不同劑量礦質(zhì)肥對(duì)丘北辣椒根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

王燦，袁恩平，張雪廷，王紹祥，趙水靈，李云，李罡

（文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南 文山 663000）

辣椒（Capsicum annuumL.）作為中國普遍栽培的蔬菜，是西南邊陲農(nóng)民增收的經(jīng)濟(jì)作物之一。辣椒適應(yīng)性廣、產(chǎn)業(yè)鏈長，是日常生活中常見的蔬菜，不僅營養(yǎng)豐富而且具有較大商業(yè)開發(fā)潛力，栽培面積逐年上升。云南省作為辣椒種植大省，其中，文山州種植面積較大，占云南省辣椒種植面積的81.32%［1］，文山州特殊的地理氣候環(huán)境造就了豐富的辣椒資源，如丘北辣椒、小米辣、涮辣等。丘北辣椒有400多年的種植歷史，1983年12月被對(duì)外經(jīng)濟(jì)貿(mào)易部授予丘北辣椒金質(zhì)獎(jiǎng)?wù)拢?］，是文山州除三七、烤煙外大力推進(jìn)的產(chǎn)業(yè)，在增加農(nóng)民收入、促進(jìn)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整上起到了積極作用［3］。研究者常把研究聚焦于N、P、K肥施用比例對(duì)丘北辣椒生長發(fā)育的影響上，而忽略了微量礦質(zhì)元素如鈣、鎂、鐵等的作用。韓明珠等［4］通過試驗(yàn)得到丘北辣椒最佳施氮量為180 kg/hm2。湛方棟等［5］研究表明肥料中N∶P2O5∶K2O為12∶10∶14的處理增加的丘北辣椒土壤微生物數(shù)量最多。

本研究以云南省文山州地方特色品種丘北辣椒為研究對(duì)象，采用16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序，旨在從微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性角度探究礦質(zhì)肥在丘北辣椒苗期的應(yīng)用規(guī)律，為云南省文山州丘北辣椒根際生長微環(huán)境及微生物群落定殖調(diào)控機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品種辣椒為文干椒1號(hào)，由文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.1.2 供試材料礦質(zhì)肥料“礦物之星”由日本群馬長石公司提供，是一種天然礦物質(zhì)（石礦粉中提?。┖透乘釓?fù)合的制劑，其主要礦質(zhì)成分見表1。育苗基質(zhì)為商品育苗基質(zhì)，‘湘正農(nóng)科’牌商品育苗基質(zhì)由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湘暉農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所研制，主要成分為草炭土。

表1 礦質(zhì)肥料主要礦質(zhì)組成成分及pH

1.2 方法

1.2.1 盆栽試驗(yàn)及樣品采集試驗(yàn)地點(diǎn)為文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，時(shí)間為2020年12月至2021年5月。將發(fā)芽整齊一致的辣椒種子播種于苗盤（21孔）中進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。試驗(yàn)共5個(gè)處理，分別是CK處理（0 g/L）、處理A（15 g/L）、處理B（30 g/L）、處理C（45 g/L）、處理D（60 g/L）。每個(gè)處理3盤為1次生物學(xué)重復(fù)，并進(jìn)行常規(guī)育苗管理。苗齡為51 d時(shí)采用五點(diǎn)取樣法選取植株，將植株整株拔出抖落附著土壤基質(zhì)后，用單獨(dú)無菌刷刷取粘附在根表面的土壤基質(zhì)，并將各樣品混合后放入50 mL無菌離心管中，迅速置于干冰中保存運(yùn)輸，后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，隨后將抖落土壤基質(zhì)收集用于土壤養(yǎng)分檢測(cè)。

1.2.2 DNA濃度檢測(cè)使用Magen核酸提取試劑盒（MagPure Soil DNA KF Kit），Equalbit dsDNA HS Assay Kit檢測(cè)DNA濃度。以30～50 ng DNA為模板，采用GENEWIZ公司設(shè)計(jì)的PCR引物擴(kuò)增原核生物，16S rDNA上包括V3及V4的2個(gè)高度可變區(qū)，引物系列如下。F：5′-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVG AAT-3′和R：5′-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3′?？偡磻?yīng)體系為50 μL，5 μL Buffer，4 μL DNA模板，4 μL Mg2+，4 μL dNTP，上、下引物各1 μL，1 μLTaqDNA聚合酶，30 μL去離子水。細(xì)菌PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性7 min，95℃變性60 s，56℃退火60 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸15 min，4℃保存，通過Illumina MiSeq進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)質(zhì)控與分析原始數(shù)據(jù)整理采用DPS 7.05軟件。測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量優(yōu)化使用Cutadapt（v1.9.1）、Vsearch（1.9.6）、Qiime（1.9.1）軟件分析。測(cè)序數(shù)據(jù)優(yōu)化后質(zhì)量如表2所示。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理辣椒幼苗根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

