低溫脅迫對(duì)軍曹魚(yú)幼魚(yú)血清生化指標(biāo)、肝臟抗氧化酶活性及凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的影響

李 豫，黃建盛，陳有銘，溫震威，歐光海，黃鑒鵬，蔣鑫濤，郭潮安，馬 騫，陳 剛,3

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東藍(lán)糧種業(yè)有限公司，廣東 湛江 524000；3.廣東省水產(chǎn)動(dòng)物病害防控與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

溫度是影響?hù)~(yú)類(lèi)生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖的主要環(huán)境因子。溫度驟降對(duì)魚(yú)類(lèi)正常生命活動(dòng)產(chǎn)生不利影響，甚至導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)大量死亡。尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）[1]、雜交石斑魚(yú)（Epinephelus moara♀×Epinephelus lanceolatus♂）[2]、點(diǎn)帶石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）[3]、鯉（Cyprinus carpiovar.wuyuanensis♂×Cyprinus pellegrini pellegrini♀）[4]等在低溫脅迫下，葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）等血清生理生化指標(biāo)均發(fā)生顯著變化。此外，低溫脅迫還會(huì)導(dǎo)致魚(yú)體內(nèi)源性活性氧（ROS）增加，造成氧化損傷[5]。將斑馬魚(yú)（Danio rerio）和歐洲綿鳚（Zoarces viviparus）直接轉(zhuǎn)入低溫環(huán)境中導(dǎo)致腦和肝臟發(fā)生氧化損傷[6-7]，長(zhǎng)期處于低溫脅迫的濱岸護(hù)胸鲇（Teleostei callichthyidae）和歐洲舌齒鱸（Dicentrarchus labrax）中也出現(xiàn)類(lèi)似情況[8-9]。魚(yú)類(lèi)通過(guò)抗氧化防御系統(tǒng)中的過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）等抗氧化酶消除ROS。當(dāng)ROS含量超出機(jī)體清理能力范圍時(shí)，將引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷、酶失活以及遺傳物質(zhì)等重要細(xì)胞成分受損[10-11]。氧化應(yīng)激可進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。大多數(shù)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程與caspase家族、p53、mdm2、bax和bcl-2等凋亡相關(guān)基因有關(guān)，關(guān)鍵凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的變化可降低細(xì)胞活力，增加細(xì)胞凋亡比例[13-14]。

軍曹魚(yú)（Rachycentron canadum）營(yíng)養(yǎng)豐富，肉質(zhì)鮮美，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，是近海浮動(dòng)式網(wǎng)箱和深海網(wǎng)箱的重要養(yǎng)殖魚(yú)種[15]。據(jù)報(bào)道，軍曹魚(yú)適宜生長(zhǎng)水溫為25～32℃，水溫低至21 ℃時(shí)攝食量明顯降低，18 ℃時(shí)靜止于水底[16]。近年來(lái)，我國(guó)南方地區(qū)冬春季節(jié)寒潮天氣頻發(fā)，對(duì)軍曹魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。本實(shí)驗(yàn)室前期開(kāi)展了低溫脅迫影響軍曹魚(yú)幼魚(yú)脂代謝的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)軍曹魚(yú)通過(guò)顯著提高肝臟和腹腔脂肪的多不飽和脂肪酸比例來(lái)響應(yīng)低溫脅迫[17]。本研究測(cè)定低溫脅迫下軍曹魚(yú)的血清和肝臟生理生化指標(biāo)，檢測(cè)肝臟中凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的變化，為軍曹魚(yú)健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)用軍曹魚(yú)幼魚(yú)由廣東海洋大學(xué)海洋生物研究基地自繁自育，實(shí)驗(yàn)在廣東恒興飼料股份有限公司863 基地進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將幼魚(yú)暫養(yǎng)兩周，養(yǎng)殖設(shè)備為24 h 的流水養(yǎng)殖系統(tǒng)，每個(gè)水槽300 L，溶氧水平≥5 mg/L，氨氮≤0.02 mg/L，pH 7.6±0.2，溫度（28±1）℃、鹽度29±1。暫養(yǎng)結(jié)束后挑選健康、規(guī)格一致、平均體質(zhì)量（39.11±1.01）g、平均體長(zhǎng)（19.71±0.73）cm 的軍曹魚(yú)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置(18±0.5)、(21±0.5)、(25±0.5)℃3 個(gè)溫度處理組和1個(gè)對(duì)照組（28±1）℃，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾魚(yú)。降溫程序參考文獻(xiàn)[18-20]并適當(dāng)調(diào)整，水溫高于23℃時(shí)以6 h/℃勻速降溫，降至23℃后以12 h/℃勻速降溫。溫度處理組，將冰塊置于4層蝦苗袋，密封，放入水槽，水槽上方覆蓋薄膜，并在水槽周?chē)迟N隔熱棉以減少溫度波動(dòng)；使用氣石連續(xù)充氣保證水體溫度均衡；實(shí)驗(yàn)期間24 h連續(xù)監(jiān)測(cè)溫度值（每2 h測(cè)量一次水溫），當(dāng)水溫偏離0.3 ℃以上時(shí)即調(diào)整冰塊數(shù)量。實(shí)驗(yàn)期間低溫處理組靜水養(yǎng)殖，每天在8:00和17:00投喂飼料（廣東東騰飼料有限公司），每天更換50%的等溫海水，除水溫外，其余水質(zhì)條件與暫養(yǎng)期間保持一致。

