達(dá)烏里胡枝子根際解磷細(xì)菌的篩選、鑒定及特性研究

黃 臣， 楊凱元， 高 鵬， 梁銀萍， 韓玲娟， 趙 祥

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院, 山西 太谷 030801)

達(dá)烏里胡枝子(Lespedezadaurica)為豆科(Leguminosae)胡枝子屬(Lespedeza)的多年生草本狀半灌木，又稱興安胡枝子、牤牛茶、牛枝子，廣泛分布于東亞的日本、韓國(guó)以及我國(guó)的東北、華北、西北、華中、西南等地區(qū)，在干旱、寒冷、貧瘠的生境下生長(zhǎng)。達(dá)烏里胡枝子莖葉鮮嫩、蛋白質(zhì)含量高、適口性佳，可作為優(yōu)良的青飼料；其主根粗壯，側(cè)根發(fā)達(dá)，并具根瘤，能夠進(jìn)行生物固氮，是半干旱地區(qū)退化草地改良的先鋒植物，具有較高的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值[1]。

晉北黃土高原地區(qū)是我國(guó)北方重要的生態(tài)屏障[2]，但該地區(qū)土壤養(yǎng)分貧瘠，草地生產(chǎn)力低下[3]，尤其磷素嚴(yán)重虧缺，導(dǎo)致天然草地存在不同程度的退化風(fēng)險(xiǎn)，選擇鄉(xiāng)土草進(jìn)行退化草地改良是晉北黃土高原生態(tài)修復(fù)的主要途徑。磷參與植物組織內(nèi)物質(zhì)構(gòu)成、能量合成及細(xì)胞分裂等過(guò)程，是植物生長(zhǎng)代謝的必需營(yíng)養(yǎng)元素之一[4]。土壤缺磷限制了豆科植物根瘤菌的形成，降低其固氮效率和對(duì)礦物質(zhì)元素的吸收，進(jìn)而對(duì)作物產(chǎn)量與品質(zhì)造成不利影響[5-7]。達(dá)烏里胡枝子是黃土高原的鄉(xiāng)土植物，但該地區(qū)土壤磷含量嚴(yán)重虧缺，0～20 cm土壤全磷含量平均為0.63 g·kg-1[8]，達(dá)烏里胡枝子生長(zhǎng)長(zhǎng)期受到當(dāng)?shù)亓尊B(yǎng)分限制，磷匱乏是限制當(dāng)?shù)赝嘶莸馗牧己偷V區(qū)生態(tài)修復(fù)中達(dá)烏里胡枝子生長(zhǎng)的重要因子[9]，極大制約其生態(tài)價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值的增長(zhǎng)。當(dāng)前，施加磷肥是緩解土壤缺磷的主要手段，但存在成本高、利用效率低，且易造成環(huán)境面源污染和土壤酸化板結(jié)等問(wèn)題[10-11]，而微生物在土壤物質(zhì)和能量循環(huán)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其中解磷菌(Phosphate-solubilizing microorganisms，PSM)可將土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化為被植物吸收的有效磷[12]。植物通過(guò)根系招募解磷菌等方式加速土壤磷轉(zhuǎn)化，保證其生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)磷的需求。近年來(lái)，隨著國(guó)家生態(tài)環(huán)境保護(hù)和綠色農(nóng)業(yè)等政策的實(shí)施，挖掘新的促生菌劑、開(kāi)發(fā)微生物肥料受到重視，解磷菌具有廣闊的應(yīng)用前景[13]。

迄今為止，國(guó)內(nèi)外已從豆科等植物根際分離、篩選到的解磷菌有二十多個(gè)屬，主要包括假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、根瘤菌屬(Rhizobium)、沙雷氏菌屬(Serratia)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和腸桿菌屬(Enterobacter)等。此外一些真菌，如根霉屬(Rhizopus)也被發(fā)現(xiàn)具有解磷功能[14-15]。目前，針對(duì)胡枝子屬植物根際微生物的研究較多，內(nèi)容主要包括促生菌的分離、鑒定和功能驗(yàn)證，以及在礦區(qū)和退化草地生態(tài)修復(fù)中的應(yīng)用。例如，胡枝子屬植物根瘤內(nèi)生菌與水稻(Oryzasativa)葉片內(nèi)生菌共同接種，可顯著促進(jìn)大豆結(jié)瘤，提高根瘤固氮效率[16]。截葉鐵掃帚(Lespedezacuneata)根瘤中分離出1株對(duì)銅、鎘、鉛和鋅等重金屬具有高抗性的菌株CCNWRS33-2，并表現(xiàn)出較好的重金屬富集能力[17]；二色胡枝子(Lespedezabicolor)根際分離出1株阮桿菌屬Nguyenibacter菌株，可通過(guò)分泌葡萄糖酸，減輕鋁對(duì)植物的毒害[18]。關(guān)于達(dá)烏里胡枝子根際促生菌的研究相對(duì)較少，僅有胡志偉[19]報(bào)道了從其根際分離出1株具有解磷功能的促生菌，相關(guān)系統(tǒng)研究尚未開(kāi)展。

