膠州灣地區(qū)貝類的全氟辛酸健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)

于永興，李風(fēng)鈴,姚琳，郭萌萌，江艷華，耿倩倩，曲夢，譚志軍，李兆新，張曉娜

1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，青島 266000

2.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島 266071

全氟辛酸(perfluorooctanoic acid,PFOA)，是一種含有8個(gè)碳原子烷基鏈為基本支架的全氟化合物[1]。PFOA具有較強(qiáng)的疏水、疏油和抗高溫等優(yōu)勢，是不粘鍋、餐具和包裝紙等多種食品接觸材料生產(chǎn)過程中的一種重要加工助劑[2]。PFOA是一類新型持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants,POPs)，具有POPs的典型特征(持久性、蓄積性、遷移性、高毒性)，對人體具有一定的危害[3]。美國規(guī)定2010年排放量減少95%，2015年實(shí)現(xiàn)完全淘汰；歐盟規(guī)定自2020年7月起不得投放入市場[4]。然而在當(dāng)前的檢測過程中，許多水源、生物體乃至南北極地區(qū)都有PFOA檢出[5]。

本研究選取的研究對象為雙殼貝類。雙殼貝類具有獨(dú)特的生理特性，營底棲生活，濾食浮游生物，相比海洋生態(tài)系統(tǒng)中的其他物種更易蓄積水體中的污染物[6]，通過生物放大作用使得污染物隨著食物鏈進(jìn)入人體[7]。

美國環(huán)境保護(hù)局(United States Environmental Protection Agency,US EPA)構(gòu)建了一個(gè)非致癌健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)模型，HR=EDI/RfD，式中：HR為危害系數(shù)(hazard ratio)，用以表示風(fēng)險(xiǎn)商值，若該值>1，則表示對人體具有潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)；EDI為估計(jì)的每日攝入量(estimated daily intake)，即單位體質(zhì)量的人體預(yù)估的每日攝入污染物的劑量(μg·kg-1·d-1)；RfD為參考劑量(reference dose)，即一生的時(shí)間之中持續(xù)慢性暴露但不產(chǎn)生明顯的負(fù)面效應(yīng)的臨界劑量[8-10]。生物利用度過程指污染物從口腔開始進(jìn)入人體，止于血液吸收。它實(shí)際上包括了2個(gè)主要部分，消化系統(tǒng)的溶解和細(xì)胞吸收。前者又可稱為生物可給性(bioaccessibility,BA)，是可溶解在消化系統(tǒng)內(nèi)的最大濃度[11-12]。全氟類化合物主要與生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，胃作為機(jī)體消化蛋白質(zhì)存在的主要場所，胃消化過程對PFOA在人體的釋放起著至關(guān)重要的作用[13-14]。因此有必要對貝類中PFOA在胃消化過程的生物可給性進(jìn)行研究。

膠州灣是以薛家島(36°00'53″N,120°17'30″E)和團(tuán)島(36°02'36″N,120°16'49″E)相連為界的半封閉海灣，一部分與黃海相通，位于山東半島的南岸。該處海水營養(yǎng)豐富，海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)，是重要的海水養(yǎng)殖區(qū)[15-16]。青島是膠東半島的一個(gè)重要海濱城市，作為中國的新一線城市，擁有950萬常住人口，150萬流動(dòng)人口，人口數(shù)量眾多，水產(chǎn)品消費(fèi)量較大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、紫貽貝(Mytilusedulis)、扇貝(Chlamysfarreri)、牡蠣(Crassostreagigas)和螠蟶(Sinonovaculaconstricta)等是青島較為重要的貝類品種[17]，在養(yǎng)殖量、市場消費(fèi)量以及貿(mào)易出口等方面均具有重要的地位[18-19]。近年來，水產(chǎn)品質(zhì)量安全屢出狀況，包括貝類產(chǎn)品在內(nèi)的食品安全一直是消費(fèi)者關(guān)注的問題。因此，有必要針對以上5種經(jīng)濟(jì)貝類中的PFOA污染情況進(jìn)行考察，并開展健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)，以期提出健康食用指導(dǎo)值。