1.2 樣品采集

當(dāng)溫度處理組水溫降至指定溫度（25±0.5、21±0.5、18±0.5）℃后，在0、4 和7 d 時(shí)每組隨機(jī)取魚(yú)15尾（每個(gè)重復(fù)5 尾），使用40 mg/L 的丁香酚麻醉，用1 mL 注射器尾靜脈處采血，離心（3 500 r/min，15 min，4℃）取上層血清置-80 ℃冰箱中保存，用于檢測(cè)生理生化指標(biāo)；采血后每組隨機(jī)取12尾，6尾魚(yú)肝臟用于酶活測(cè)定，6 尾魚(yú)肝臟用于基因表達(dá)分析。所取組織經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血清生理生化指標(biāo)及肝臟酶活測(cè)定

血清葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇（T-CHO）、總蛋白（TP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（AKP）指標(biāo)使用全自動(dòng)分析儀測(cè)定（Chemray 240，深圳雷杜生命科技），所用試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程有限公司。肝臟過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性和丙二醛（MDA）含量均用南京建成生物工程有限公司試劑盒，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定。

1.4 基因表達(dá)分析

肝臟總RNA 提取、質(zhì)量檢測(cè)、反轉(zhuǎn)錄操作流程均參照文獻(xiàn)[21]。根據(jù)軍曹魚(yú)已有的全基因組數(shù)據(jù)（NCBI BioProject ID:PRJNA634421）查找目的基因序列，使用Primer Premier 6.0 設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）引物（表1）。以獲得的肝臟cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參基因，通過(guò)qRT-PCR 分析bax、bcl-2、caspase-9、caspase-3、p53、mdm2基因在不同溫度條件下的表達(dá)變化。qRT-PCR 反應(yīng)程序：94 ℃30 s；94 ℃5 s、58 ℃15 s、72 ℃10 s，40循環(huán)。用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 熒光定量引物Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析和Duncan's 法多重比較進(jìn)行顯著性差異分析，P ＜0.05 表示差異顯著，采用GraphPad Prism 8軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 低溫脅迫對(duì)軍曹魚(yú)幼魚(yú)血清生化指標(biāo)的影響

圖1 可見(jiàn)，脅迫0 d 時(shí)，18 ℃組血清GLU 含量顯著高于其他組（P ＜0.05）；4、7 d 時(shí)，28 ℃組GLU含量顯著高于溫度處理組（P ＜0.05）（圖1(A)）。18 ℃組血清TG 含量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于28 ℃和25 ℃組（P ＜0.05）（圖1(B)）。21 ℃和18 ℃組T-CHO 含量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著低于28 ℃和25 ℃組（P ＜0.05）（圖1(C)）。0、4 d 時(shí)，組間血清TP含量無(wú)顯著性差異（P ＞0.05）；7 d時(shí)，21℃和18℃組TP 含量均顯著低于28℃和25℃組（P ＜0.05）（圖1(D)）。

圖1 低溫脅迫對(duì)軍曹魚(yú)幼魚(yú)血清葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇和總蛋白含量的影響Fig.1 Effects of low-temperatures on contents of glucose(GLU),triglyceride(TG),total cholesterol(T-CHO)and total protein(TP)in serum of juvenile cobia

