不同氮源供體對(duì)湛江等鞭金藻生長和生理特性的影響

呂 布，梁 晶，廖曉言，臧 戰(zhàn)，VASQUEZ Hebert Ely，王愛民，鄭 興，顧志峰

（海南大學(xué)海洋學(xué)院/南海海洋資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 570228）

湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)是一種海洋金黃色鞭毛微藻，被應(yīng)用于不同的飼料工業(yè)和海水養(yǎng)殖系統(tǒng)，在室內(nèi)和室外均被廣泛養(yǎng)殖，具有大規(guī)模培養(yǎng)和應(yīng)用潛力[1-3]。

營養(yǎng)鹽是湛江等鞭金藻生長中不可或缺的要素之一。目前，湛江等鞭金藻大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，常用氮源為硝酸鈉，在微藻培養(yǎng)中起到重要作用[4]，然而硝酸鈉作為一種強(qiáng)氧化劑、危險(xiǎn)品，不易購買且成本較高，因此需要考慮采用一種低成本、易獲得的營養(yǎng)鹽進(jìn)行生產(chǎn)[5]。海水中痕量金屬元素、有機(jī)碳化合物對(duì)湛江等鞭金藻的影響早在21 世紀(jì)初就有報(bào)道[1]，但過量的Cu 離子容易對(duì)湛江等鞭金藻產(chǎn)生致毒效應(yīng)[6]，同時(shí)生產(chǎn)中湛江等鞭金藻利用葡萄糖和乙酸鈉進(jìn)行兼養(yǎng)生長的能力也是有限的?？傮w上看，很多研究關(guān)注氮源、培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)條件優(yōu)化對(duì)湛江等鞭金藻的影響，但是大多研究NaNO3作為氮源供體對(duì)湛江等鞭金藻的影響[3,7-8]，而其它適宜氮源作為氮源供體培養(yǎng)湛江等鞭金藻的研究相對(duì)較少，尤其鮮見利用低成本氮源培養(yǎng)湛江等鞭金藻的研究報(bào)道。

減輕營養(yǎng)成本的一種替代方法是使用基于工業(yè)級(jí)的非常規(guī)培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中摻入工業(yè)級(jí)化肥或工業(yè)級(jí)化學(xué)品[9-11]，本研究以湛江等鞭金藻為研究對(duì)象，在純營養(yǎng)液中使用這種類似方法，用廉價(jià)的商業(yè)肥料代替純營養(yǎng)液和昂貴的營養(yǎng)液，通過對(duì)比多種商業(yè)氮肥對(duì)湛江等鞭金藻生長及生理特性的影響，探索一種相對(duì)低成本、高效的氮源，為實(shí)現(xiàn)湛江等鞭金藻低成本、高效、規(guī)?；囵B(yǎng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

所用湛江等鞭金藻來源海南大學(xué)海洋學(xué)院微藻保種室。實(shí)驗(yàn)前將藻種進(jìn)行純化擴(kuò)培，取快速生長期的藻液開展室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。湛江等鞭金藻采用的培養(yǎng)基配方如下：氮源供體為（NaNO3100 mg、NH2CONH235.33 mg、化肥尿素76.14 mg、NH4Cl 62.94 mg、CH3COONH490.95 mg、胰蛋白胨63.54 mg）、NaH2PO410 mg、FeSO42.5 mg、MnSO40.25 mg、EDTA-2Na 10 mg、VB16×10-3mg、VB120.5×10-6mg、過濾海水1 L。

上述配方所用培養(yǎng)液以“寧波3#微藻培養(yǎng)液”為基礎(chǔ)，將100 mg NaNO3為氮源，作為NaNO3配方(實(shí)驗(yàn)A)。由于100 mg的NaNO3中含氮約16.47 mg，折算成NH2CONH2約為35.33 mg，折算成化肥尿素（復(fù)合肥，總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥46.4%）約為76.14 mg，折算成NH4Cl為62.94 mg，折算成CH3COONH4為90.95 mg，折算成胰蛋白胨為63.54 mg（用氮的相對(duì)原子質(zhì)量與其分子的相對(duì)分子質(zhì)量之比進(jìn)行換算）。以35.33 mg 的NH2CONH2為氮源，作為NH2CONH2配方(實(shí)驗(yàn)B)；以76.14 mg 化肥尿素為氮源，作為化肥尿素配方(實(shí)驗(yàn)C)；以62.94 mg 的NH4Cl 為氮源，作為NH4Cl 配方(實(shí)驗(yàn)D)；以90.95 mg 的CH3COONH4為氮源，作為CH3COONH4配方(實(shí)驗(yàn)E)；以63.54 mg胰蛋白胨為氮源，作為胰蛋白胨配方(實(shí)驗(yàn)F)。