因此，本研究通過(guò)對(duì)達(dá)烏里胡枝子根際土壤微生物進(jìn)行分離，篩選出高效、抗逆性強(qiáng)，且具有促生作用的解磷菌，并初步探討其解磷機(jī)制，以期為后續(xù)研發(fā)適合于晉北黃土高原地區(qū)建植胡枝子使用的解磷菌劑提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

2021年8月，研究地為山西省晉中市太谷區(qū)‘晉農(nóng)一號(hào)’達(dá)烏里胡枝子種植田(112°60′E，37°44′ N)。在對(duì)角線上設(shè)置5個(gè)1 m×1 m的樣方，每個(gè)樣方內(nèi)，用75% 酒精表面消毒的鐵鏟挖取長(zhǎng)×寬×高為40 cm×20 cm×20 cm的達(dá)烏里胡枝子根系土坯，放置于無(wú)菌自封袋中，于4℃便攜式冷藏箱中保存并帶回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行土壤根際土的分離。

1.2 供試培養(yǎng)基

使用Pikovaskaia’s(PKO)無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基、蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基進(jìn)行解磷菌的分離[20]，使用LB培養(yǎng)基進(jìn)行解磷菌的常規(guī)培養(yǎng)[20]，淀粉瓊脂培養(yǎng)基用于測(cè)定淀粉水解試驗(yàn)[21]，明膠培養(yǎng)基用于明膠液化測(cè)試[21]，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基用于甲基紅測(cè)試[21]，CAS培養(yǎng)基用于解磷菌鐵載體分泌能力測(cè)定[22]，葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基用于解磷菌有機(jī)酸分泌能力測(cè)定[23]。

1.3 達(dá)烏里胡枝子根際有效解磷菌的初篩

1.3.1土壤或植物稀釋液的制備 將根際分為4個(gè)區(qū)域，即非根際(Soil away from roots，NRS)、根際(Soil adhering to roots，RS)、根系表面(Rhizoplan of roots，RP)和根內(nèi)(Histoplan of roots，HP)。將田間采集的達(dá)烏里胡枝子根系土坯輕輕壓裂并抖落獲得非根際土壤，然后用滅菌毛刷輕輕刷落根際表面土壤獲得根際土，將非根際土、根際土和植物根系置于無(wú)菌自封袋中，置于4℃條件下保存[20]。取5 g非根際土置于盛有45 mL 0.85%滅菌生理鹽水的離心管中，振蕩器(HY-2型、力辰科技有限公司)上200 r·min-1振蕩30 min，靜置收集上清液，即為濃度10-1的NRS稀釋液；取0.5 g根際土放入盛有4.5 mL 0.85%滅菌生理鹽水的離心管中，高速離心機(jī)800 r·min-1離心2 min，靜置收集上清液即為濃度10-1的RS稀釋液；取植物根系1 g，無(wú)菌水沖洗，放入盛有9 mL 0.85%滅菌生理鹽水的離心管中，加入滅菌小鋼珠，在高速離心機(jī)1 000 r·min-1離心10 min，靜置收集上清液即為濃度10-1的RP稀釋液；將離心過(guò)的根系用75%酒精浸泡30 s，放入2%的次氯酸鈉(NaClO)溶液中處理5 min，無(wú)菌水沖洗3次，無(wú)菌濾紙吸干根系表面水分，置于研缽中研磨，用9 mL 0.85%滅菌生理鹽水分3次沖洗研缽，將研缽中的生理鹽水連同根系一同轉(zhuǎn)入離心管中，高速離心機(jī)1 500 r·min-1離心5 min，上清液即為濃度10-1的HP稀釋液。通過(guò)梯度稀釋方法依次制備10-2,10-3,10-4和10-5的達(dá)烏里胡枝子根際4個(gè)區(qū)域的稀釋液[20]。

