基于HPLC指紋圖譜技術的烤煙質(zhì)量分類研究

董世良，詹斯文，何結(jié)望，邱 彤，張雪瓊，劉峰峰

（1湖北中煙工業(yè)有限責任公司，武漢 430048；2武漢理工大學化學化工與生命科學學院，武漢 430070）

0 引言

煙草為茄科煙草屬植物的全草，作為一種農(nóng)作物，具有較高的經(jīng)濟價值。它化學成分復雜，目前檢測到的化學成分就有4000余種[1]，各化學成分的含量與多種因素有關，包括產(chǎn)地、氣候、加工工藝等。煙草化學成分是影響煙葉品質(zhì)的內(nèi)在因素[2]。如何通過可檢測的化學成分含量來全面整體地反映烤煙的質(zhì)量是目前研究的難點。目前，烤煙品質(zhì)大多是通過煙葉中的單項或常規(guī)化學成分含量來評判[3-5]，評價結(jié)果比較片面僅能起到煙葉評價的輔助作用。例如，鉀氯比僅能表明煙葉的燃燒性，施木克值僅能描述烤煙和香料煙的吃味品質(zhì)，糖酸比僅能反映烤煙的香氣風格和香氣品質(zhì)，氮堿比反映煙氣的濃度、吃味，糖堿比只能用來判斷煙氣的柔和性和香味[6-7]等。

指紋圖譜技術是從物質(zhì)所含有的特性成分出發(fā)，運用光譜、色譜、核磁、X射線、電化學、質(zhì)譜等現(xiàn)代分析技術，得到能夠表征藥材或中藥產(chǎn)品特性的譜圖[8]。在中藥評價中應用頗多[9-11]，在煙葉品質(zhì)鑒別中屬于比較新的一類技術。目前指紋圖譜技術在煙草行業(yè)的應用主要集中在煙用香精的質(zhì)量控制上，運用指紋圖譜技術對烤煙品質(zhì)進行評價的報道較少。

指紋圖譜的基本屬性是整體性和模糊性[12]。模糊性強調(diào)的是對照樣品與待測樣品指紋圖譜的相似性，而不是完全相同；整體性是強調(diào)完整地比較色譜的特征“面貌”，而不是將其“肢解”。烤煙煙葉的指紋圖譜將烤煙作為一個整體進行分析，對烤煙內(nèi)部的多種化學成分進行整體的把控，相比于傳統(tǒng)的評判烤煙質(zhì)量的方法，是通過多種成分對烤煙質(zhì)量進行評價，對比單項化學指標評價更具可靠性。

劉偉等[13]為優(yōu)化煙葉原料感官質(zhì)量的評價方法，運用系統(tǒng)聚類和Fisher線性判別法，建立基于化學成分的烤煙感官質(zhì)量特征分類評價方法，結(jié)果表明，聚類分析可將陜西中煙曲靖沾益基地縣煙葉的感官質(zhì)量特征合理分類。楊明峰等[14]根據(jù)烤煙外觀關鍵指標，采集了全國112個典型生態(tài)點初烤C3F煙葉樣品，運用快速聚類法(K-means cluster)分析了各煙草種植區(qū)烤煙外觀質(zhì)量區(qū)域特征及分布，結(jié)果表明5個煙草種植區(qū)中部烤煙外觀質(zhì)量均可分為3類。上述研究均需依靠主觀經(jīng)驗，首先將烤煙外觀、感官指標進行打分，樣品量大時耗費人力物力，且存在主觀偶然性。為解決此問題，本研究依托高效液相色譜法，結(jié)合主成分及聚類分析對烤煙質(zhì)量進行分類，擬解決當前烤煙質(zhì)量分類費時費力且主觀偶然性強的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙葉包含多個品種，14批煙葉分別為10批‘云煙87’、2批‘K326’、1批‘龍江911’、1批‘紅大’，等級為B2F下限，2019年及2020年分別取自全國多個省份14個不同的煙葉產(chǎn)區(qū)，包括湖北襄陽?？?、湖北恩施宣恩、湖北十堰房縣、湖北?？?、湖北咸豐、安徽皖南宣城、福建龍巖、湖南永州、黑龍江林口、河南駐馬店、云南馬龍、云南沾益、四川涼山會東、貴州威寧。所有煙樣在2019—2020年采樣收集后，經(jīng)湖北中煙工業(yè)有限公司統(tǒng)一復烤后制成烤煙。

1.2 指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的建立

1.2.1 供試品溶液的制備 煙葉粉碎成細粉，精密稱取0.1 g，置于50 mL錐形瓶中，精密加入20.0 mL 50%甲醇+水溶液，置于溫度25℃、頻率為40 MHz的超聲波儀器中超聲波振蕩器超聲提取20 min。取約2 mL萃取液經(jīng)0.45μm的水相濾膜過濾。