實(shí)驗(yàn)所用水體為經(jīng)過沙井過濾、沉淀，漂白水消毒，高壓滅菌鍋滅菌后的自然海水（鹽度32）。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 藻種的純化培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)前將藻種進(jìn)行純化擴(kuò)培，取快速生長期的藻液開展培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，將處于指數(shù)生長期的湛江等鞭金藻用培養(yǎng)基調(diào)整到相同數(shù)量級(jí)(104mL-1)，經(jīng)離心(3 500 r/min，10 min)后接種。

1.2.2 不同低成本氮源培養(yǎng)基對(duì)藻的生產(chǎn)效果影響

研究NaNO3(100 mg·L-1)、CH3COONH4(90.95 mg·L-1)、胰蛋白胨(63.54 mg·L-1)、NH4Cl(62.94 mg·L-1)、尿素(35.33 mg·L-1)和化肥尿素(76.14 mg·L-1)這6 種氮源組成的培養(yǎng)基對(duì)藻類生長和水體中養(yǎng)分吸收的影響。在“寧波3#微藻培養(yǎng)液”的基礎(chǔ)上，采用不同含氮化學(xué)物質(zhì)替代昂貴的實(shí)驗(yàn)室分析純化學(xué)物質(zhì)，以補(bǔ)充湛江等鞭金藻生長所需主要營養(yǎng)物質(zhì)。包括對(duì)照組在內(nèi)的所有處理共設(shè)3 個(gè)平行，研究周期持續(xù)21 d。

湛江等鞭金藻在經(jīng)過高壓滅菌鍋滅菌后的自然海水中光自養(yǎng)培養(yǎng)，在LED照明的5 000 mL錐形瓶中進(jìn)行，用LED 燈從培養(yǎng)液的一側(cè)照射，平均溫度為（25±1）℃，照度為5 500 lx，光暗周期為12 h/12 h，用空氣過濾頭過濾空氣，連續(xù)充氣通入培養(yǎng)液。

實(shí)驗(yàn)組別接入藻種混勻后，每24 h，于上午進(jìn)行取樣，進(jìn)行藻類細(xì)胞數(shù)目、干質(zhì)量、色素含量、總蛋白含量及可溶性糖含量指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 藻細(xì)胞數(shù)目測(cè)定 采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法進(jìn)行測(cè)定[12]。

1.3.2 藻細(xì)胞干質(zhì)量的測(cè)定 預(yù)先稱質(zhì)量，烘干Whatman GF/C 過濾膜，將一定體積的藻液在該膜上過濾，經(jīng)過沖洗除營養(yǎng)鹽后，放到105 ℃烘箱中烘干72 h 以上后稱質(zhì)量，直至前后兩次質(zhì)量差不超過2 mg，然后計(jì)算兩者的差值代表干質(zhì)量[13-14]。

1.3.3 胞內(nèi)生物質(zhì)測(cè)定 1)葉綠素質(zhì)量濃度：利用丙酮萃取法提取微藻體內(nèi)葉綠素，取待測(cè)藻液樣品20 mL，通過抽濾于Whatman GF/C 膜上，隨后用鑷子將Whatman GF/C 膜取下置于50 mL 離心管底部，加入10 mL 體積分?jǐn)?shù)90%丙酮溶液，立即放入4 ℃冰箱中避光保存24 h 以上（1～3 d 均可），黑暗低溫條件下進(jìn)行萃取。萃取后在4 ℃、4 000 r/min 條件下離心10 min，將離心后的提取液上清液小心注入1 cm 比色皿，以體積分?jǐn)?shù)90%丙酮溶液作參比，分光光度計(jì)（島津UV-1700）分別測(cè)定在波長630、647、664 nm處溶液的光密度值（D630、D647、D664）并記錄,減去波長750 nm 下測(cè)得的光密度值，得到校正后的D664、D647、D630值。按照以下方程式計(jì)算葉綠素a（ρchla）、葉綠素b（ρchlb）和總?cè)~綠素（ρtchl）的質(zhì)量濃度[15-16]。

