叢枝菌根真菌的交互效應(yīng)差異極顯著(P < 0.01)。每個(gè)混播組合處理下*表示配對(duì)樣本T檢驗(yàn)差異顯著(P < 0.05)，NS表示無顯著差異(P > 0.05)，下圖同Note:M-M,M. sativa monoculture,B-B,B. inermis monoculture,M-B,M. sativa mixed with B. inermis;+P,P fertilizer addition;AMF,arbuscular mycorrhizal fungi inoculation,Non-AMF,control;Mix,planting patterns;* * indicates the main and interactive effects of P addition,planting patterns and AMF were significantly different at the 0.01 level. * indicates significant differences in matched samples T test at the 0.05 level,NS indicates no significant differences;similarly for the followingFigures

2.2 AMF與P對(duì)混播體系相對(duì)產(chǎn)量總值(RYT)的影響

不施P處理下，接種AMF顯著增加混播體系的RYT，使RYT增加20.43%(P<0.05)；而施P處理下，接種AMF對(duì)混播體系RYT無顯著影響。此外，接種AMF處理與施P處理使得混播體系RYT > 1，說明接種AMF與施P肥使混播體系具有間作優(yōu)勢(shì)(圖2)。

圖2 AMF與磷添加對(duì)混播體系相對(duì)產(chǎn)量總值 (RYT)的影響Fig.2 Effects of AMF and P addition on relative yield total (RYT) of mixed sowing system注：P0代表不添加P肥，P1代表添加P肥Note:P0,no P fertilizer addition；P1,P fertilizer addition

2.3 AMF與P對(duì)紫花苜蓿和無芒雀麥地上競(jìng)爭(zhēng)率(CR)的影響

紫花苜蓿地上競(jìng)爭(zhēng)率<1，無芒雀麥地上競(jìng)爭(zhēng)率>1，無芒雀麥的地上競(jìng)爭(zhēng)率大于紫花苜蓿(圖3A和圖3B)。接種AMF顯著降低無芒雀麥地上競(jìng)爭(zhēng)率(圖3B，P<0.05)，對(duì)紫花苜蓿地上競(jìng)爭(zhēng)率無顯著影響(圖3A)。P肥添加對(duì)紫花苜蓿與無芒雀麥地上競(jìng)爭(zhēng)率無顯著影響(圖3A和圖3B)。

2.4 AMF與P對(duì)混播體系植物地上磷含量及磷吸收量的影響

AMF與P的主效應(yīng)顯著改變紫花苜蓿與無芒雀麥地上磷含量(圖4A和圖4B)。AMF接種使紫花苜蓿地上磷含量增加19.57%；P添加使紫花苜蓿地上磷含量增加8.87%(圖4A)。AMF接種使無芒雀麥地上磷含量增加26.14%；P添加使紫花苜蓿地上磷含量增加20.38%(圖4B)。AMF與P的交互作用對(duì)兩種植物地上磷含量無顯著影響(圖4A和圖4B)。接種AMF使紫花苜蓿地上磷吸收量增加66.12%(P<0.05,圖4C)，對(duì)無芒雀麥地上磷吸收量無顯著影響(圖4D)。P添加顯著增加無芒雀麥地上磷吸收量(P<0.05,圖4D)。

圖3 AMF與磷添加對(duì)紫花苜蓿和無芒雀麥地上競(jìng)爭(zhēng)率(CR)的影響Fig.3 Effects of AMF and P addition on aboveground competition ratio (CR) of M. sativa and B. inermis注：圖(A)是紫花苜蓿的地上競(jìng)爭(zhēng)率，圖(B)是無芒雀麥的地上競(jìng)爭(zhēng)率Note:Fig.(A),the aboveground competition ratio of M. sativa;Fig.(B),the aboveground competition ratio of B. inermis

圖4 AMF與磷添加對(duì)混播體系植物磷含量及磷吸收量的影響Fig.4 Effects of AMF and P addition on P concentration and uptake of M. sativa and B. inermis in mixed sowing system注：Control表示作為對(duì)照，不施加P肥；* *接種AMF與磷添加的主效應(yīng)差異極顯著(P<0.01)，*表示試驗(yàn)因素主效應(yīng)差異顯著(P<0.05)。不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)Note:Control,no P fertilizer addition;* * means the main effects of AMF inoculation and P addition were significantly different at the 0.01 level,* indicates significant difference in main effect of experimental factors at the 0.05 level. Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at the 0.05 level

2.5 AMF與P對(duì)單播及混播體系土壤有效養(yǎng)分的影響

播種方式顯著影響土壤無機(jī)氮含量(圖5A，P<0.01)；與無芒雀麥單播和混播相比，紫花苜蓿單播顯著增加土壤無機(jī)氮含量(圖5A，P<0.01)。AMF接種與P添加對(duì)土壤無機(jī)氮含量無顯著影響(圖5A)。P添加與AMF接種對(duì)土壤速效磷含量具有顯著的交互作用(圖5B，P<0.01)，具體表現(xiàn)在：不施P處理下，AMF接種對(duì)土壤速效磷含量無顯著影響；施P處理下，AMF接種顯著降低土壤速效磷含量(圖5B，P<0.01)。

圖5 AMF與磷添加對(duì)單播與混播體系土壤有效養(yǎng)分的影響Fig.5 Effects of AMF and P addition on soil available nutrients in monoculture and mixed sowing system注：圖(A)為土壤無機(jī)氮含量，圖(B)為土壤速效磷含量。* *磷添加主效應(yīng)、播種方式主效應(yīng)、接種AMF與磷添加的交互效應(yīng)差異極顯著(P<0.01)，*表示接種AMF主效應(yīng)差異顯著(P<0.05)Note:Fig.(A),soil inorganic N content;Fig.(B),soil available P content. * * means the main and interactive effects of AMF,P addition (P) and planting patterns (Mix) were significantly different at the 0.01 level,* means the main and interactive effects of experimental factors were significantly different at the 0.05 level

