地西他濱暴露下2種典型甲藻生長及其抗氧化響應研究

趙建剛，唐濤，張建能，郭潔，王朝暉,*

1.暨南大學生態(tài)學系，廣州 510632

2.熱帶亞熱帶水生態(tài)工程教育部工程研究中心，廣州 510632

5-氮雜-2’-脫氧胞嘧啶核苷，又稱地西他濱(decitabine,DAC)，屬于脫氧胞苷類似物，是一種DNA甲基轉移酶抑制劑，可通過抑制DNA甲基化轉移酶，逆轉甲基化過程。作為一種人類用藥，其常用于治療骨髓增生異常綜合征和急性髓系白血病[1]，且有研究證實，DAC高濃度時具有細胞毒性，低濃度時具有去甲基化作用[2]。近年來作為一種DNA甲基化抑制劑，DAC已開始應用于農業(yè)生產、園藝[3]等領域，隨著它們使用范圍的擴大、使用頻率的增加，其進入水體的機會也越來越大，若處理不當，其極有可能傳播至水體中，在食物鏈中積累，危害生物，破壞水生態(tài)系統的平衡。

DNA甲基化是一種常見的生物表觀遺傳修飾現象，植物可通過基因甲基化和去甲基化對基因表達進行調控[4]，從而調節(jié)植物生長及其對環(huán)境的適應能力。DNA甲基化常用于研究高等植物，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)[5]、水稻(Oryzasativa)[6]、小麥(Triticumaestivum)[7]和花椰菜(Brassicaoleracea)[8]等，其對高等植物的生長與發(fā)育有著重要的影響，如株高、開花和結果等[9]，且已有多項研究結果表明DNA甲基化能提高植物對于不利條件的耐受能力，如水稻的耐鹽能力[6]、馬鈴薯(Solanumtuberosum)的耐旱能力[10-11]等。藻類作為水生態(tài)系統的初級生產者，其種類多樣性和初級生產量會直接影響水生態(tài)系統的結構與功能，而目前DNA甲基化對水生態(tài)系統影響特別是對藻類的毒性研究報道較少[12-14]。

塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)和血紅哈卡藻(Akashiwosanguinea)是2種常見的海洋赤潮甲藻，廣布于溫帶和亞熱帶海域，其大量增殖引發(fā)的赤潮會導致多種海洋生物的死亡，其中塔瑪亞歷山大藻能產生麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish poisoning,PSP)[15]，且它產生的PSP毒素在已知赤潮毒素中毒性最強、分布最廣、威脅性最大。本研究以2種典型赤潮甲藻為研究對象，研究不同濃度DAC對藻細胞生長的影響，并進一步揭示藻細胞內抗氧化系統對不同DAC濃度的響應；通過考察DAC對2種海洋甲藻的毒性和致毒機理，進而評估DAC對海洋初級生產力的潛在影響，為海洋生態(tài)系統保護提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

研究所用的塔瑪亞歷山大藻和血紅哈卡藻均取自于暨南大學生態(tài)學系藻種室；所用的DAC為分析純，CAS號為320-67-2，純度99%，購自江蘇艾康生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司。使用由“HEKA CORAL”天然海鹽配制的f/2去硅培養(yǎng)基培養(yǎng)，調節(jié)培養(yǎng)液鹽度(30±1)‰，pH 7.6±0.1；培養(yǎng)條件為：溫度(20±1) ℃，光照強度150 μE·m-2·s-1，光暗比為L∶D=12 h∶12 h。

1.2 實驗方法

根據預備實驗結果，得到對藻細胞生長具有梯度抑制作用的濃度組。設置了5個實驗組和1個對照組，每組設3個重復，DAC濃度依次為0(對照組)、0.01、0.05、0.1、0.5和1 mmol·L-1。