式中，ρchla、ρchlb、ρtchl表示葉綠素a、b 和總?cè)~綠素的質(zhì)量濃度，mg·L-1；V表示實(shí)驗(yàn)用藻液體積，mL。

2)總蛋白質(zhì)含量：稱質(zhì)量0.1～0.3 g待測(cè)樣品放到錫紙中，將樣品依次放入對(duì)應(yīng)位置中。開始測(cè)定，設(shè)定燃燒反應(yīng)爐(960 ℃)、通氧量為170 mL/min，充分燃燒300 s，當(dāng)氧剩余量為12%時(shí)停止燃燒。燃燒反應(yīng)爐中的試劑依次為280 g氧化銅，13 g銀絲，15 g鉑。燃燒爐中的產(chǎn)物進(jìn)入TC檢測(cè)器檢測(cè)[17]，以上各項(xiàng)參數(shù)檢測(cè)參考《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》（GB5009.5-2016）。

3)可溶性糖含量：稱取0.1 g 被測(cè)樣品，按m糖∶m水=1∶10 加入蒸餾水，沸水浴60 min 后，取出離心管，放入30 mg 活性炭，混勻，靜置30 min，過濾，加3 mL 無水乙醇，用蒸餾水定容至15 mL。取提取液1 mL 于刻度離心管內(nèi)，加5 mL 蒽酮試劑，擰好蓋子，沸水浴10 min 之后將離心管用自來水沖洗至室溫，20 min 后在630 nm 處測(cè)光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出可溶性糖含量[18]。

1.3.4 水質(zhì)測(cè)量方法 測(cè)量的水質(zhì)指標(biāo)：總氮，檢測(cè)方法是鎘柱還原法；總磷，檢測(cè)方法是正磷酸鹽用抗壞血酸還原磷鉬藍(lán)法來測(cè)定（HJ 671-2013）。以上各項(xiàng)參數(shù)檢測(cè)主要參照《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》（GB/T 12763-2007）和《海洋監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)》（GB17378-2007）中水樣保存方法，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)間隔一定時(shí)間取樣[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

（1）數(shù)據(jù)換算處理：生產(chǎn)力PI和比生長速率(μ)通過下述公式進(jìn)行計(jì)算[5]：

式中：PI，生產(chǎn)力，g·(L·t)-1；ρi，初始生物量質(zhì)量濃度，g·L-1；ρm，最大生物量質(zhì)量濃度，g·L-1；Tc，與最大生物量質(zhì)量濃度有關(guān)的培養(yǎng)時(shí)間(d)。

（2）統(tǒng)計(jì)分析：實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示。采用GraphPad Prism 9 和DPS 14.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析法進(jìn)行差異性顯著分析，當(dāng)P ＜0.05 時(shí)差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同氮源對(duì)湛江等鞭金藻生產(chǎn)力和比生長速率的影響

氮源為化肥尿素培養(yǎng)下的湛江等鞭金藻生產(chǎn)力和比生長速率顯著優(yōu)于硝酸鈉（P ＜0.05，表1）?；誓蛩氐纳a(chǎn)力和比生長速率最高，分別為（0.160 7±0.003 7）g·(L·d)-1、（0.439 8±0.002 3）d-1，硝酸鈉分別為（0.102 1±0.000 2）g·(L·d)-1、（0.367 8±0.000 1）d-1。而氯化銨相對(duì)最低，分別為(0.048 0±0.002 7)g·(L·d)-1、(0.282 8±0.004 7)d-1。綜合以上，從生產(chǎn)力上看，湛江等鞭金藻不同氮源對(duì)生產(chǎn)力的影響從大到小依次是化肥尿素＞硝酸鈉＞乙酸銨＞尿素＞胰蛋白胨＞氯化銨；從比生長速率上看，湛江等鞭金藻不同氮源對(duì)比生長速率影響從大到小依次是化肥尿素＞乙酸銨＞硝酸鈉＞胰蛋白胨＞尿素＞氯化銨。

表1 不同氮源培養(yǎng)下湛江等鞭金藻生產(chǎn)力和比生長速率的差異Table 1 Difference of productivity and specific growth rate of I.zhanjiangensis under different nitrogen sources