1.2.2 對照品溶液的制備 配制綠原酸、莨菪亭、蘆丁、山萘酚對照品的混合溶液。

1.2.3 液相條件 色譜柱為Agilent ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相 A 為水:甲醇:乙酸=88:10:2（體積比），流動相B為水:甲醇:乙酸=10:88:2（體積比）。梯度洗脫程序：0 min，A與B體積比為100:0，16.5 min體積比80:20，30 min體積比20:80，柱溫30℃，流速1 mL/min，進樣量10μL，檢測波長340 nm，參比波長480 nm。

測試完得到的液相指紋圖譜用2012版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版進行處理，峰匹配后生成對照圖譜，得到14批烤煙的高效液相指紋圖譜庫。

1.3 化學測定方法及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

煙堿、總氮、總糖、還原糖、鉀、氯等常規(guī)化學成分分別參考 YC/T 468—2013、YC/T 161—2002、YC/T 159—2002、YC/T 217—2007、YC/T 162—2002、YC/T216—2013測定。應用SPSS 26.0軟件進行主成分分析、簡單相關分析、復相關分析，用類平均法進行聚類分析。采用Excel 2003軟件進行做圖分析。用2012版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版對指紋圖譜進行相似度評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉指紋圖譜及其主成分分析

2.1.1 指紋圖譜共有模式的建立 選取不同產(chǎn)地的B2F下限煙葉樣品共14批，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A版），選擇樣品峰較為明顯、形狀較為規(guī)整的樣品圖譜作為參照圖譜，設定時間窗寬度為0.1 min，選用平均數(shù)法生成對照圖譜，多點校正后選取峰占比在0以上的峰進行匹配與識別，得到指紋圖譜共有模式圖譜，確定了16個共有峰。通過與混合對照品色譜圖（圖1）和液質(zhì)聯(lián)用圖譜對比，指認了其中4個色譜峰，分別為4號峰（17.94 min，綠原酸）、10號峰（26.42 min，東莨菪內(nèi)酯）、12號峰（35.60 min，蘆丁）、14號峰（38.45 min，山奈酚）。14批煙葉樣品的疊加指紋圖譜及對照指紋圖譜如圖2～3所示，其中R為峰匹配后建立的對照圖譜。

圖1 混合對照品溶液色譜圖

圖2 14批煙葉樣品的HPLC疊加指紋圖譜

圖3 煙葉樣品的HPLC對照指紋圖譜

由圖2可以看出，指紋圖譜中主要峰群的整體面貌基本一致，但其中不同成分量的相對值有所不同，表明煙葉樣品的質(zhì)量受多種化學成分含量的影響，烤煙質(zhì)量評價要結(jié)合多種化學成分含量綜合考慮。

2.1.2 相似度分析 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A版），以每批樣品生成的對照圖譜為對照，計算14批樣品的相似度。結(jié)果（表1）表明，14批樣品的相似度較高，樣品相似度計算結(jié)果都在0.950以上，說明各批煙葉單獨比對時不同煙葉產(chǎn)區(qū)樣品之間的多酚成分差異不大。

表1 14批烤煙樣品及對照圖譜的相似度評價結(jié)果

2.1.3 指紋圖譜主成分分析 主成分分析是最常用的多指標線性降維壓縮和多變量分析方法。它可將眾多具有一定相關性的原始變量，重新組合成為一組新的、相互無關的綜合指標來代替原有的變量，從而實現(xiàn)以最少的主成分盡可能多地體現(xiàn)原始變量的信息。

由表2可以看出，前5個主成分特征值均大于1，累計貢獻率為87.179%，可以表征原始因子代表的全部信息，故選取前5個主成分進行分析。

表2 煙葉指紋圖譜共有峰峰面積的主成分分析

根據(jù)主成分的因子載荷矩陣可以得到每個主成分的信息來源。由表3可以看出，第1主成分中的信息主要來自色譜峰3、4、6、9、10、14、15、16，第2主成分中的信息主要來自色譜峰1、5、11，第3主成分中的信息主要來自色譜峰8，第4主成分中的信息主要來自色譜峰7，第5主成分中的信息主要來自色譜峰12。

表3 前5個主成分的因子載荷矩陣

由于主成分載荷矩陣U和因子載荷矩陣A滿足式(1)的關系，故可得主成分的載荷矩陣。將主成分的載荷矩陣與標準化后的原始數(shù)據(jù)相結(jié)合，即可得到主成分的綜合評價得分，如表4所示。