實驗在規(guī)格為150 mL的三角瓶中進行，先加入100 mL培養(yǎng)基，再加入已到達對數生長期的初始密度分別為0.33×104cells·mL-1和1.34×104cells·mL-1的血紅哈卡藻和塔瑪亞歷山大藻藻液。添加DAC母液配制成設定濃度的試驗液，實驗條件與甲藻的培養(yǎng)條件一致。實驗周期為96 h，在實驗進行前(0 h)及培養(yǎng)的24、48和96 h取樣，對藻細胞進行計數，并制備藻細胞勻漿用于抗氧化指標的測定。

1.3 可溶性蛋白的測定

可溶性蛋白的測定用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定，具體操作依照試劑盒說明書步驟進行。在96孔細胞培養(yǎng)板中分別加入待測細胞勻漿(測定管)和蒸餾水(對照管)各10 μL，然后按順序加入測試盒相關的反應試劑，旋渦混合器(Vortex-5，上海達姆實業(yè)有限公司，中國)充分混勻后于恒溫箱37℃孵育40 min，于波長562 nm處，用酶標儀(MK3，Thermo，美國)測定各孔吸光度值?？扇苄缘鞍诐舛纫詍g·10-6cells表示。

1.4 超氧化物歧化酶(SOD)的測定

SOD活性的測定用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定，具體操作依照試劑盒說明書步驟進行。在15 mL測定管中分別加入待測細胞勻漿(測定管)和蒸餾水(對照管)各50 μL，然后按順序加入測試盒相關的反應試劑，旋渦混合器充分混勻后于生化培養(yǎng)箱(SHH-250，上海予卓儀器有限公司，中國)37℃孵育40 min，然后加入按測試盒要求配好的顯色劑2 mL，混勻后室溫放置10 min，最后取200 μL至96孔細胞培養(yǎng)板，于波長550 nm處，用酶標儀測定各孔吸光度值。

SOD活性單位定義：每毫克組織蛋白在1 mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD活性單位(U)，SOD活性以單位細胞酶活性U·10-6cells來表示。

1.5 谷胱甘肽(GSH)的測定

GSH含量的測定利用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定，具體操作依照試劑盒說明書步驟進行。取100 μL細胞勻漿與100 μL測試盒試劑(沉淀劑)混勻，用高速離心機(5804R，Eppendorf，德國)以轉速3 500 r·min-1離心10 min，取上清液待測，向96孔細胞培養(yǎng)板加入待測上清液(測定孔)、沉淀劑(空白孔)和20 μmol·L-1標準品(標準孔)各100 μL，然后按順序加入測試盒相關的反應試劑，充分混勻后室溫靜置5 min，于波長405 nm處，用酶標儀測定各孔吸光度值。藻細胞內GSH含量以nmol·10-6cells表示。

1.6 丙二醛(MDA)的測定

MDA含量的測定用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定，具體操作依照試劑盒說明書步驟進行。在15 mL測定管中分別加入待測細胞勻漿(測定管和對照管)、無水乙醇(空白管)和10 nmol·mL-1標準品(標準管)各100 μL，然后按順序加入測試盒相關的反應試劑，旋渦混合器混勻，保鮮膜扎緊管口并用刺針刺一小口，95℃水浴40 min，取出后流水冷卻，用高速離心機以轉速4 000 r·min-1離心10 min，取200 μL上清液至96孔細胞培養(yǎng)板，于波長532 nm處，用酶標儀測定各孔吸光度值。MDA活性以nmol·10-6cells來表示。

1.7 數據處理

1.7.1 特定生長率

μ(d-1)=(ln(N2/N1))/(t2-t1)

式中：N2和N1分別為t2和t1時的藻細胞數量。

1.7.2 抑制率

IR=(1-Nt/N0)×100%

式中：IR為抑制率(%)，Nt為培養(yǎng)96 h后實驗組的藻細胞密度(cells·mL-1)，N0為同樣時間對照組的藻細胞密度(cells·mL-1)。

1.7.3 96 h半效應濃度(EC50)