2.2 不同氮源對(duì)湛江等鞭金藻生長的影響

湛江等鞭金藻不同氮源培養(yǎng)對(duì)生長整體呈先緩慢增長后快速增長，隨后呈穩(wěn)定狀態(tài)，最后開始降低的趨勢(shì)，且氮源為化肥尿素培養(yǎng)下趨勢(shì)變化最為明顯（圖1）。氮源為化肥尿素培養(yǎng)的湛江等鞭金藻在7 d時(shí)開始進(jìn)入快速生長期（4.90±1.15）×106mL-1，并在19 d 時(shí)細(xì)胞密度達(dá)峰值（2.02±0.10）×107mL-1且開始進(jìn)入平穩(wěn)期。氮源為硝酸鈉培養(yǎng)的湛江等鞭金藻在7 d 時(shí)開始進(jìn)入快速生長期（5.95±0.51）×106mL-1，并在13 d時(shí)細(xì)胞密度達(dá)峰值（1.42±0.07）×107mL-1且開始進(jìn)入平穩(wěn)期。氮源為胰蛋白胨培養(yǎng)下快速生長時(shí)間相對(duì)較短，在6 d 時(shí)達(dá)到峰值（6.29±1.07）×106mL-1，但顯著低于氮源為化肥尿素培養(yǎng)下的峰值（P ＜0.05）。綜合以上，從生長上看，湛江等鞭金藻不同氮源培養(yǎng)下的最高藻密度從大到小依次是化肥尿素＞硝酸鈉＞乙酸銨＞尿素＞氯化銨＞胰蛋白胨。

圖1 6種不同氮源對(duì)湛江等鞭金藻生長密度的影響Fig.1 Effects of six different nitrogen sources on the growth density of I.zhanjiangensis

2.3 不同氮源對(duì)湛江等鞭金藻色素含量的影響

湛江等鞭金藻不同氮源培養(yǎng)下的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素質(zhì)量濃度整體都呈先緩慢增長后快速增長，隨后呈穩(wěn)定狀態(tài)，最后開始降低的趨勢(shì)，且氮源為化肥尿素培養(yǎng)的趨勢(shì)變化最為明顯（圖2）。氮源為化肥尿素培養(yǎng)下葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素質(zhì)量濃度分別在11、11、13 d時(shí)開始進(jìn)入快速增長期（0.53、0.19、0.82 mg·L-1），并在21 d 時(shí)葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素質(zhì)量濃度分別達(dá)峰值（1.02、0.67、2.21 mg·L-1）且開始進(jìn)入平穩(wěn)期；氮源為硝酸鈉培養(yǎng)的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素增長趨勢(shì)相對(duì)平緩，且葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素質(zhì)量濃度的峰值顯著低于化肥尿素（P ＜0.05）。氮源為胰蛋白胨在培養(yǎng)5、4、5 d時(shí)葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素質(zhì)量濃度分別達(dá)峰值0.36、0.24、0.81 mg·L-1。綜合以上，從葉綠素質(zhì)量濃度上看，湛江等鞭金藻不同氮源培養(yǎng)下的最高葉綠素a質(zhì)量濃度從大到小依次是化肥尿素＞尿素＞乙酸銨＞硝酸鈉＞氯化銨＞胰蛋白胨；湛江等鞭金藻不同氮源培養(yǎng)下的最高葉綠素b質(zhì)量濃度從大到小依次是化肥尿素＞硝酸鈉＞胰蛋白胨＞乙酸銨＞尿素＞氯化銨；湛江等鞭金藻不同氮源培養(yǎng)下的最高總?cè)~綠素質(zhì)量濃度從大到小依次是化肥尿素＞硝酸鈉＞尿素＞乙酸銨＞胰蛋白胨＞氯化銨。

圖2 6 種不同氮源對(duì)湛江等鞭金藻葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effects of six different nitrogen sources on chlorophyll a,chlorophyll b and total chlorophyll concentration of I.zhanjiangensis