5個(gè)樣本中共同含有的OTU為130個(gè)，除處理C含1個(gè)獨(dú)有OTU外，其余處理均無獨(dú)有OTU（圖1a）。在細(xì)菌門水平下，共有10個(gè)物種種類，變形菌門（Proteobacteria）為優(yōu)勢(shì)菌，其次是擬桿菌門（Bacteroidetes）。值得注意的是，在5個(gè)樣本處理中隨礦質(zhì)肥料劑量的增加，變形菌門數(shù)量占比呈下降趨勢(shì)，最高的是CK，達(dá)65.70%，最低的是處理D，為54.04%；而厚壁菌門（Firmicutes）數(shù)量則呈上升趨勢(shì)，最高的是處理D，達(dá)7.90%，最低的是處理A，為1.38%（圖1b）。在屬水平下（排名前十），CK中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）相對(duì)豐度最高，達(dá)16.01%。此外，處理C、處理D中f_Chitinophagaceae_Unclassified相對(duì)豐度分別是13.52%和10.07%，高于處理A（6.72%）、處理B（4.27%）及CK（6.13%）。芽孢桿菌屬（Bacillus）中處理C、處理D相對(duì)豐度分別是3.56%、7.38%，高于處理A（0.86%）、處理B（0.82%）及CK（1.69%）。但 在Pseudolabrys中 處 理A（4.85%）、處理B（4.61%）及CK（5.39%）高于處理C（3.73%）和處理D（3.08%）（圖1c）。圖1d顯示了基于Brary-Curtis距離矩陣聚類情況，其中處理A、處理B、CK聚為一類，處理C、處理D聚為一類。

圖1 不同處理細(xì)菌群落組成分析

2.2 不同處理辣椒幼苗根際細(xì)菌群落多樣性分析

α多樣性比較中，Ace和Chao1是反映菌群豐富度的指標(biāo)，數(shù)值越小表明豐富度越低。由表3可知，處理B、處理C、處理D的Ace和Chao1指數(shù)低于處理A和CK，說明處理B、處理C、處理D的豐度低于處理A和CK。這表明礦質(zhì)肥施入量的增加降低了根際細(xì)菌群落的物種豐度。Shannon、Simpson是反映菌群多樣性的指標(biāo)，其數(shù)值越小表明群落多樣性越低。處理A、處理B、處理C的Shannon和Simpson指數(shù)均高于處理D和CK，說明處理D和CK降低了其根際細(xì)菌的多樣性。

表3 不同處理細(xì)菌多樣性指數(shù)

基于Brary-Curtis距離矩陣進(jìn)行PCoA作圖，分析得知第一主坐標(biāo)對(duì)樣本差異的貢獻(xiàn)率為63.24%，第二主坐標(biāo)對(duì)樣本參與的貢獻(xiàn)率為15.09%（圖2）。圖中樣本點(diǎn)距離的遠(yuǎn)近代表了樣本中微生物群落的相似性，距離越近，相似度越高。如圖2所示，處理A與處理B較近，處理C與處理D較近，CK與其他處理較遠(yuǎn)。說明處理A、處理B的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相近，處理C、處理D的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相近。

圖2 不同處理細(xì)菌群落PCoA分析

2.3 不同處理細(xì)菌群落與土壤基質(zhì)環(huán)境關(guān)聯(lián)性分析

對(duì)各處理土壤樣本進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，N（氮）、P（磷）、K（鉀）、Na（鈉）、Mg（鎂）、pH、EC（電導(dǎo)率）等化學(xué)指標(biāo)隨添加劑量的增加呈上升趨勢(shì)（表4、表5）。如圖3a所示，在門水平下，變形菌門與N、Mg呈顯著負(fù)相關(guān)，與P、Na、B（硼）、Mn（錳）、EC呈極顯著負(fù)相關(guān)；厚壁菌門則與Mn、EC呈顯著正相關(guān)，與P、B呈極顯著正相關(guān)。如圖3b所示，在屬分類水平下，鞘氨醇單胞菌屬與Si（硅）呈顯著負(fù)相關(guān)；Unclassified_Unclassified與P、B呈顯著正相關(guān)；Pseudolabrys與P、K、C/N（碳氮比）、B、Ca（鈣）、Fe（鐵）、Mg、pH呈顯著負(fù)相關(guān)，與N、Na、Mn、EC呈極顯著負(fù)相關(guān)；Bacillus則與P、B呈顯著正相關(guān)。

圖3 不同處理細(xì)菌群落與土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性分析

表4 不同處理土壤基質(zhì)化學(xué)性質(zhì)