生長抑制百分率(EC)是指對藻細胞特定生長率的抑制百分率，其計算公式為：

EC=(μc-μt)/μc×100%

式中：μc是對照組96 h內的特定生長率，μt是各實驗組96 h內的特定生長率。EC50值采用抑制生長百分率的概率單位-濃度對數直線回歸法進行計算。

1.8 統計與分析

利用Microsoft Excel 2013對實驗結果進行統計，結果均為平均值±標準差。利用SPSS 20.0軟件中的單因素方差分析(One-way ANOVA)的多重比較(LSD法)對不同培養(yǎng)條件下藻細胞內各抗氧化指標進行差異顯著性分析。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 DAC對2種甲藻生長的影響

經過96 h培養(yǎng)后，2種甲藻細胞密度雖有不同程度的增長，但均受到了DAC的抑制，其中對血紅哈卡藻的抑制效果更明顯。DAC濃度在0～0.5 mmol·L-1濃度范圍內塔瑪亞歷山大藻呈現出一定的濃度-效應關系。暴露96 h后，當DAC濃度位于0～0.5 mmol·L-1區(qū)間時，DAC濃度越高，其對塔瑪亞歷山大藻的抑制效果越強，而濃度范圍在0.5～1 mmol·L-1時，DAC對塔瑪亞歷山大藻的抑制效果有所減弱(圖1(a))。在DAC暴露下，血紅哈卡藻的生長受到明顯抑制，各實驗組在96 h時的藻細胞密度顯著低于對照組(P<0.05)，且DAC濃度越高，其對血紅哈卡藻的抑制作用越強(圖1(b))。

圖1 不同濃度地西他濱(DAC)對2種甲藻生長的影響注：(a)塔瑪亞歷山大藻；(b)血紅哈卡藻。Fig.1 The growth of two algae under the exposure of decitabine (DAC) with different concentrationsNote:(a) Al. tamarense;(b) Ak. sanguinea.

通過概率單位-濃度對數直線回歸法進行計算，得出DAC對血紅哈卡藻生長的96 h-EC50為0.0016 mmol·L-1(0.37 mg·L-1)，對塔瑪亞歷山大藻的96 h-EC50為0.116 mmol·L-1(26.47 mg·L-1)。根據《新化學物質危害評估導則》(HJ/T154—2004)[16]中的評判標準(表1)，DAC對血紅哈卡藻的急性毒性屬于極高毒性等級，對塔瑪亞歷山大藻的急性毒性屬于中毒性等級。

表1 生態(tài)毒理學危害性分級[16]Table 1 Classification of ecotoxicology hazard[16]

2.2 DAC對2種甲藻細胞各抗氧化指標的影響

2.2.1 可溶性蛋白

2種甲藻細胞可溶性蛋白含量隨DAC處理濃度和處理時間的差異而不同，整體上DAC對2種甲藻細胞可溶性蛋白含量有較明顯的促進作用，其中對血紅哈卡藻的促進效果更明顯(圖2)。實驗期間塔瑪亞歷山大藻對照組的可溶性蛋白含量基本無變化；DAC處理組中的0.01 mmol·L-1和0.1 mmol·L-1組呈現出先升后降的趨勢，分別在24 h和48 h達到峰值；而0.05 mmol·L-1組是波狀上升，0.5 mmol·L-1和1.0 mmol·L-1這2個高濃度組的可溶性蛋白含量則呈穩(wěn)步上升趨勢，均在96 h時達到最大值；96 h時，各中、高濃度處理組(>0.1 mmol·L-1)的可溶性蛋白含量均顯著高于對照組(P<0.01，圖2(a))。隨時間延長，血紅哈卡藻細胞對照組的可溶性蛋白含量略有波動，DAC處理組中的0.01 mmol·L-1和0.05 mmol·L-1這2個低濃度組整體上呈現出先下降(0～24 h)后上升(24～96 h)的趨勢，而其余3個中、高濃度實驗組則呈現穩(wěn)步上升的趨勢；96 h時對照組血紅哈卡藻細胞的可溶性蛋白含量顯著低于1 mmol·L-1組(P<0.01)，顯著低于其他處理組(P<0.05，圖2(b))。

圖2 不同濃度DAC對2種甲藻可溶性蛋白含量的影響注：(a)塔瑪亞歷山大藻，(b)血紅哈卡藻；同一時間不同DAC濃度條柱上的不同字母表示同一時間不同濃度處理組間差異顯著，P<0.05。Fig.2 The content of soluble protein in two algae under the exposure of DAC with different concentrationsNote:(a) Al. tamarense,(b) Ak. sanguinea;different letters at different DAC concentrations in the same time indicate significant differences,P<0.05.