2.4 不同氮源培養(yǎng)水體中湛江等鞭金藻對(duì)水質(zhì)中氮磷的吸收差異

湛江等鞭金藻不同氮源培養(yǎng)水體中對(duì)水質(zhì)中的TN 和TP 整體吸收都呈先快速上升后緩慢上升，隨后呈穩(wěn)定狀態(tài)的趨勢(shì)，且氮源為胰蛋白胨培養(yǎng)的TN和氮源為化肥尿素培養(yǎng)的TP趨勢(shì)變化最為明顯（圖3）。以硝酸鈉、尿素、化肥尿素、氯化銨、乙酸銨和胰蛋白胨為氮源培養(yǎng)8 d 時(shí)，TN 吸收率分別為97.1%、48.5%、69.6%、53.2、76.6%和98.2%；TP 吸收率分別為72.6%、97.9%、95.8%、68.4%、68.8% 和91.7%，培養(yǎng)21 d 時(shí)，TN 吸收率分別 為99.4%、99.4%、94.2%、88.3%、98.2%和99.9%；TP 吸收率分別為91.6%、99.9%、99.0%、98.9%、95.8%和96.9%。綜合以上，從TN 吸收率上看，湛江等鞭金藻不同氮源培養(yǎng)水體中對(duì)水質(zhì)中TN 的最大吸收率從大到小依次是胰蛋白胨＞硝酸鈉=尿素＞乙酸銨＞化肥尿素＞氯化銨；湛江等鞭金藻不同氮源培養(yǎng)水體中對(duì)水質(zhì)中TP 最大吸收率從大到小依次是尿素＞化肥尿素＞氯化銨＞胰蛋白胨＞乙酸銨＞硝酸鈉。

圖3 6種不同氮源對(duì)湛江等鞭金藻總氮、總磷的影響Fig.3 Effects of six different nitrogen sources on TN、TP of I.zhanjiangensis

2.5 不同氮源對(duì)湛江等鞭金藻有機(jī)物含量影響

氮源為化肥尿素培養(yǎng)下的湛江等鞭金藻有機(jī)物質(zhì)量濃度最佳，其次為氮源為硝酸鈉的培養(yǎng)基，氮源為胰蛋白胨的培養(yǎng)基的有機(jī)物含量最低，且有機(jī)物含量之間存在顯著性差異（表2，P ＜0.05）。氮源為化肥尿素的有機(jī)物質(zhì)量濃度最高，最大生物量干質(zhì)量、最高總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和最大可溶性糖質(zhì)量濃度分別可達(dá)（1.626 9±0.036 8）g·L-1、（1 037.752 7±14.030 9）mg·L-1、（39.559 9±0.323 5）mg·L-1，顯著高于氮源為硝酸鈉的培養(yǎng)基[（1.143 5±0.001 7）g·L-1、（733.118 3±6.284 6）mg·L-1、（28.010 1±0.222 3）mg·L-1]，和氮源為胰蛋白胨的培養(yǎng)基[（0.507 5±0.057 1）g·L-1、（326.366 2±7.112 1）mg·L-1、（12.478 9±0.273 4）mg·L-1）]（P ＜0.05）。綜合以上，從不同氮源生物量干質(zhì)量上看，湛江等鞭金藻不同氮源培養(yǎng)下的最大生物量干質(zhì)量從大到小依次是化肥尿素＞硝酸鈉＞乙酸銨＞尿素＞氯化銨＞胰蛋白胨；湛江等鞭金藻不同氮源培養(yǎng)下的最高總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度從大到小依次是化肥尿素＞硝酸鈉＞乙酸銨＞尿素＞氯化銨＞胰蛋白胨；湛江等鞭金藻不同氮源培養(yǎng)下的最大可溶性糖質(zhì)量濃度從大到小依次是化肥尿素＞硝酸鈉＞乙酸銨＞尿素＞氯化銨＞胰蛋白胨。

表2 不同氮源培養(yǎng)下湛江等鞭金藻有機(jī)物含量之間的差異Table 2 Differences of organic matter contents of I.zhanjiangensis under different nitrogen sources