1.3.2解磷菌的分離 分別吸取上述4個(gè)區(qū)域濃度為10-3,10-4和10-5的稀釋液50 μL，用滅菌玻璃涂布棒涂布于蒙金娜固體培養(yǎng)基，倒置放入溫度為28℃的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。待單個(gè)菌落出現(xiàn)后，挑取培養(yǎng)基上形成明顯透明圈的菌落置于LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分區(qū)劃線，重復(fù)多次，直至獲得純菌株。將具有解有機(jī)磷能力的菌株接種在PKO固體培養(yǎng)上，觀察是否可形成明顯透明圈，即是否具有解無(wú)機(jī)磷的能力。

1.3.3有效解磷菌的初篩 將兼具解有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷的菌株接種于LB培養(yǎng)基上活化，培養(yǎng)48 h后刮取菌落制備菌懸液，吸取5 μL懸浮液(OD600=2)接種于PKO無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基和蒙金娜有機(jī)磷固體培養(yǎng)基上。為避免培養(yǎng)基性狀對(duì)菌株生長(zhǎng)造成影響，使用培養(yǎng)基分裝器(P17型、重慶江雪科技有限公司)向每個(gè)培養(yǎng)皿定量分裝20 mL培養(yǎng)基。每個(gè)菌株5個(gè)重復(fù)，在第7 d分別用十字交叉法測(cè)定各菌株形成的透明溶磷圈直徑(D)和菌落直徑(d)，根據(jù)D/d值(可溶性指數(shù)值)的大小對(duì)有效解磷菌進(jìn)行初篩。

1.4 菌種鑒定

1.4.1菌落及菌體形態(tài)觀察 將篩選出的菌株接種于LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，觀察菌落形狀、顏色等特征，并進(jìn)行革蘭氏染色，使用光學(xué)顯微鏡(BX51型、日本Olympus公司)觀察菌體形態(tài)。

1.4.2菌株生理生化反應(yīng) 對(duì)已篩選出的菌株進(jìn)行明膠液化[24]、淀粉水解[24]、甲基紅試驗(yàn)[24]、過(guò)氧化氫酶反應(yīng)[21]測(cè)定。

1.4.3解磷菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將解磷菌株分別接種到LB液體培養(yǎng)基，37℃，180 r·min-1培養(yǎng)12 h，使用分光光度計(jì)調(diào)整菌液濃度至OD600=0.1用于接種。在100 mL LB液體培養(yǎng)基中接種5 mL OD600=0.1的菌液，30℃，180 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)26 h，每隔2 h監(jiān)測(cè)一次OD600值并記錄，觀測(cè)菌株的生長(zhǎng)狀況并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4.416S rDNA序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析 篩選出有效解磷菌株的鑒定采用 16S rDNA基因序列比對(duì)。使用20 μL移液槍頭沾取少量菌液，置于盛有20 μL無(wú)菌水的PCR八連排管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通用引物采用27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，PCR反應(yīng)體系(50 μL)為2×Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O19 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30 次；最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程上海股份有限公司測(cè)序。將測(cè)得的 16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)，獲得登錄號(hào)。

1.5 達(dá)烏里胡枝子根際解磷菌解磷能力及其磷酸酶活性的測(cè)定

1.5.1解有機(jī)磷(卵磷脂)能力的定量測(cè)定 將解磷菌株接種于LB培養(yǎng)基上活化，吸取1 mL懸浮液(OD600=0.8)接種于60 mL的蒙金娜液體培養(yǎng)基中，重復(fù)3次，接種無(wú)菌水為對(duì)照，置于28℃,180 r·min-1的振蕩培養(yǎng)箱(ZQLY-180E型、上海知楚儀器有限公司)中黑暗培養(yǎng)5 d，在渦旋儀(MX-S型、大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)上混勻5 min，取10 mL培養(yǎng)液，10 000 r·min-1高速離心15 min，取出上清液采用“鉬銻抗比色法”測(cè)定有效磷(Available phosphorus,AP)含量，確定菌株解有機(jī)磷的能力，使用pH計(jì)對(duì)上清液的pH值進(jìn)行測(cè)定[12]。