2.2 低溫脅迫對(duì)軍曹魚(yú)幼魚(yú)血清酶活性的影響

圖2 可見(jiàn)，脅迫0、4 d 時(shí)，18 ℃組血清ALT 活性顯著高于其他組（P ＜0.05）；7 d 時(shí)，18 ℃組ALT 活性下降且組間無(wú)顯著差異（P ＞0.05）（圖2(A)）。0 d時(shí)，28 ℃組血清AST活性顯著低于溫度處理組（P ＜0.05）；4 d 時(shí)，21 ℃和18 ℃組AST 活性均顯著高于28 ℃和25 ℃組（P ＜0.05），而在7 d 時(shí)，僅21 ℃組顯著高于其他組（P ＜0.05）（圖2(B)）。0、4 和7 d時(shí)，血清AKP 活性在28 ℃和25 ℃組較穩(wěn)定，21 ℃和18 ℃組分別在4 d 和7 d 達(dá)到峰值并顯著高于其他組（P ＜0.05）（圖2(C)）。

圖2 低溫脅迫對(duì)軍曹魚(yú)幼魚(yú)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶活性的影響Fig.2 Effects of low-temperatures on activities of alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST)and alkaline phosphatase(AKP)in serum of juvenile cobia

2.3 低溫脅迫對(duì)軍曹魚(yú)幼魚(yú)肝臟抗氧化酶活性的影響

圖3 可見(jiàn)，在0、4、7 d 時(shí)，28 ℃和25 ℃組肝臟SOD 活性較穩(wěn)定且顯著高于21 ℃和18 ℃組（P ＜0.05）（圖3(A)）。0 d 時(shí)，28 ℃組肝臟CAT 活性顯著高于溫度處理組（P ＜0.05）；4、7 d 時(shí)，28 ℃和25 ℃組肝臟CAT 活性顯著高于21 ℃和18 ℃組（P ＜0.05）（圖3(B)）。0 d 時(shí)，18 ℃組肝臟GPx 活性顯著高于其他組（P ＜0.05）；21 ℃和18 ℃組GPx 活性在4 d 時(shí)顯著高于28 ℃和25 ℃組，而在7 d 時(shí)，則顯著低于后者（P ＜0.05）（圖3(C)）。7 d時(shí)，21 ℃和18 ℃組肝臟MDA 含量均顯著高于28 ℃和25 ℃組（P ＜0.05）（圖3(D)）。

圖3 低溫脅迫對(duì)軍曹魚(yú)幼魚(yú)肝臟超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性及丙二醛含量的影響Fig.3 Effects of low-temperatures on activities of SOD,CAT,GPx and contents of MDA in liver of juvenile cobia

2.4 低溫脅迫對(duì)軍曹魚(yú)幼魚(yú)肝臟凋亡基因相對(duì)表達(dá)量的影響

圖4 可見(jiàn)，在0、4 和7 d 時(shí)，21 ℃和18 ℃組肝臟caspase-3和caspase-9基因表達(dá)量均顯著高于28 ℃和25 ℃組（P ＜0.05）（圖4(A,B)）。28 ℃組肝臟p53和bax基因表達(dá)量均顯著低于溫度處理組（P ＜0.05）（圖4(C,F)）。脅迫0 d 時(shí)，25 ℃和18 ℃組肝臟mdm2基因表達(dá)量顯著高于28 ℃和21 ℃組（P ＜0.05）；脅迫4、7 d 時(shí)，21 ℃和18 ℃組mdm2基因表達(dá)量顯著高于28 ℃和25 ℃組（P ＜0.05）（圖4(D)）。脅迫0、7 d 時(shí)，25 ℃組肝臟bcl-2基因表達(dá)量顯著高于其他組，18 ℃組顯著低于其他組（P ＜0.05）；脅迫4 d 時(shí)，25 ℃組顯著高于21 ℃和18 ℃組（P ＜0.05）（圖4(E)）。

圖4 低溫脅迫對(duì)軍曹魚(yú)幼魚(yú)肝臟組織凋亡相關(guān)基因caspase-3、caspase-9、p53、mdm2、bcl-2和bax表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of low-temperatures on relative expression of genes caspase-3,caspase-9,p53,mdm2,bcl-2 and bax in liver of juvenile cobia