基于以上考慮，本研究圍繞膠州灣海域，分別于市南區(qū)、市北區(qū)、紅島、膠州區(qū)、黃島和薛家島選取人流量較大、當(dāng)?shù)鼐用裣M(fèi)量較高的6個(gè)大型農(nóng)貿(mào)市場設(shè)置不同取樣點(diǎn)。它們分別是新貴都市場、河西農(nóng)貿(mào)市場、紅島海鮮專賣、周家村市場、劉公島市場和薛家島愛心市場，以此對典型經(jīng)濟(jì)貝類中的PFOA蓄積量進(jìn)行摸底。同時(shí)參考青島市國民體質(zhì)測定結(jié)果報(bào)告[20]劃分的年齡段，且在本地區(qū)中青年人和老人是水產(chǎn)品攝入的重點(diǎn)人群這一現(xiàn)實(shí)情況，將20～60歲中每10歲劃為一個(gè)年齡段，60歲以上作為一個(gè)年齡段，在不同性別消費(fèi)群體中以調(diào)查問卷方式開展膳食調(diào)查。隨后進(jìn)行PFOA的生物可給性研究，綜合利用以上數(shù)據(jù)，計(jì)算PFOA的健康風(fēng)險(xiǎn)值，為膠州灣地區(qū)居民貝類的健康食用提出建議。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 樣品采集

在膠州灣海域沿線選擇人口較為集中、水產(chǎn)品消費(fèi)量較大的6個(gè)集貿(mào)市場設(shè)置取樣點(diǎn)(圖1)。每個(gè)取樣點(diǎn)采集約30只新鮮貝類(菲律賓蛤仔、紫貽貝、扇貝、牡蠣、螠蟶)，并置于預(yù)先盛放海水的水箱中暫存?；貙?shí)驗(yàn)室后立即解剖，取可食用部分，液氮研磨，并保存于-80 ℃冰箱。6個(gè)取樣點(diǎn)如圖1所示，1號為新貴都市場，2號為河西農(nóng)貿(mào)市場，3號為紅島海鮮專賣，4號為周家村市場，5號為劉公島市場，6號為薛家島愛心市場。

圖1 取樣點(diǎn)示意圖Fig. 1 Diagram of sampling points

1.2 貝類樣品中PFOA殘留量的測定

1.2.1 樣品的前處理

各樣品于真空冷凍干燥機(jī)(CoolSafe 55-9，丹麥Scanvac)中72 h完全凍干。準(zhǔn)確稱取0.2 g凍干樣品于10 mL PP離心管中，每個(gè)離心管中加入2 ng內(nèi)標(biāo)物MPFOA，然后室溫靜置12 min。加入4 mL 90%乙腈水溶液，渦旋至完全混勻，超聲提取10 min，保證組織中的PFOA徹底釋放。8 000 r·min-1離心10 min后，移取1 mL上清液潤洗Oasis PRIME HLB固相萃取柱，保持流速為1～2滴·s-1。潤洗液流干后，再準(zhǔn)確移取2 mL提取液加載至SPE小柱上，保持流速同上，收集流出液。于35 ℃氮?dú)庀麓抵谅缘陀?.5 mL，該過程大約1 h。用50%甲醇水溶液定容至1 mL，12 000 r·min-1高速離心10 min，將液體收集于閉口上樣小瓶中，-80 ℃保存，待測。

1.2.2 液相色譜質(zhì)譜條件及質(zhì)控

液相色譜質(zhì)譜條件參考文獻(xiàn)[21]的方法。其中，流動(dòng)相：A為5 mmol·L-1乙酸銨水溶液，B為甲醇。質(zhì)譜中PFOA的定性離子對為413/169，定量離子對為413/369。為了防止實(shí)驗(yàn)器材對背景值的干擾，實(shí)驗(yàn)器材均不選取含有聚四氟乙烯的實(shí)驗(yàn)器材，轉(zhuǎn)而使用聚丙烯材質(zhì)，且于前處理實(shí)驗(yàn)前一天預(yù)先經(jīng)過甲醇和超純水充分沖洗，晾干。樣品檢測的同時(shí)進(jìn)行空白對照實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均扣除空白值。以信噪比等于3為界確定檢出限。PFOA的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.99958，曲線的線性范圍為0.100～20.0 μg·L-1，樣品檢出限為0.03 ng·kg-1，加標(biāo)回收率為97.4%。