1.5.2磷酸酶活性的測(cè)定 采用堿性及酸性磷酸酶試劑盒(購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司)對(duì)1.5.1中獲得的上清液的磷酸酶活性進(jìn)行測(cè)定。主要步驟如下，37℃，遮光條件下與上清液作用15 min后，每毫升上清液每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol的酚定義為1個(gè)酶活力單位。

1.5.3解無(wú)機(jī)磷(磷酸鈣)能力的測(cè)定 以磷酸鈣為磷源，對(duì)有效解磷菌解無(wú)機(jī)磷的能力進(jìn)行定量測(cè)定，方法同1.5.1。

1.6 達(dá)烏里胡枝子根際解磷菌抗逆特征

1.6.1高低溫耐受性 將活化的解磷菌接種于LB培養(yǎng)基中，置于4℃，20℃，28℃，37℃，60℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，觀察、記錄菌株的溫度適應(yīng)性，并采用“十字交叉法”測(cè)定菌株直徑，重復(fù)3次。

1.6.2耐鹽性 分別調(diào)整LB培養(yǎng)基的NaCl濃度值0%，1%，2%，5%，7%，10%，培養(yǎng)、觀察、記錄菌株耐鹽性，并采用“十字交叉法”測(cè)定菌株直徑，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.6.3耐酸堿性 通過(guò)0.1 mol·L-1NaOH，0.1 mol·L-1HCl溶液調(diào)整LB培養(yǎng)基pH值，分別為pH5，pH6，pH7，pH8，pH9，pH10，pH11，pH12，重復(fù)3次，培養(yǎng)、觀察、記錄菌株耐酸堿性。

1.7 達(dá)烏里胡枝子根際解磷菌促生特性

對(duì)篩選菌株進(jìn)行分泌鐵載體能力[22]、產(chǎn)有機(jī)酸能力[23]和吲哚反應(yīng)測(cè)定[21]。

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft excel 2019整理數(shù)據(jù)，使用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)不同菌株的可溶性指數(shù)、液體培養(yǎng)基中有效磷含量、磷酸酶活性以及促生特性進(jìn)行單因素方差分析和LSD法多重比較(P<0.05)。采用Origin 2021 統(tǒng)計(jì)軟件繪制解磷菌解磷能力的柱狀圖，使用MEGA X軟件將序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的相近序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展值(bootstrap)為1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 達(dá)烏里胡枝子根際解磷菌的初篩

如表1所示，利用蒙金娜和PKO培養(yǎng)基從達(dá)烏里胡枝子根際土壤中非根際土、根際土、根表、根內(nèi)分別篩選、純化出3株、8株、15 株、1株具有解有機(jī)磷能力的菌株，其中可溶性指數(shù)≥1.50的菌株有9株，分別為DP7，DP12，DP15，DP20，DP22，DP25，DP26，DP27，DP28，DP29。如圖1b，圖1c所示，DP24，DP25，DP27和DP28菌株兼具解無(wú)機(jī)磷的能力，解有機(jī)磷可溶性指數(shù)在1.50～2.06，初步確定為有效解磷菌。

表1 解磷菌解磷可溶性指數(shù)Table 1 Solubility index of PSM

圖1 解磷菌形態(tài)特征及解磷能力Fig.1 Morphological characteristics and phosphate-solubilizing ability of PSM注：a為解磷菌形態(tài)學(xué)特征；b為解無(wú)機(jī)磷能力；c為解有機(jī)磷能力Note:a is morphological characteristics of PSM;b is inorganic phosphorus-solubilizing ability;c is organic phosphorus-solubilizing ability

2.2 達(dá)烏里胡枝子根際解磷菌的鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué)特征 4株有效解磷菌菌落形態(tài)特征如圖1(a)所示，DP24，DP25和DP27在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48 h后菌落直徑分別約為6.69 mm，5.48 mm，4.94 mm，2.71 mm；菌落均呈凸起狀，邊緣整齊；菌落顏色分別為黃色、乳黃色和乳白色。4株有效解磷菌的細(xì)胞形態(tài)如圖2所示，DP24的細(xì)胞呈長(zhǎng)桿狀，大小為(1.25～2.38) μm×(0.25～0.34) μm；DP25和DP27均為球桿狀，大小分別為(0.85～1.38) μm×(0.67～0.79) μm、(0.71～1.00) μm×(0.52～0.73) μm。DP28在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48 h后，菌落形態(tài)也呈凸起狀，表面濕潤(rùn)，但邊緣不整齊，呈齒狀；顏色為乳白色，細(xì)胞呈球狀，大小為(0.55～0.70) μm×(0.51～0.66) μm。