3 討論

3.1 低溫脅迫對(duì)軍曹魚(yú)幼魚(yú)代謝水平的影響

血液是魚(yú)體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分，具有生理調(diào)節(jié)、生理防御和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)裙δ?，其生理生化指?biāo)直接反映魚(yú)類(lèi)的營(yíng)養(yǎng)狀況和代謝水平[22]。GLU 為機(jī)體主要的能源物質(zhì)，是魚(yú)類(lèi)維持正常生命活動(dòng)的能量直接來(lái)源[23]。本研究中，軍曹魚(yú)幼魚(yú)血清GLU 含量在18 ℃和21 ℃水溫脅迫下呈先升高后降低的趨勢(shì)，這與鯉（Cyprinus carpio）[4]的低溫脅迫結(jié)果相似，其原因可能是低溫處理初期魚(yú)體內(nèi)大量肝糖原轉(zhuǎn)化為GLU以滿(mǎn)足機(jī)體的代謝需求，而后大量GLU 分解成ATP 為機(jī)體提供能量以抵御低溫環(huán)境[4]。TG 和T-CHO 作為血脂的主要成分[24]，為魚(yú)體提供能量并維持體溫，可作為衡量脂代謝的指標(biāo)[25]。在18 ℃和21 ℃水溫脅迫下幼魚(yú)血清TG 含量顯著高于對(duì)照組，與本實(shí)驗(yàn)室前期開(kāi)展的軍曹魚(yú)低溫脅迫研究結(jié)果一致，推測(cè)低溫脅迫會(huì)誘導(dǎo)魚(yú)體合成更多的脂肪酸以抵御寒冷[17]。低溫脅迫下魚(yú)體肝臟會(huì)受到損傷，導(dǎo)致與合成T-CHO 相關(guān)的酶活性受抑制，使T-CHO 合成速度減慢，同時(shí)肝臟損傷導(dǎo)致其代謝功能障礙，T-CHO 不能正常通過(guò)肝腸循環(huán)被肝臟重新吸收，進(jìn)而引起血清T-CHO含量降低[22]。本研究中，軍曹魚(yú)幼魚(yú)在低溫脅迫后血清T-CHO 含量降低，推測(cè)與低溫導(dǎo)致其在幼魚(yú)體內(nèi)合成速度下降及其在肝腸循環(huán)中代謝異常有關(guān)。

血清蛋白質(zhì)水平可反映魚(yú)體健康狀態(tài)，TP具有穩(wěn)定血液膠體滲透壓和酸堿度的作用[26]。褐籃子魚(yú)（Siganus fuscescens）[27]和七帶石斑魚(yú)（Epinephelus septemfasciatus）[28]的血清TP 含量隨著低溫作用強(qiáng)度的增強(qiáng)呈降低的趨勢(shì)。本研究中，軍曹魚(yú)幼魚(yú)血清TP 含量在18℃和21℃水溫脅迫到7 d 時(shí)顯著低于對(duì)照組，推測(cè)長(zhǎng)時(shí)間低溫脅迫可能造成肝臟功能受損，蛋白質(zhì)合成速率下降[28]；此外，低溫脅迫后期幼魚(yú)攝食量明顯減少，也可能導(dǎo)致血清蛋白水平下降。

3.2 低溫脅迫對(duì)軍曹魚(yú)幼魚(yú)肝功能及免疫的影響

魚(yú)類(lèi)血清酶活性變化可作為判斷組織器官的狀態(tài)和代謝水平的依據(jù)[29]。ALT 和AST 是可用于指示肝細(xì)胞損傷及其程度的轉(zhuǎn)氨酶。機(jī)體處于正常狀態(tài)時(shí)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，僅少量轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)入血液，當(dāng)肝細(xì)胞損傷時(shí)細(xì)胞膜通透性改變，大量ALT和AST 被釋放到血液中，導(dǎo)致其活性在血液中迅速升高[30]。在云紋石斑魚(yú)（Epinephelus moara）的低溫脅迫實(shí)驗(yàn)中，血清ALT 和AST 活性顯著高于對(duì)照組[31]，符合上述規(guī)律。本研究中，低溫脅迫引起軍曹魚(yú)幼魚(yú)ALT 和AST 活性顯著升高，脅迫7 d 時(shí)降至對(duì)照組水平，可能是低溫脅迫前期肝臟合成轉(zhuǎn)氨酶過(guò)程沒(méi)有受到抑制，肝臟受損后大量轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)入血清，而在脅迫7 d 幼魚(yú)響應(yīng)低溫刺激時(shí)合成轉(zhuǎn)氨酶的過(guò)程受到抑制，使血液中轉(zhuǎn)氨酶含量呈下降趨勢(shì)[2]。