3 討論

3.1 湛江等鞭金藻6種不同氮源培養(yǎng)基的比較

氮是微藻生長的基本元素之一，在蛋白質(zhì)、嘧啶、葉綠素的合成以及脂類化合物的儲(chǔ)存中起關(guān)鍵作用，微藻生長、發(fā)育、繁殖過程中可以利用的氮源包括氨氮、硝態(tài)氮和尿素等，每一種微藻對(duì)不同氮源的利用效率也有差異[20]。本實(shí)驗(yàn)中，湛江等鞭金藻利用化肥尿素作為氮源時(shí)表現(xiàn)出最高的生產(chǎn)力和比生長速率，這與詹靜婷等[21]使用的NH2CONH2相比，要高于其比生長速率（0.222 d-1），而與該實(shí)驗(yàn)中使用NH2CONH2的比生長速率相比，二者較為接近，但因?yàn)槎呤褂玫腘H2CONH2濃度不同，因此結(jié)果會(huì)有所不同。NH2CONH2在相應(yīng)的酶的作用下，會(huì)水解生成氨和二氧化碳，為湛江等鞭金藻提供氮源和光合作用所必需的二氧化碳，且其所溶解的水溶液呈中性反應(yīng)，故不會(huì)改變?nèi)芤旱膒H 值。湛江等鞭金藻能夠很好利用尿素作為氮源，推測(cè)該藻細(xì)胞中可能含有相應(yīng)的尿素酶，使得藻細(xì)胞在此條件下可以獲得較大生長速率和生物量[22]，李朝霞等[23]采用NH2CONH2作為氮源對(duì)等鞭金藻的培養(yǎng)結(jié)果表明，球等鞭金藻3011 可以很好利用NH2CONH2作為氮源，丁彥聰?shù)萚24]研究也證明，微藻能利用多種氮源，以NH2CONH2作為氮源，小球藻生長速度快，脂肪酸和總脂的含量也明顯增加，本研究與他們的研究結(jié)果一致，這也說明湛江等鞭金藻具有利用尿素的潛力。且化肥尿素作為氮源，湛江等鞭金藻的生產(chǎn)力也顯著高于其它培養(yǎng)基，我們認(rèn)為可能是對(duì)于NH2CONH2，其成分單一，也就是說能夠?yàn)槲⒃逅峁┑囊仓皇堑?，而?fù)合肥可以提供兩種或兩種以上的營養(yǎng)元素，里面包含更多的藻類生長因子，可以補(bǔ)充微藻所需的多種營養(yǎng)元素，均衡微藻生長所需的營養(yǎng)，非常適合藻類生長，因此，藻密度可達(dá)最高，但其分解需要更多時(shí)間。本研究發(fā)現(xiàn)，在8 d 時(shí)，對(duì)化肥尿素中TN 的吸收率要顯著低于硝酸鈉、乙酸銨和胰蛋白胨，但相對(duì)于NH2CONH2是有所提高的（圖3，P ＜0.05），在堿性環(huán)境中，可以方便NH2CONH2分解，它可能會(huì)比其他不同的氮源獲得更高的比生長速率[25]。而氮源為胰蛋白胨時(shí)，湛江等鞭金藻的比生長率為0.36 d-1，略高于劉東超等[26]實(shí)驗(yàn)中最佳NaNO3濃度的生長率（0.34 d-1）。本研究也發(fā)現(xiàn)，使用胰蛋白胨作為氮源，可以在短時(shí)間內(nèi)迅速達(dá)到最高藻密度，其TN 吸收率在8 d 時(shí)可以達(dá)到最高（圖3），本研究認(rèn)為由于胰蛋白胨屬于蛋白質(zhì)氮源，微生物在有機(jī)氮源培養(yǎng)基中，可以直接利用游離氨基酸，合成用于構(gòu)成細(xì)胞的蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞物質(zhì)，微生物對(duì)氨基酸的利用是有選擇性的，它可能更符合藻類細(xì)胞的吸收轉(zhuǎn)換、藻細(xì)胞生長更快，可以大大縮短生長周期[24]，但使用胰蛋白胨，氮源成本增加36.07 %，短期需要可以使用，但不適合長期使用，也可以與其他氮源混合，可能會(huì)達(dá)到更好效果。該研究表明，優(yōu)化的化肥尿素培養(yǎng)基配方是培養(yǎng)湛江等鞭金藻最優(yōu)質(zhì)的培養(yǎng)基，顯著優(yōu)于硝酸鈉、NH2CONH2以及其他氮源培養(yǎng)基。