圖2 4株解磷菌革蘭氏染色結(jié)果Fig.2 Gram staining of four PSM注：a為DP24革蘭氏染色下解磷菌的菌體形態(tài)；b為DP25革蘭氏染色下解磷菌的菌體形態(tài)；c為DP27革蘭氏染色下解磷菌的菌體形態(tài)；d為DP28革蘭氏染色下解磷菌的菌體形態(tài)Note:a is morphological of PSM by the strain DP24;b is morphological of PSM by the strain DP25;c is morphological of PSM by the strain DP27;d is morphological of PSM by the strain DP28

2.2.2生理生化特性 如圖2所示，DP24,DP25和DP27的革蘭氏染色均為陰性，DP28為陽(yáng)性。4株解磷菌在明膠培養(yǎng)基中培養(yǎng)后均無(wú)液化現(xiàn)象，即為陰性反應(yīng)，表明無(wú)水解明膠的能力；在4株解磷菌培養(yǎng)基上滴加碘液，菌落周圍均呈藍(lán)色，表明無(wú)水解淀粉的能力；在接種解磷菌的葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中滴加甲基紅指示劑，菌株DP24,DP25和DP27顏色無(wú)明顯變化，為陰性反應(yīng)，菌株DP28呈紅色陽(yáng)性反應(yīng)；4株解磷菌的過(guò)氧化氫酶反應(yīng)均產(chǎn)生氣泡，為陽(yáng)性反應(yīng)，表明具有產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶的能力，其中DP24和DP28過(guò)氧化氫酶反應(yīng)最為強(qiáng)烈(表2)。

表2 解磷菌生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristic of PSM

2.2.3解磷菌的生長(zhǎng)曲線 各菌株生長(zhǎng)曲線均可分為三個(gè)時(shí)期，即指數(shù)生長(zhǎng)期、平穩(wěn)增長(zhǎng)期和緩慢衰落期，菌株DP25,DP27在培養(yǎng)前18 h以指數(shù)倍數(shù)快速增長(zhǎng)，8～24 h以平穩(wěn)速度緩慢增長(zhǎng)。菌株DP24,DP28在0～8 h和18～24 h內(nèi)平穩(wěn)速度緩慢增長(zhǎng)，在培養(yǎng)8～20 h，以指數(shù)倍數(shù)快速增長(zhǎng)(圖3)。

圖3 4株解磷菌的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of four PSM

2.2.4分子生物學(xué)特性 解磷菌DP24(GenBank登錄號(hào):ON077029)、DP25(GenBank登錄號(hào):ON077030)、DP27(GenBank登錄號(hào):ON077031)、DP28(GenBank登錄號(hào):ON077032)的16S rDNA序列長(zhǎng)度分別為1 439 bp，1 444 bp，1 440 bp，1 459 bp。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析(圖4)，DP24與假單胞菌屬(Pseudomonassp.)(MW578922.1)的序列同源性最高，達(dá)到99.79%；DP25與DP27聚為一類，與不動(dòng)桿菌屬(Acinetobactersp.)(MZ430421.1)的序列同源性均達(dá)到99.79%；菌株DP28與表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)(MN511770.1)的序列同源性達(dá)到99.79%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性，確定DP24為韓國(guó)假單胞菌(Pseudomonaskoreensis)；DP25和DP27為醋酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)；DP28為表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。

圖4 菌株DP24，DP25，DP27和DP28基于16S rRNA基因序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Molecular phylogenetic anylysis of strains DP24，DP25，DP27 and DP28 from 16S rRNA region

2.3 達(dá)烏里胡枝子根際解磷菌解有機(jī)磷磷能力及其磷酸酶活性

如圖5 a所示，DP24，DP25，DP27和DP28在蒙金娜液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，DP25，DP27和DP28培養(yǎng)液的有效磷含量均顯著高于對(duì)照(P<0.05)，分別較對(duì)照增加9.14 倍、8.92 倍、17.3 倍。DP24,DP27和DP28培養(yǎng)液的pH均顯著高于對(duì)照(P<0.05)，分別較對(duì)照增加了3.37%，4.25%和7.32%(圖5 b)。