AKP 是魚(yú)類(lèi)重要的防御因子，廣泛參與到免疫活動(dòng)中，血清AKP 活性可作為評(píng)價(jià)機(jī)體免疫能力、代謝水平的指標(biāo)[32]。機(jī)體代謝異常時(shí)AKP 通過(guò)淋巴道和肝竇釋放到血液中，造成血清AKP 活性升高[28]。本研究中18 ℃和21 ℃水溫脅迫7 d 時(shí)軍曹魚(yú)幼魚(yú)血清AKP活性顯著高于對(duì)照組，推測(cè)低溫脅迫對(duì)軍曹魚(yú)幼魚(yú)的免疫機(jī)制或代謝造成損傷。

3.3 低溫脅迫對(duì)軍曹魚(yú)幼魚(yú)抗氧化防御系統(tǒng)的影響

生物機(jī)體在環(huán)境刺激下會(huì)產(chǎn)生大量ROS，而過(guò)量的ROS 則會(huì)造成DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的功能受損[33]。魚(yú)體抗氧化防御系統(tǒng)中，抗氧化酶SOD、CAT、GPx 和部分非酶類(lèi)抗氧化劑可相互協(xié)調(diào)清除ROS，防止或修復(fù)氧化損傷[34]。研究表明，魚(yú)類(lèi)抗氧化系統(tǒng)易受溫度影響，大口黑鱸（Micropterus salmoides）長(zhǎng)期處于溫度脅迫狀態(tài)會(huì)造成應(yīng)激損傷并降低免疫水平[35]；對(duì)中華鱘（Acipenser sinensis）進(jìn)行急性低溫脅迫后其氧化酶活性改變并對(duì)肝臟產(chǎn)生一定程度的損傷[36]；點(diǎn)籃子魚(yú)(Siganus guttatus)幼魚(yú)肝臟抗氧化酶活性在低溫脅迫（14 ℃）后顯著降低[37]；在云紋石斑魚(yú)[38]和尼羅羅非魚(yú)[39]的研究中發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫導(dǎo)致魚(yú)體內(nèi)MDA 濃度升高，從而對(duì)魚(yú)體造成傷害。本研究中，18 ℃和21 ℃組軍曹魚(yú)幼魚(yú)肝臟SOD 和CAT 活性在脅迫期間均顯著低于對(duì)照組，其原因可能是低溫脅迫造成肝功能受損，抗氧化防御能力降低，從而導(dǎo)致SOD 和CAT 活性下降。而GPx 活性在低溫脅迫至7 d 時(shí)顯著高于對(duì)照組，可能是脅迫后期CAT 活性下降誘導(dǎo)GPx活性上升以清除過(guò)量的H2O2[40]。MDA 含量在脅迫期間均顯著高于對(duì)照組，表明低溫脅迫下軍曹魚(yú)幼魚(yú)抗氧化防御能力遭到破壞，機(jī)體無(wú)法及時(shí)清除過(guò)量的ROS，體內(nèi)ROS 濃度上升使脂質(zhì)過(guò)氧化程度加深。

3.4 低溫對(duì)軍曹魚(yú)幼魚(yú)肝臟組織凋亡基因相對(duì)表達(dá)量的影響

細(xì)胞應(yīng)對(duì)刺激有不同的保護(hù)機(jī)制，但超出細(xì)胞承受范圍的刺激強(qiáng)度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)中斷、DNA 結(jié)構(gòu)破壞和細(xì)胞凋亡[12]。研究表明，氧化應(yīng)激會(huì)改變caspase家族、p53、mdm2、bax和bcl-2等凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。細(xì)胞應(yīng)激產(chǎn)生的ROS 會(huì)改變p53表達(dá)水平，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞周期停滯或凋亡程序[41]。p53為信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中心樞紐，可調(diào)控細(xì)胞的活性，其中p53-mdm2信號(hào)通路是主要的調(diào)控途徑[42]。mdm2在調(diào)控p53表達(dá)水平、維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用，p53被激活后促進(jìn)mdm2表達(dá)，mdm2表達(dá)產(chǎn)物對(duì)p53具有負(fù)調(diào)控作用[43]。本研究中，18 ℃和21 ℃水溫脅迫導(dǎo)致軍曹魚(yú)幼魚(yú)p53表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，提示p53可能在低溫誘導(dǎo)幼魚(yú)細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，其表達(dá)量變化可能啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，同時(shí)mdm2的激活可能是受p53表達(dá)上調(diào)的影響。