1.3 PFOA生物可給性分析

1.3.1 體內(nèi)消化模擬實(shí)驗(yàn)

取2 g樣品，置于18 mL離心管中，加水混勻，用1∶1鹽酸調(diào)節(jié)pH=2.0。15 min后，使pH依然保持2.0。每個(gè)離心管加入0.1 mL新鮮配制的胃蛋白酶溶液。該溶液由胃蛋白酶0.1 g，加0.1 mol·L-1的鹽酸l mL，混勻制得。將離心管置于37 ℃水浴振蕩器中，120 r·min-1下振蕩2 h，進(jìn)行胃液模擬消化。

取上述胃消化液至聚丙烯離心管中，放置于4 ℃離心機(jī)中，12 000 r·min-1離心30 min。收集上清液。此上清液所含PFOA即為胃液中人可吸收利用的最大PFOA濃度[22-23]。

1.3.2 樣品處理

取0.5 mL上述上清液，加入3 mL ddH2O，渦旋1 min，振蕩15 min，充分混勻。4 ℃條件下離心30 min，轉(zhuǎn)速為8 500 r·min-1。預(yù)先把Oasis HLB(30 μm)的固相萃取柱依次經(jīng)過3 mL甲醇、3 mL去離子水進(jìn)行活化。取1.3.1中所得上清液過柱，再用3 mL 10%的甲醇水溶液充分淋洗，棄去。準(zhǔn)確吸取3 mL甲醇洗脫目標(biāo)物，控制流速為1～2滴·s-1。洗脫液渦旋混合，0.2 μm微孔濾膜過濾1 mL至上樣小瓶，待測。HPLC-MS條件同1.2.2。

1.3.3 生物可給性(BA)

計(jì)算公式為BA(%)=消化液中PFOA的總量(ng)/樣品中PFOA的總量(ng)[24]。消化液中PFOA的總量即可利用的PFOA總量，等于消化液中PFOA的濃度乘以消化液總體積。樣本中PFOA的總量等于樣本中PFOA的蓄積量和樣品質(zhì)量的乘積。本研究設(shè)置了純清水組作為空白對照，計(jì)算修正值。

1.4 儀器和試劑

LC-20A超高效液相色譜儀(Shimadzu，日本)；QTRAP 5500三重四極桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀(AB Sciex，美國)；N-EVAP 112氮吹儀(Organomation，美國)；冷凍離心機(jī)(3K15，德國Sigma)；57250-U固相萃取裝置(Supelco，美國)。

PFOA標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma，美國)，MPFOA(Wellington，加拿大)，甲醇、乙腈、超純水(質(zhì)譜級，Sigma，美國)，Oasis PRIME HLB固相萃取柱(6 mL,200 mg,Waters，美國)。

1.5 膳食調(diào)查

根據(jù)經(jīng)濟(jì)貝類主食區(qū)域消費(fèi)主體特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了膳食調(diào)查紙質(zhì)調(diào)查問卷，于各采樣點(diǎn)及周邊區(qū)域隨機(jī)分發(fā)。調(diào)查問卷的內(nèi)容主要包括姓名、性別、年齡區(qū)間(20～30歲、31～40歲、41～50歲、51～60歲和61歲以上)、家庭用餐人數(shù)、每月食用貝類(菲律賓蛤仔、紫貽貝、扇貝、牡蠣和螠蟶)的頻次(一個(gè)月1次、一個(gè)月2～3次、每周次數(shù))和每次的購買量(kg)，飲食時(shí)是否伴有佐食和其他補(bǔ)充說明。

