γ- 干擾素釋放試驗(yàn)輔助診斷不同年齡段 肺結(jié)核的價(jià)值分析

龍妍帆，蒙是升

（江門市結(jié)核病防治所結(jié)核內(nèi)科，廣東 江門 529020）

肺結(jié)核是威脅全世界人群健康的一種傳染性疾病，在全國第5次結(jié)核病調(diào)查中提出，全國≥ 15歲人口中活動(dòng)性肺結(jié)核患者已經(jīng)高達(dá)499萬人，疾病負(fù)擔(dān)嚴(yán)重[1]。因此，盡早篩查、診斷肺結(jié)核，對(duì)防止其傳播具有重要意義。目前，結(jié)核病的診斷主要采用臨床癥狀、影像學(xué)、微生物學(xué)、病理學(xué)等多種手段，但由于部分患者臨床與影像學(xué)表現(xiàn)不典型，微生物學(xué)檢測(cè)陽性率低或病理學(xué)標(biāo)本取材困難等因素，導(dǎo)致結(jié)核病早期診斷仍然較為困難[2]。隨著近年來醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，γ-干擾素釋放試驗(yàn)（IGRA）為結(jié)核病的早期診斷提供了新的方向，結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）作為IGRA的一種，其主要原理是利用結(jié)核分枝桿菌株系表達(dá)的抗原，刺激外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素（IFN-γ）來進(jìn)行診斷，且有研究發(fā)現(xiàn)，其陽性率可達(dá)87.31%，具有較高的診斷價(jià)值[3]。本研究通過回顧性分析不同年齡段疑似肺結(jié)核患者的臨床資料，旨在進(jìn)一步評(píng)估IGRA對(duì)不同年齡段肺結(jié)核的診斷價(jià)值，為臨床提供參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2018年1月至2019年12月江門市結(jié)核病防治所接收的500例疑似肺結(jié)核患者的臨床資料，根據(jù)患者年齡的不同分成青年組（18～44歲，142例）、中年組（45～59歲，113例）、老年組（≥60歲，245例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：存在咳嗽、咳痰≥ 2周，咯血或血痰等任何1項(xiàng)癥狀者即判斷為肺結(jié)核可疑患者；無其他肺部疾病者；臨床資料完整者等。排除標(biāo)準(zhǔn)：乙型或丙型肝炎病毒感染者；人類免疫缺陷病毒感染者；合并惡性腫瘤疾病者。本研究經(jīng)過院內(nèi)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 檢測(cè)方法所有患者均進(jìn)行痰涂片與IGRA診斷，其中痰涂片方法參照《中國結(jié)核病防治規(guī)劃：痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊(cè)》[4]中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序執(zhí)行，利用顯微鏡對(duì)標(biāo)本進(jìn)行觀察，選擇100個(gè)視野，當(dāng)視野中可發(fā)現(xiàn)3個(gè)及以上的結(jié)核分枝桿菌時(shí)，則判斷為肺結(jié)核陽性。而IGRA診斷主要以T-SPOT.TB試劑盒進(jìn)行測(cè)定，在實(shí)際的檢測(cè)中嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，方法如下：采集患者6 mL的外周靜脈血液，經(jīng)抗凝處理后，用淋巴細(xì)胞分離液輔助獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），將其制備成2.5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。每份待測(cè)樣本需要4個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔，每孔均加入0.1 mL的細(xì)胞懸液，以細(xì)胞培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，植物血凝素為陽性對(duì)照，早期分泌抗原靶點(diǎn)6（ESAT-6）、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾過蛋白10（CFP-10）為刺激抗原，后將微孔板放入到5%二氧化碳（CO2）的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，于第2天取出培養(yǎng)板，采用磷酸鹽緩沖液洗板4次，加入50 μL酶標(biāo)二抗工作液，于2～8 ℃溫度下反應(yīng)1 h；再次洗板4次，加入50 μL顯色底物液，閉光顯色7 min后，使用蒸餾水終止反應(yīng)，干燥后對(duì)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行觀察，并應(yīng)用酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀計(jì)數(shù)著色斑點(diǎn)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：①若陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù) ≤ 5個(gè)/106PBMCs時(shí)，且任意1個(gè)檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù) - 陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)＞6個(gè)/106PBMCs可判定為陽性；②陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥ 6個(gè)/106PBMCs時(shí)，任意1個(gè)檢測(cè)孔的斑點(diǎn)數(shù)≥ 2倍陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)可判定為陽性[5]。