p53可通過(guò)上調(diào)bax和下調(diào)bcl-2表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。bax和bcl-2均屬bcl2家族，但基因功能完全不同[44]。研究表明，低溫脅迫導(dǎo)致四川華鳊（Sinibrama taeniatus）細(xì)胞凋亡，其凋亡相關(guān)基因p53和bax表達(dá)上調(diào)以及bcl-2表達(dá)下調(diào)，本研究檢測(cè)的基因表達(dá)趨勢(shì)與此結(jié)果相似，推測(cè)低溫脅迫下軍曹魚(yú)發(fā)生了細(xì)胞凋亡[45]。

細(xì)胞凋亡可由多種刺激觸發(fā)，但凋亡途徑主要有外源性死亡受體途徑和內(nèi)源性線(xiàn)粒體途徑[46]。內(nèi)源性線(xiàn)粒體途徑通過(guò)激活caspases-9啟動(dòng)凋亡程序，caspases-9表達(dá)上調(diào)可以激活下游caspases-3促使細(xì)胞凋亡，caspases-3是兩種凋亡途徑的“執(zhí)行者”。本研究中，在18 ℃和21 ℃水溫脅迫下軍曹魚(yú)幼魚(yú)肝臟caspases-9和caspases-3表達(dá)顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明低溫脅迫下最終激活caspases-3表達(dá)，進(jìn)而激活內(nèi)源性線(xiàn)粒體途徑引發(fā)細(xì)胞凋亡[47]。此結(jié)果與低溫脅迫下暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）[48]和點(diǎn)帶石斑魚(yú)[3]caspases-9和caspases-3表達(dá)顯著上調(diào)結(jié)果相似。魚(yú)類(lèi)受到外來(lái)刺激時(shí)，會(huì)造成體內(nèi)ROS 代謝紊亂，細(xì)胞組分及生物合成機(jī)制發(fā)生異常，進(jìn)而可能誘發(fā)細(xì)胞凋亡[49]。推測(cè)可能是低溫脅迫軍曹魚(yú)幼魚(yú)過(guò)程中，抗氧化防御能力降低，細(xì)胞不斷受到氧化損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。

3.5 軍曹魚(yú)對(duì)低溫的敏感性

低溫脅迫顯著影響?hù)~(yú)類(lèi)生理過(guò)程，降溫速率對(duì)于魚(yú)類(lèi)響應(yīng)低溫脅迫過(guò)程的形態(tài)、生理、基因表達(dá)水平的變化有決定性作用；因此，需依據(jù)目標(biāo)物種的溫度適應(yīng)性等特征選取合適的降溫速率。例如，花鱸（Lateolabrax maculatus）[20]、七彩神仙魚(yú)（Symphysodon aequifasciatus）[19]、四帶無(wú)須鲃（Puntius tetrazona）[50]等分別選取1 ℃/h、1 ℃/d及2 ℃/d 的降溫速率開(kāi)展低溫脅迫處理。軍曹魚(yú)廣泛分布在水溫較高的海域[51]，對(duì)低溫較為敏感，過(guò)快的降溫速率（2 ℃/h）會(huì)導(dǎo)致軍曹魚(yú)不攝食[17]，故本研究首先以6 h/℃勻速降溫至23 ℃后，再以12 h/℃勻速降溫。此外，上述研究中低溫處理組的首次取樣均選取在溫度降至目標(biāo)溫度后開(kāi)始，因此，本研究也采取相似的取樣策略，以保證研究結(jié)果的可比性。

4 結(jié)論

本研究表明，低溫脅迫會(huì)顯著抑制軍曹魚(yú)幼魚(yú)代謝水平，降低其抗氧化相關(guān)酶活性，造成氧化損傷，從而誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。