表4 前5個主成分的主成分得分值

其中，λi為主成分的特征值。

從表4來看，在成分1中樣品13得分最高，表明其包含色譜峰3、4、6、9、10、14、15、16的信息最為豐富；成分2中樣品83得到最高，表明其包含色譜峰1、5、11的信息最為豐富；成分3中樣品56得分最高，表明其包含色譜峰8的信息最為豐富；成分4中樣品40得分最高，表明其包含色譜峰7的信息最為豐富；成分5中樣品58得分最高，表明其包含色譜峰12的信息最為豐富。

2.2 煙葉化學成分相關性分析

相關性分析是研究2個或2個以上處于同等地位的隨機變量間相關關系的統(tǒng)計分析方法。它是描述客觀事物之間相互關系的密切程度并用適當?shù)慕y(tǒng)計指標將其表示出來的過程。2個變量之間的相關程度通常用相關系數(shù)r來表示。相關系數(shù)r的取值在-1～1之間，它可以是此范圍內(nèi)的任何值。正相關時，r值在0～1之間，此時一個變量增加，另一個變量也增加；負相關時，r值在-1～0之間，此時一個變量增加，另一個變量將減少。r的絕對值越接近于1，2個變量間的關聯(lián)程度越強，r的值越接近于0，2個變量間的關聯(lián)程度越弱。在進行回歸分析時，經(jīng)常研究因變量與多個自變量之間的相關程度，此時可以使用復相關系數(shù)。

由于14批B2F下限等級的煙葉樣品中，湖北咸豐、貴州威寧2批煙葉樣品的常規(guī)化學成分含量數(shù)據(jù)暫未獲取，因此選用數(shù)據(jù)完整的12批煙葉樣品進行分析，不同產(chǎn)地煙葉樣品的常規(guī)化學成分數(shù)據(jù)如表5所示。將主成分得分值與煙葉化學成分做相關性分析，結(jié)果如表6所示。

表5 不同產(chǎn)地煙葉常規(guī)化學成分%

表6 主成分與化學成分相關性分析

由表6可知，鉀與第1主成分呈極顯著的正相關，與主成分值的復相關也達到了極顯著水平；總糖與第1主成分呈顯著的負相關。

2.3 應用指紋圖譜的聚類分析對煙葉品質(zhì)進行分類

聚類分析是指將不同的樣本分類到不同的類或簇的過程，其與分類的區(qū)別在于，聚類所要求劃分的類是未知的。一般來說，同一個類中的對象有很大的相似性，而不同類間的對象有很大的相異性。

根據(jù)主成分得分值對12批煙葉樣品進行聚類分析，得到的系統(tǒng)聚類系譜圖（圖4）。根據(jù)譜系圖可將等級為B2F下限的12批煙葉樣品大致分為3類。樣品產(chǎn)區(qū)湖北十堰房縣、四川涼山會東為第1類，樣品產(chǎn)區(qū)湖北恩施宣恩、云南馬龍、湖北?？?、黑龍江林口、河南駐馬店、云南沾益為第2類，樣品產(chǎn)區(qū)安徽皖南宣城、福建龍巖、湖南永州、湖北襄陽?？禐榈?類。

圖4 系統(tǒng)聚類譜系圖

對3類煙葉中各種化學成分的含量進行分析，分析結(jié)果如表7所示。

表7 不同類別煙葉化學成分含量范圍%

由之前相關分析的結(jié)果可知，鉀和主成分值之間極顯著相關，而由聚類結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，根據(jù)鉀的含量可以較好地區(qū)分第1類樣品與第2類樣品。對于氯的含量，第2類樣品中有一半達到了0.7以上，明顯高于第1、3類樣品。而對于其他4種化學成分，3類樣品間區(qū)分度較低。