2.2.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性

隨著實驗的進行，塔瑪亞歷山大藻對照組的SOD活性逐漸下降，而各DAC處理組則呈現出先升后降的趨勢：均在24 h時達到各組相對峰值，然后逐漸下降且都在96 h時達到最小值；96 h時對照組的SOD活性顯著高于各中、低DAC濃度組(<0.1 mmol·L-1,P<0.05)，而與中、高濃度組無顯著差異(圖3(a))。與塔瑪亞歷山大藻不同，DAC對血紅哈卡藻細胞的SOD活性有一定的促進作用，實驗過程中血紅哈卡藻對照組的SOD活性略有升高，但變化不顯著(P>0.05)，而各處理組則均呈現先升后降且在24 h時達到頂點的趨勢；96 h時血紅哈卡藻對照組的SOD活性顯著低于0.05 mmol·L-1和1 mmol·L-1組(P<0.05)，而略低于其他實驗組(圖3(b))。

圖3 不同濃度DAC對2種甲藻細胞超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響注：(a)塔瑪亞歷山大藻，(b)血紅哈卡藻；同一時間不同DAC濃度條柱上的不同字母表示同一時間不同濃度處理組間差異顯著，P<0.05。Fig.3 Superoxide dismutase (SOD) activity in two algae under the exposure of DAC with different concentrationsNote:(a) Al. tamarense,(b) Ak. sanguinea;different letters at different DAC concentrations in the same time indicate significant differences,P<0.05.

2.2.3 谷胱甘肽(GSH)含量

DAC對藻細胞GSH生成具有促進作用，且對血紅哈卡藻細胞GSH的促進作用更為明顯(圖4)。整體上塔瑪亞歷山大藻各組藻細胞GSH含量呈現先升后降、在24 h時達到最大值的趨勢，其中對照組與0.01 mmol·L-1和0.05 mmol·L-1這2個低濃度組的變化規(guī)律一致，而0.5 mmol·L-1和1 mmol·L-1這2個高濃度組的變化規(guī)律相似；96 h時對照組的GSH含量顯著低于3個中、高濃度實驗組(P<0.05)(圖4(a))。DAC顯著促進了血紅哈卡藻細胞GSH含量的生成，整體上各處理組與對照組的GSH含量變化一致，呈現出穩(wěn)步升高、且均在96 h時達到最大值的趨勢，96 h時血紅哈卡藻對照組的GSH含量顯著低于除0.01 mmol·L-1組之外的其他各濃度組(P<0.01，圖4(b))。

圖4 不同濃度DAC對2種甲藻細胞谷胱甘肽(GSH)含量的影響注：(a)塔瑪亞歷山大藻，(b)血紅哈卡藻；同一時間不同DAC濃度條柱上的不同字母表示同一時間不同濃度處理組間差異顯著，P<0.05。Fig.4 Variation of glutathione (GSH) content in two algae under the exposure of DAC with different concentrationsNote:(a) Al. tamarense,(b) Ak. sanguinea;different letters at different DAC concentrations in the same time indicate significant differences,P<0.05.

2.2.4 丙二醛(MDA)含量

藻細胞MDA含量是指示細胞內膜脂氧化程度的重要指標，所有實驗組在DAC暴露初期藻細胞MDA含量就出現明顯上升，并且隨濃度增加而增大，血紅哈卡藻則呈現出明顯的濃度-效應關系(圖5)。塔瑪亞歷山大藻各處理組與對照組整體變化一致，呈現出先升后降、24 h達到峰值，其后逐漸下降且均在96 h時出現最低值的趨勢；96 h時對照組藻細胞MDA含量顯著低于1 mmol·L-1濃度組(P<0.05，圖5(a))。血紅哈卡藻各DAC濃度組藻細胞MDA含量整體上先升后降，對照組和高DAC濃度組藻細胞MDA含量在24 h達到最大值，而0.01 mmol·L-1和0.1 mmol·L-1濃度組的最大值出現于48 h；96 h時對照組的MDA含量顯著低于各中、高DAC濃度組(>0.5 mmol·L-1,P<0.05，圖5(b))。