1.3 觀察指標(biāo)①對(duì)比不同年齡段疑似患者一般資料，包括性別、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、合并腫瘤疾病等。②對(duì)比不同年齡段疑似患者痰涂片與T-SPOT.TB檢測(cè)對(duì)肺結(jié)核的診斷結(jié)果。③以痰涂片檢測(cè)為金標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)對(duì)比T-SPOT.TB檢測(cè)對(duì)不同年齡段疑似肺結(jié)核患者的診斷價(jià)值，敏感度=真陽例數(shù)/（真陽+假陰）例數(shù)×100%，特異度=真陰例數(shù)/（假陽+真陰）例數(shù)×100%，準(zhǔn)確度=（真陽+真陰）例數(shù)/總例數(shù)×100%，陽性預(yù)測(cè)值=真陽例數(shù)/（真陽+假陽）例數(shù)×100%，陰性預(yù)測(cè)值=真陰例數(shù)/（假陰+真陰）例數(shù)×100%。④對(duì)比不同年齡組確診肺結(jié)核患者T-SPOT.TB檢測(cè)中斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用[例(%)]表示，組間兩兩比較行χ2檢驗(yàn)，多組間比較采用χ2趨勢(shì)檢驗(yàn)；計(jì)量資料不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)（四分位數(shù)） [M(P25，P75)]表示，兩組間比較采用Mann WhitneyU檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskall-WallisH檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組疑似患者一般資料比較3組疑似患者的性別、BMI、合并腫瘤疾病的占比比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 3組疑似患者一般資料比較[ 例(%)]

2.2 不同年齡段疑似患者痰涂片與T-SPOT.TB檢測(cè)對(duì)肺結(jié)核的診斷結(jié)果500例疑似肺結(jié)核T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果顯示，青年組、中年組、老年組中T-SPOT.TB檢測(cè)陽性率分別為76.76%（109/142）、73.45%（83/113）、62.86%（154/245），老年組陽性率均顯著低于青年組、中年組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.981、3.879，均P＜0.05）；青年組與中年組陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 不同年齡段疑似患者痰涂片與T-SPOT.TB檢測(cè) 對(duì)肺結(jié)核的診斷結(jié)果（例）

2.3 T-SPOT.TB檢測(cè)對(duì)不同年齡段疑似肺結(jié)核患者的診斷價(jià)值T-SPOT.TB檢測(cè)對(duì)老年組疑似肺結(jié)核患者的診斷敏感度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均顯著低于青年組，且陽性預(yù)測(cè)值顯著低于中年組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而青年組與中年組的診斷價(jià)值指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表3。

表3 T-SPOT.TB檢測(cè)對(duì)不同年齡段疑似肺結(jié)核患者的診斷價(jià)值比較(%)

2.4 不同年齡組確診肺結(jié)核患者T-SPOT.TB檢測(cè)中斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)量比較401例確診肺結(jié)核病例T-SPOT.TB檢測(cè)顯示，青年組斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)量為188個(gè)（102，241）/106PBMCs，中年組為142個(gè)（65，254）/106PBMCs，老年組為71個(gè)（47，160）/106PBMCs。青年組與中年組比較顯著升高（Z=4.556），青年組與老年組比較顯著升高（Z=7.451），中年組與老年組比較顯著升高（Z=5.662），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

肺結(jié)核是一種由結(jié)核分枝桿菌感染所導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng)傳染病，病灶主要發(fā)生在肺組織、氣管、支氣管部位，是一種常見且難以進(jìn)行病原學(xué)診斷的疾病[6]。痰涂片是目前診斷肺結(jié)核的主要方法，也是評(píng)估治療效果的重要參考，但該方式具有耗時(shí)長(zhǎng)、部分患者采樣困難的不足，從而給臨床診斷帶來一定程度上的困難[7]。