培養(yǎng)5 d后，DP24，DP25，DP27和DP28培養(yǎng)液中的酸性磷酸酶活性分別較對(duì)照增加了2.34 U·L-1，9.77 U·L-1，16.61 U·L-1，12.14 U·L-1(P<0.05)；DP27和DP28分別較對(duì)照增加了29.93 U·L-1，25.95 U·L-1(P<0.05)。

圖5 解磷菌對(duì)有機(jī)磷的解磷能力、pH及磷酸酶活性Fig.5 Phosphate-solubilizing ability,pH and phosphatase activity of PSM to organic phosphorus 注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同Note:Different lowercase letters indicates significant difference at the 0.05 level. The same as below

2.4 達(dá)烏里胡枝子根際解磷菌解無(wú)機(jī)磷能力

如圖6所示，DP24，DP25，DP27和DP28在PKO無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，DP25，DP27，DP28有效磷含量與對(duì)照差異顯著，分別較對(duì)照增加了901.79 倍、931.13 倍和637.32 倍。DP25，DP27和DP28培養(yǎng)液的pH值均顯著低于對(duì)照(P<0.05)，呈弱酸性，分別較對(duì)照降低了38.37%，32.70%和32.09%。

圖6 解磷菌對(duì)無(wú)機(jī)磷的解磷能力及pH特征Fig.6 Inorganic phosphorus decomposition ability of PSM

2.5 達(dá)烏里胡枝子根際解磷菌的抗逆特性

如表3所示，DP25與DP27在4℃條件下均可生長(zhǎng)，具有一定的耐低溫能力，但均不具備在60℃條件下生長(zhǎng)能力，不耐高溫。耐鹽性方面，DP28可在1%～10%含鹽量條件下生長(zhǎng)，耐鹽性能最佳；DP24，DP25，DP27次之，最大耐鹽量均為5%。耐酸堿方面，DP25，DP28在pH值為4～12條件下可以生長(zhǎng)，耐酸堿性能最佳；DP24，DP27次之，菌株可耐受pH值區(qū)間分別為4～9和5～10。

表3 解磷菌對(duì)溫度、鹽分和酸堿度等逆境的抗逆特征Table 3 Temperature、salinity and pH of the PSM

2.6 達(dá)烏里胡枝子根際解磷菌的促生特性

如表4所示，D24，DP25，DP27均具有分泌鐵載體能力，DP25，DP27分泌能力較強(qiáng)，DP28不具有分泌鐵載體能力。4株有效解磷菌均具有分泌有機(jī)酸的能力，DP28分泌有機(jī)酸能力最強(qiáng)，其次為DP25，DP27。4株有效解磷菌在培養(yǎng)界面均無(wú)紅色環(huán)出現(xiàn)，即不具有產(chǎn)生吲哚的能力。

表4 解磷菌的促生特性Table 4 Growth promoting characteristics of PSM

3 討論

目前已報(bào)道胡枝子屬植物的根際解磷菌主要包括伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、根瘤菌屬(Rhizobium)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、微桿菌屬(Microbacterium)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)、泛菌屬(Pantoea)等[25-26]。在胡枝子屬植物根際解磷菌研究中尚未見(jiàn)不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)相關(guān)報(bào)道，本研究從達(dá)烏里胡枝子根際篩選出上述兩種菌株，發(fā)現(xiàn)具有較好的解磷能力，豐富了胡枝子屬植物解磷菌資源庫(kù)。目前，假單胞菌屬(Pseudomonas)、醋酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)作為黃土高原植物的根際促生菌研究較多[27-29]，說(shuō)明根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成受地域等因素的影響。此外，研究發(fā)現(xiàn)上述菌株在不同種類植物根際均有定殖現(xiàn)象，表明部分根際解磷菌具有較強(qiáng)的普遍適用性，可作為優(yōu)質(zhì)解磷菌資源用于后續(xù)微生物肥料的研發(fā)。