圖5 不同濃度DAC對2種甲藻細胞丙二醛(MDA)含量的影響注：(a)塔瑪亞歷山大藻，(b)血紅哈卡藻；同一時間不同DAC濃度條柱上的不同字母表示同一時間不同濃度處理組間差異顯著，P<0.05。Fig.5 Variation of malondialdehyde (MDA) content in two algae under the exposure of DAC with different concentrationsNote:(a) Al. tamarense,(b) Ak. sanguinea;different letters at different DAC concentrations in the same time indicate significant differences,P<0.05.

3 討論(Discussion)

不同藻類對DAC暴露的耐受能力不同，萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)暴露在濃度為10 μmol·L-1的DAC下，雖然生物量濃度在第1天下降，但隨著時間延長而持續(xù)增大，在第5天接近對照組；而四尾柵藻(Scenedesmusquadricauda)對DAC的耐受能力較差，生物量在第1天下降，1～3 d內有所增加，但第3天后大幅度下降，最終降至暴露前的初始生物量水平[14]。本研究中，不同濃度DAC對2種赤潮甲藻的生長均有較強的抑制作用，且呈現出明顯的劑量-效應和時間-效應關系，因此需要防范其對海洋環(huán)境特別是海洋初級生產力的影響。

MDA是細胞膜脂質過氧化的產物，也是衡量膜脂質過氧化程度的一個重要指標[28]，其含量的高低能反映細胞的損害程度以及細胞在逆境條件下耐受能力的強弱。本研究中在DAC暴露下，血紅哈卡藻和塔瑪亞歷山大藻MDA含量均出現明顯上升趨勢，而且呈現出一定的劑量-效應關系，其中血紅哈卡藻MDA含量對DAC的響應更為敏感。但2種藻細胞MDA含量均在暴露后的24 h達到最大值，隨后逐漸下降，這可能是由于隨著暴露時間的延長，藻類細胞逐漸適應了毒害環(huán)境，加之SOD活性的增大及GSH誘導作用的加強，及時清除了一部分ROS，對細胞膜起到了一定的保護作用[29-30]，使生物膜所受損害有所降低；此外，隨著時間延長，DAC會有一定程度的降解和吸附，實驗液中DAC濃度下降，毒性也隨之降低[31]，因此，MDA含量在暴露短時間內達到峰值后會逐漸回落。

2種實驗甲藻中，塔瑪亞歷山大藻屬于甲藻門膝溝藻目亞歷山大藻屬，其細胞表層覆有堅硬厚實的細胞壁，可有效阻止或減少DAC等脅迫因子進入細胞內而破壞細胞器，同時也有效減少了DAC的醌基誘導藻細胞產生大量ROS毒害的可能；而血紅哈卡藻屬于甲藻門多甲藻目裸甲藻屬，細胞體表沒有堅實的細胞壁，對DAC脅迫的保護能力較弱，這可能是本研究中血紅哈卡藻對DAC脅迫更為敏感的主要原因。本研究中隨著DAC濃度增加、暴露時間延長，2種甲藻細胞生長均受到明顯抑制，DAC分子結構上的醌基能誘導大量ROS生成，同時在逆境脅迫下藻細胞SOD活性的抑制、GSH誘導作用的增強及膜脂過氧化可能是DAC抑制2種實驗甲藻特別是血紅哈卡藻的生長并對其產生一定致毒作用的重要原因。相較而言，血紅哈卡藻對DAC脅迫更為敏感，其GSH和MDA含量變化敏感，呈現出明顯的劑量-效應和時間-效應關系，可以作為監(jiān)測DAC環(huán)境污染的生物標記指標之一。