肺結(jié)核的發(fā)生是由機(jī)體對(duì)感染的結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，在人體初次被結(jié)核分枝桿菌感染后，使機(jī)體T淋巴細(xì)胞致敏，轉(zhuǎn)變?yōu)橛洃汿淋巴細(xì)胞，若是機(jī)體再次接觸結(jié)核分枝桿菌就迅速生成效應(yīng)T淋巴細(xì)胞同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生并且釋放多種細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)作用，而其中重要的因子就是INF-γ。而基于這一發(fā)病機(jī)制，臨床中衍生出T-SPOT.TB這一免疫診斷方式，其中T-SPOT.TB利用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)，將結(jié)核桿菌ESAT-6、CFP-10在體外與PBMC共孵育，通過檢測(cè)分泌INF-γ的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量判斷機(jī)體有無結(jié)核桿菌感染[8]。研究表明，隨著年齡增長(zhǎng)，免疫系統(tǒng)不可避免地會(huì)發(fā)生衰退，其機(jī)制涉及免疫器官、免疫細(xì)胞及免疫分子各種水平，如樹突細(xì)胞對(duì)抗原攝取及其成熟能力、外周T細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定與分化、增殖及效應(yīng)分子的分泌能力等[9]。鑒于此，本研究選取了不同年齡段的疑似肺結(jié)核患者，通過分析其性別、BMI、合并腫瘤疾病發(fā)現(xiàn)，3組疑似患者的性別、BMI、合并腫瘤疾病的占比比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明上述一般資料不會(huì)影響T-SPOT.TB檢測(cè)的準(zhǔn)確性；本研究進(jìn)一步觀察了各個(gè)年齡段的T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)隨著年齡升高，假陰性例數(shù)逐漸增多。但由于本研究未納入使用免疫抑制劑的人群，也未能對(duì)假陰性的患者進(jìn)行人類白細(xì)胞抗原（HLA）分型，因此，對(duì)于這些因素是否是輔助確認(rèn)T-SPOT.TB陰性的原因，仍需更多研究進(jìn)一步證實(shí)。

此外，本研究中，老年組T-SPOT.TB檢測(cè)診斷敏感度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均顯著低于青年組，且陽性預(yù)測(cè)值顯著低于中年組，說明相較于老年人群，T-SPOT.TB檢測(cè)對(duì)中、青年人群的輔助診斷價(jià)值相對(duì)較高。可能是隨著年齡增長(zhǎng)，胸腺的萎縮、骨髓造血干細(xì)胞與外周血免疫細(xì)胞數(shù)量的減少、免疫細(xì)胞分化增殖及發(fā)揮免疫反應(yīng)的能力降低，導(dǎo)致T細(xì)胞絕對(duì)值及其功能的下降，使老年人群對(duì)于T-SPOT.TB檢測(cè)的敏感性降低。同時(shí)，在潘麗萍等[10]研究中還表明，在老年結(jié)核病例中，隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體免疫力逐漸下降，從而對(duì)結(jié)合抗原的應(yīng)答能力也趨于下降，因此表現(xiàn)出結(jié)合抗原刺激后釋放INF-γ的斑點(diǎn)數(shù)降低，甚至不反應(yīng)。在本研究中，老年組斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)量顯著低于中年組與青年組，說明老年肺結(jié)核患者中T-SPOT.TB的診斷敏感性低于中、青年患者。

綜上，將T-SPOT.TB檢測(cè)用于輔助診斷肺結(jié)核患者有著較高的診斷價(jià)值，但在實(shí)際臨床診斷上，相較于老年群體，T-SPOT.TB用于中、青年疑似肺結(jié)核群體的診斷敏感度與準(zhǔn)確度更高，因此，對(duì)于老年疑似肺結(jié)核患者的T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果應(yīng)結(jié)合全方面檢測(cè)結(jié)果，謹(jǐn)慎解讀。