3 結(jié)論與討論

比對烤煙的高效液相指紋圖譜特征峰，可以找到不同烤煙中化學成分的區(qū)別，結(jié)合主成分分析和化學成分相關性分析以及聚類分析結(jié)果可以初步判別不同產(chǎn)地烤煙的品質(zhì)。不同產(chǎn)區(qū)、品種、等級的煙葉，究其原因是煙葉中的多種化學成分組成或組成比例的不同，而指紋圖譜可以將烤煙看作一個整體對其中的化學成分進行整體的把控，從而降低從單項化學成分來評價烤煙質(zhì)量的不準確性。通過指紋圖譜對烤煙中多種化學成分的含量進行比較，可以找到不同產(chǎn)區(qū)煙葉的成分差異。但如果只通過指紋圖譜比較其中的多個色譜峰信息，從中找出區(qū)別并以此來區(qū)分產(chǎn)區(qū)的話，因變量太多以致推斷過程繁瑣難以實施。為此，筆者結(jié)合主成分分析法來選取能夠反映綜合信息的代表值，將眾多的峰信息轉(zhuǎn)換成較少的變量。相關性分析可以看出，前5個主成分與煙葉中鉀、總糖達到了顯著或極顯著的相關性，可見指紋圖譜主成分分析可以用來對煙葉進行質(zhì)量控制，并以此建立烤煙品質(zhì)評價的標準，這將極大減輕品吸師的工作量。不同產(chǎn)區(qū)之間的聚類結(jié)果表明，鉀含量與氯含量等煙葉中化學品質(zhì)成分指標在同一類別中結(jié)果相近，所以基于HPLC指紋圖譜進行的聚類分析基本可以區(qū)分不同產(chǎn)區(qū)的烤煙，從而給煙葉的種植培養(yǎng)和加工提供理論依據(jù)。

在煙草行業(yè)中，將指紋圖譜與主成分分析、聚類分析結(jié)合起來應用的例子也有一些報道。唐徐紅[15]采用指紋圖譜結(jié)合主成分分析、聚類分析等方法對云南省15個典型煙葉產(chǎn)區(qū)C3F等級的煙葉進行了質(zhì)量分類。結(jié)果表明，2010年收獲的云南省典型煙葉產(chǎn)區(qū)的煙葉質(zhì)量可分成4個基本類型，區(qū)分結(jié)果較好。向剛[16]利用超聲萃取-超高效液相色譜法對30個煙草樣品（4個品種）的多酚類物質(zhì)進行了快速分離與檢測，建立了不同種類煙草中多酚類物質(zhì)的UPLC指紋圖譜，并對煙草樣品進行了聚類分析。結(jié)果表明，這種基于煙草多酚指紋圖譜的分析策略是一種可同時實現(xiàn)整體性、模糊性分析且簡便易行的方法模式，為煙草識別及煙草制品的質(zhì)量控制提供了部分科學依據(jù)。楊軍[17]建立了1115煙用香精香料的氣相色譜指紋圖譜，并分析了9個不同批次的1115煙用香精香料樣品，結(jié)合系統(tǒng)聚類分析法區(qū)分了不同批次的樣品指紋圖譜，并進一步通過摻兌試驗驗證了方法用于煙用香精質(zhì)量控制的可行性。這些研究都證明了指紋圖譜技術用于煙葉和煙用香精的質(zhì)量評價與分類是完全可行的。

近年來，各種分析技術越來越完善，分析儀器的準確度和精確度也越來越高。與其他的煙草品質(zhì)和種類鑒別方法相比，指紋圖譜技術具有多成分控制、準確以及快速的優(yōu)點。當前指紋圖譜技術在煙草鑒定應用中主要是用來鑒別煙用香精的種類[18-19]，在烤煙產(chǎn)地鑒別中也有一些應用[20-21]，但在煙草其他方面應用較少，指紋圖譜在煙草行業(yè)中還存在著巨大的應用潛力。但圖譜建立過程較為繁瑣，并且需要的樣品數(shù)較大；指紋圖譜包含的潛在信息量非常大，包含有雜質(zhì)或與指紋圖譜研究無關的信息，因此結(jié)合統(tǒng)計分析方法對信息進行整理，在保留原始特征信息的同時根據(jù)實際情況進行優(yōu)化是非常有必要的。

本研究因不同產(chǎn)地同一等級樣本量相對較少，指紋圖譜評估結(jié)果可能存在偶然性，日后可提高樣本量或進行平行試驗減小偶然性誤差。今后的研究可基于指紋圖譜發(fā)展思路，將其他現(xiàn)代化分析技術，如液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術、光譜學等技術手段應用到烤煙質(zhì)量分類研究中，實現(xiàn)烤煙的快速質(zhì)量分類鑒別。

人們逐漸意識到指紋圖譜技術在煙草品質(zhì)評價中的便捷性，針對煙草指紋圖譜的研究也發(fā)展迅速，指紋圖譜技術將會在煙草品質(zhì)鑒別中起到主導作用?？梢酝ㄟ^指紋圖譜發(fā)現(xiàn)市面上的偽劣產(chǎn)品，這能有效地遏制煙草市場混雜的局面。此外，還能通過指紋圖譜對煙草進行產(chǎn)地識別，對品質(zhì)較好的煙草的生長環(huán)境進行研究，對其所需的土壤條件、水分、光照、生長周期及加工工藝進行考察，篩選出煙草比較合適的生長環(huán)境和氣候，助力煙草病蟲害的防控以及煙草品質(zhì)的控制，以促進煙草產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化進程。