2.6 AMF與P對(duì)紫花苜蓿和無芒雀麥單播及混播體系菌根侵染率的影響

不施P處理下，紫花苜蓿單播與混播體系菌根侵染率顯著高于無芒雀麥單播體系(圖6，Mix：P< 0.01)。無論何種播種方式，施加磷肥均顯著地降低植物菌根侵染率(圖6，P：P< 0.01)。

圖6 AMF與磷添加對(duì)紫花苜蓿和無芒雀麥單播及 混播體系菌根侵染率的影響Fig.6 Effects of AMF and P addition on mycorrhizal root colonization of M. sativa and B. inermis monoculture and mixed sowing system注：* *表示播種方式主效應(yīng)與磷添加主效應(yīng)差異極顯著(P<0.01)Note:* * means the main effects of planting patterns (Mix) and P addition were significantly different at the 0.01 level

3 討論

3.1 AMF與P處理對(duì)單播及混播體系地上生物量的影響

不施P處理下接種AMF增加紫花苜蓿單播體系的地上生物量，降低無芒雀麥單播及混播體系地上生物量。紫花苜蓿是一種軸根型植物，其根表面積與比根長(zhǎng)遠(yuǎn)低于須根型的無芒雀麥[12,27]。與須根型植物相比，軸根型植物更多依賴AMF吸收土壤中的礦質(zhì)養(yǎng)分[27]。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，與無芒雀麥相比，紫花苜蓿具有較高的菌根侵染率和菌根生長(zhǎng)響應(yīng)[28]。來自全球尺度Meta分析的研究也表明：AMF使得豆科植物具有比禾草更高的競(jìng)爭(zhēng)力[29]。然而，施P處理下AMF對(duì)紫花苜蓿單播、無芒雀麥單播及混播體系無顯著影響。前人的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，土壤有效磷水平能夠改變AMF對(duì)植物生物量累積的作用強(qiáng)度；當(dāng)土壤有效磷水平較低時(shí)，植物與AMF的關(guān)系表現(xiàn)為互利共生；當(dāng)土壤有效磷水平較高時(shí)，植物與AMF的“共生”關(guān)系轉(zhuǎn)變?yōu)椤凹纳标P(guān)系[21，30]。施P處理使土壤有效磷含量由<5 mg·kg-1提升到15～20 mg·kg-1，植物混合根系菌根侵染率顯著下降，植物可能減少對(duì)AMF途徑吸收養(yǎng)分的依賴。

3.2 AMF與P處理對(duì)混播體系植物競(jìng)爭(zhēng)力的影響

豆禾混播體系中植物能夠充分利用土壤養(yǎng)分資源，并能通過占據(jù)不同的生態(tài)位而發(fā)揮混播牧草的高產(chǎn)優(yōu)勢(shì)[2,4]。在AMF處理和施磷處理下，豆禾混播的相對(duì)產(chǎn)量總值均大于1，說明AMF接種和土壤有效磷水平提升均利于紫花苜蓿和無芒雀麥(1∶1)混播體系的建植，使該混播體系具有產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)。不同物種獲取和利用資源的能力不同，使得物種間競(jìng)爭(zhēng)力存在明顯差異[31]?；觳ンw系建植初期(前4個(gè)月)無芒雀麥的地上競(jìng)爭(zhēng)率遠(yuǎn)高于紫花苜蓿，這與前人的研究是一致的[2]。此外，接種AMF和磷添加使紫花苜蓿的競(jìng)爭(zhēng)率都小于1，說明在該混播體系中紫花苜蓿處于競(jìng)爭(zhēng)劣勢(shì)。豆科植物是典型的喜P植物，一定量的磷肥添加有利于提高豆科植物的競(jìng)爭(zhēng)力[32]。我們的研究結(jié)果與前人一致，磷肥添加具有提高紫花苜蓿地上競(jìng)爭(zhēng)力的趨勢(shì)。此外，無芒雀麥地上競(jìng)爭(zhēng)率受到AMF接種的影響；接種AMF顯著抑制無芒雀麥的地上競(jìng)爭(zhēng)力。通常情況下，相比于豆科植物，禾本科作物具有更強(qiáng)的資源獲取能力[12,14]。此外，已有研究結(jié)果表明：摩西斗管囊霉菌能與紫花苜蓿和無芒雀麥形成穩(wěn)定的共生關(guān)系，生長(zhǎng)2個(gè)月即可在兩種植物之間形成菌絲網(wǎng)絡(luò)[28]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AMF能夠提高混播體系紫花苜蓿地上磷含量與磷吸收量，對(duì)無芒雀麥地上磷吸收量無顯著影響。上述研究結(jié)果說明，AMF通過影響植物種間磷素吸收過程，進(jìn)而可能降低無芒雀麥的競(jìng)爭(zhēng)力，使該混播體系趨于穩(wěn)定。

4 結(jié)論

在無芒雀麥和紫花苜蓿(1∶1)混播體系中，無芒雀麥的競(jìng)爭(zhēng)力大于紫花苜蓿。AMF能夠介入豆禾混播體系的建植過程，無論是否施加磷肥，AMF均能降低無芒雀麥的競(jìng)爭(zhēng)力，利于豆禾混播體系的維持與穩(wěn)定。