解磷能力是篩選解磷菌資源的基本標(biāo)準(zhǔn)，Zhang等[30]從紅花根際篩選出的葡萄球菌屬菌株RC03、不動(dòng)桿菌屬菌株RC04解無(wú)機(jī)磷量為112.5 mg·L-1,168.5 mg·L-1；Khanghahi等[32]從小麥根際篩選出的不動(dòng)桿菌屬菌株NT28解無(wú)機(jī)磷量為115.5 mg·L-1。本研究篩選的DP25,DP27,DP28解無(wú)機(jī)磷量可達(dá)478.48 mg·L-1，494.03 mg·L-1,338.30 mg·L-1，均比上述解磷菌株高，這可能是由于黃土高原地區(qū)土壤養(yǎng)分貧瘠，磷素含量低，使得植物根際釋放信號(hào)招募解磷能力強(qiáng)的微生物[31]。

在本研究中發(fā)現(xiàn)菌株DP25,DP27在4℃低溫和37℃高溫條件下均可生長(zhǎng)，這是其長(zhǎng)期適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境形成的特殊耐高低溫能力[38]，在我國(guó)甘肅、四川等地均有發(fā)現(xiàn)[39-40]，預(yù)示其具有廣泛的環(huán)境適應(yīng)能力，可在除黃土高原地區(qū)以外的我國(guó)南、北方地區(qū)進(jìn)行廣泛應(yīng)用。此外，研究表明醋酸鈣不動(dòng)桿菌可在含鹽量0%～5%或pH值為8.5～10條件下生長(zhǎng)[41]，葡萄球菌屬微生物可在含鹽量10%和pH值為10的條件下生長(zhǎng)[42]。DP25,DP27和DP28亦具有較強(qiáng)耐鹽和耐酸堿能力，其中DP28耐鹽量可達(dá)10%，DP25，DP28在pH值為4～12條件下均可生長(zhǎng)，而土壤鹽漬化是山西省主要退化草地類型，鹽漬化面積占全省總面積的9.7%[43]，因此上述菌株在山西鹽漬化草地生態(tài)修復(fù)方面具有良好的應(yīng)用潛力。本研究發(fā)現(xiàn)DP24,DP25,DP27還具有機(jī)酸和鐵載體分泌能力。研究表明，大部分根際促生菌均能夠分泌有機(jī)酸和對(duì)鐵有親和力的鐵螯合物(即鐵載體)[44]。細(xì)菌分泌的有機(jī)酸可協(xié)助植物溶解土壤中難溶性磷和鉀，進(jìn)而促進(jìn)其生長(zhǎng)[45]。鐵載體是一種對(duì)Fe3+具有極強(qiáng)親和力的低分子化合物，可與土壤中不可利用的Fe3+結(jié)合，是植物吸收利用鐵素的主要途徑[46]；同時(shí)通過(guò)這種方式消耗鐵元素來(lái)與病原細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)鐵，從而降低一些土傳細(xì)菌病害的發(fā)生[47]；此外，鐵載體在調(diào)控土壤微生物磷代謝機(jī)制中也發(fā)揮重要作用[48]。綜上所述，本試驗(yàn)初步認(rèn)定DP25，DP27可作為潛在的根際促生菌資源，下一步的研究將進(jìn)行盆栽與田間試驗(yàn)，驗(yàn)證菌株DP25，DP27對(duì)植物的促生效果。

4 結(jié)論

本研究從山西省黃土高原地區(qū)達(dá)烏里胡枝子根際土壤及根系表面分離、篩選到4株解磷菌株，其中3株為高效解磷菌株。初步鑒定菌株DP25，DP27均屬醋酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)，DP28屬于表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。不動(dòng)桿菌屬作為土壤中的常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)菌群，在土壤中具有較強(qiáng)的定殖能力，有利于對(duì)菌種的后期開(kāi)發(fā)利用。篩選出的表皮葡萄球菌具有較好的解磷、耐鹽和耐酸堿能力，可作為微生物肥料研發(fā)菌種。下一步將通過(guò)盆栽試驗(yàn)，驗(yàn)證上述解磷菌對(duì)達(dá)烏里胡枝子植株根際的解磷性能及增產(chǎn)效果，為后續(xù)研發(fā)高效穩(wěn)定的微生物磷肥提供科學(xué)依據(jù)，并在山西省黃土高原地區(qū)鹽堿地、礦區(qū)等退化土地上進(jìn)行推廣應(yīng)用，充分發(fā)揮達(dá)烏里胡枝子的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。