表5 不同處理土壤基質(zhì)微量元素

3 小結(jié)與討論

土壤微生物群落與土壤質(zhì)量息息相關(guān)，是維持土壤質(zhì)量的重要因素，微生物多樣性在一定程度上可以反映土壤的肥力水平和施肥效果［6］。前期研究表明當(dāng)土壤基質(zhì)中礦質(zhì)肥施用量為15～30 g/L時(shí)，育苗效果顯著高于0 g/L和45～60 g/L，可溶性糖、根系活力、土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶活性均高于其他處理［7-9］。進(jìn)一步對(duì)各處理根際微生物群落高通量測(cè)序分析，結(jié)果表明，在5個(gè)樣本處理中隨礦質(zhì)肥料劑量的增加，變形菌門占比呈下降趨勢(shì)，占比最高的是0 g/L處理，達(dá)65.70%，占比最低的是60 g/L處理，為54.04%；厚壁菌門占比則呈上升趨勢(shì)，最高的是60 g/L處理，達(dá)7.90%，占比最低的是15 g/L處理，為1.38%。說明高濃度處理降低了變形菌門的豐度而提高了厚壁菌門的豐度。這與孔帆［7］的研究結(jié)果一致，長期施用高濃度肥料提高了厚壁菌門的相對(duì)豐度。在屬水平中通過對(duì)排名前十的細(xì)菌屬聚類分析表明，濃度較低的CK、處理A、處理B（0～30 g/L）聚為一類，高濃度處理C、處理D（45～60 g/L）聚為一類。這表明添加劑量的大小對(duì)辣椒根際微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著的影響。在α多樣性分析中，處理B、處理C、處理D的Ace和Chao1指數(shù)低于處理A和CK，說明在高濃度處理下根際微生物群落豐度降低，在多樣性比較中處理D的Shannon和Simpson指數(shù)低于處理A、處理B、處理C，表明對(duì)丘北辣椒施用高濃度礦質(zhì)肥降低了微生物群落的多樣性。李春越等［10］研究表明長期施用單一化肥使土壤酸堿度發(fā)生改變，對(duì)微生物的生命活動(dòng)產(chǎn)生抑制作用。此外，郭振［11］研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌α多樣性和β多樣性均表明不同施肥措施使細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，長期施用有機(jī)肥處理的細(xì)菌群落多樣性較為接近，而不施肥處理和單施化肥處理的細(xì)菌群落則單獨(dú)成簇。

土壤中營養(yǎng)成分、物理性狀不同可能會(huì)導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)差異［12］，Edwards等［13］研究指出，在控制條件下水稻根際和根內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)受土壤類型和宿主植物基因型的共同調(diào)控。劉東海等［14］在小麥根際微生物真菌群落中研究發(fā)現(xiàn)施有機(jī)肥可提高微生物多樣性，其原因是有機(jī)肥改變了土壤理化性質(zhì)。Dombrowski等［15］研究多年生黃花亭薺在自然和控制條件下根際細(xì)菌群落組成的因素試驗(yàn)中，通過主坐標(biāo)典范分析和單因素方差分析指出，土壤性質(zhì)能夠解釋根內(nèi)細(xì)菌15%的群落變異性，而環(huán)境條件和植物基因型最多解釋了11%的群落變異性，且土壤類型對(duì)根內(nèi)細(xì)菌門分類水平上的影響更加顯著。陳梅春等［16］研究發(fā)現(xiàn)茉莉花植株內(nèi)生細(xì)菌群落受土壤全氮、全鉀、全磷和有機(jī)質(zhì)含量影響，變形菌門數(shù)量與全鉀含量呈負(fù)相關(guān)，與全磷、全氮和有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)；放線菌門、擬桿菌門數(shù)量與全鉀含量呈正相關(guān)，與全磷、全氮和有機(jī)質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)。本試驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上分析了微量元素對(duì)辣椒根際微生物群落的影響，在處理樣本中增加礦質(zhì)肥添加量，各處理土壤基質(zhì)中礦離子含量隨之增加，微生物群落與環(huán)境因子相關(guān)性分析中，門水平下，變形菌門與N、Mg呈顯著負(fù)相關(guān)，與P、Na、B、Mn、EC呈極顯著負(fù)相關(guān)。厚壁菌門與Mn、EC呈顯著正相關(guān)，與P、B呈極顯著正相關(guān)。屬分類水平下，鞘氨醇單胞菌屬與Si呈顯著負(fù)相關(guān)；Pseudolabrys與P、K、C/N、B、Ca、Fe、Mg、pH呈顯著負(fù)相關(guān)，與N、Na、Mn、EC呈極顯著負(fù)相關(guān)；芽孢桿菌則與P、B呈顯著正相關(guān)。其中芽孢桿菌是一種革蘭陽性桿菌。研究表明，芽孢桿菌具有較強(qiáng)的纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等多種活性，這些酶能夠抑制或破壞周圍其他菌群的生長［17］。在真菌性病害防治中，具有抗逆性強(qiáng)、抗菌廣譜性、殺菌高效、代謝產(chǎn)物豐富等特點(diǎn)［18］。此外，芽孢桿菌在反芻動(dòng)物胃腸道內(nèi)也具有調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群的功能［19］。這將為發(fā)掘利用對(duì)辣椒根際有益的微生物資源，控制潛在有害微生物，保持生態(tài)系統(tǒng)平衡，促進(jìn)辣椒優(yōu)質(zhì)栽培生長奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，向丘北辣椒苗期施用不同劑量礦質(zhì)肥可顯著改變根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為高濃度處理降低細(xì)菌豐度與多樣性。除N、P、K、pH、EC外，微量元素對(duì)丘北辣椒根際細(xì)菌同樣存在顯著的影響，這對(duì)丘北辣椒根際細(xì)菌群落調(diào)控和肥料施用具有一定的指導(dǎo)意義。