3.2 湛江等鞭金藻對(duì)色素含量及有機(jī)物含量的影響分析

微藻種類不同，對(duì)營養(yǎng)要求也是有差別的，每一種藻類都有適合各自生長繁殖的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中營養(yǎng)鹽的種類影響著微藻的生長率、細(xì)胞的成分、葉綠素以及最后產(chǎn)量[26-27]。因此，選擇培養(yǎng)基時(shí)，滿足微藻生長所需的適宜營養(yǎng)成分和數(shù)量比例，是獲得最佳培養(yǎng)效果的前提條件。本研究發(fā)現(xiàn)，使用化肥尿素為氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)金藻時(shí)更利于其葉綠素及胞內(nèi)有機(jī)物的積累。且在相似鹽度下，本研究中使用化肥尿素為氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)的葉綠素質(zhì)量濃度和藺紅蘋等[3]研究中的葉綠素質(zhì)量濃度相差不大。此外，本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)不同氮源培養(yǎng)基配方培養(yǎng)的湛江等鞭金藻有機(jī)物的質(zhì)量濃度并不一致，化肥尿素氮源培養(yǎng)基中湛江等鞭金藻總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和可溶性糖質(zhì)量濃度顯著高于其他5 種氮源培養(yǎng)基配方，與黃振華等[1]使用的250 mL 錐形瓶培養(yǎng)的湛江等鞭金藻的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度相比，該研究使用的化肥尿素培養(yǎng)基配方要高于其研究中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，是具有優(yōu)勢(shì)的。

3.3 湛江等鞭金藻低成本氮源培養(yǎng)基配方的開發(fā)與利用

有研究表明，在培養(yǎng)基中用適當(dāng)?shù)霓r(nóng)業(yè)肥料代替無機(jī)鹽對(duì)某些藻類進(jìn)行培養(yǎng)，不僅其效果與無機(jī)鹽作用相似，而且大大節(jié)約了生產(chǎn)成本[28]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不影響藻類生長和產(chǎn)量的前提下，以廉價(jià)、易得的工業(yè)級(jí)化學(xué)品替代分析純化學(xué)品的主要化學(xué)成分，成功配制出一種可替代的低成本養(yǎng)殖培養(yǎng)基。在實(shí)驗(yàn)C中采用工業(yè)級(jí)化肥尿素替代商業(yè)化分析純氮源，其理化性質(zhì)和養(yǎng)分含量與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中沒有太大差異。此外，與標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基相比，改良的氮培養(yǎng)基在光密度、生物量干質(zhì)量、葉綠素a質(zhì)量濃度、葉綠素b 質(zhì)量濃度、總?cè)~綠素質(zhì)量濃度、總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度等方面均有顯著提高(P ＜0.05)。根據(jù)成本計(jì)算，可以發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于硝酸鈉，利用在當(dāng)?shù)厝菀撰@得的廉價(jià)的氮源生長介質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)，可顯著降低生產(chǎn)成本，這可能是因?yàn)榻^大多數(shù)藻利用硝酸鹽，其藻細(xì)胞蛋白質(zhì)中的氮呈還原態(tài)，必須通過異養(yǎng)菌將硝酸鹽中氮的高氧化態(tài)還原成亞硝酸鹽，再還原成氨才能被單胞藻所利用，因此在藻類代謝硝酸鹽中，必須經(jīng)歷一個(gè)還原過程，這要消耗呼吸作用分解有機(jī)物產(chǎn)生的能量，因而藻類在利用硝酸鹽時(shí)，相對(duì)來說是不經(jīng)濟(jì)的[23]。本研究突出了新型改良培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)，它不僅是一種高產(chǎn)投入物，而且也是一種低成本替代物，可在實(shí)際環(huán)境下用于湛江等鞭金藻的大規(guī)模物質(zhì)生產(chǎn)。為擴(kuò)大該配方應(yīng)用范圍，在本研究基礎(chǔ)上，未來將進(jìn)一步探討化肥尿素、胰蛋白胨、濃度與湛江等鞭金藻的細(xì)胞化學(xué)組成的關(guān)系及其影響機(jī)制等。

4 結(jié)論

氮源為化肥尿素的培養(yǎng)基培養(yǎng)下的湛江等鞭金藻藻細(xì)胞生長、繁殖速度快，可快速進(jìn)入指數(shù)生長期，具有藻液細(xì)胞濃度大，富含優(yōu)質(zhì)生物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，餌料質(zhì)量可得到強(qiáng)化。本研究結(jié)果為低成本、高效、規(guī)?；囵B(yǎng)湛江等鞭金藻提供了依據(jù)，對(duì)促進(jìn)湛江等鞭金藻養(yǎng)殖和飼料配方的發(fā)展具有現(xiàn)實(shí)意義。