1.6 風(fēng)險(xiǎn)商

HR=(EDI×BA)/RfD

EDI=單位體重的居民每日貝類膳食量(kg·kg-1·d-1)×貝類中PFOA蓄積量(以干質(zhì)量計(jì))(μg·kg-1)

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析軟件采用GraphPad Prism 9、SPSS 22.0和Excel 2020。樣品中PFOA含量以干質(zhì)量計(jì)，含量低于檢出限的或未檢出的以0計(jì)入。

2 結(jié)果(Results)

2.1 膠州灣貝類中的PFOA蓄積量分析

不同取樣點(diǎn)5種貝類的PFOA蓄積量如表1所示。調(diào)查顯示，薛家島、劉公島等處的貝類產(chǎn)品中PFOA含量較低，而來源于新貴都、河西以及周家村等處的產(chǎn)品中PFOA含量稍高。對于不同品種的貝類來說，菲律賓蛤仔和扇貝中的PFOA蓄積量相對較高，明顯高于其他品種。來源于不同采樣點(diǎn)的菲律賓蛤仔中PFOA蓄積量范圍為0.17～3.09 μg·kg-1，扇貝中PFOA蓄積量范圍為0.23～3.36 μg·kg-1。

表1 不同取樣點(diǎn)5種貝類的全氟辛酸(PFOA)蓄積量Table 1 Accumulation of perfluorooctanoic acid (PFOA) of 5 shellfish speices in different sample points (μg·kg-1)

2.2 不同貝類中的PFOA生物可給性

根據(jù)貝類樣品中的PFOA蓄積量測定結(jié)果推算出2 g貝類樣品中PFOA的含量。根據(jù)1.3.3中的方法，體外模擬胃消化過程，測定出樣品中人體可利用的PFOA總量。進(jìn)而計(jì)算得到PFOA的生物可給性(表2)。

如表2所示，不同貝類中的生物可給性從16.7%(蛤仔)到41.9%(螠蟶)，證明了隨著貝類產(chǎn)品進(jìn)入人體的PFOA不會(huì)經(jīng)過胃消化過程全部進(jìn)入消化液中而被人體吸收。與Li等[25]通過生物利用度提取模型(physiologically based extraction test,PBET)的方法測得的9.8%～99%結(jié)果一致。取以上貝類品種中的生物可給性均值即26.9%，進(jìn)行健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)。

表2 5種貝類胃消化過程中PFOA的生物可給性Table 2 Bioaccessibility of PFOA in 5 shellfish species by digestive process of stomach

2.3 膳食調(diào)查的結(jié)果

在針對膠州灣地區(qū)居民開展的貝類膳食調(diào)查中，共計(jì)100份有效數(shù)據(jù)被采集。

根據(jù)調(diào)查結(jié)果，膠州灣地區(qū)居民總體平均貽貝膳食量為0.05 kg·kg-1·d-1，牡蠣0.13 kg·kg-1·d-1，扇貝0.08 kg·kg-1·d-1，螠蟶kg·kg-1·d-1，菲律賓蛤仔0.14 kg·kg-1·d-1(表3)。受調(diào)查群體普遍對螠蟶的膳食量較小，在5種貝類中攝食比例僅占4%。對牡蠣和菲律賓蛤仔的膳食量較高，占30%及以上，其次為扇貝，膳食量占比為21%(圖2)。另外，在本次受調(diào)查群體中，男性人員占51%，女性為49%。而結(jié)果顯示，受調(diào)查群體的性別對于貝類品種的選擇并無傾向性。然而，年齡對于品種的喜好性具有明顯的差異：中青年人群(20～60歲)偏好貽貝，而老年人群(60歲以上)更偏好菲律賓蛤仔(圖3)。

圖2 膠州灣地區(qū)不同性別居民5種貝類的膳食比例Fig. 2 Dietary proportion of 5 shellfish species among residents of different genders in Jiaozhou Bay

圖3 膠州灣地區(qū)不同年齡居民5種貝類膳食比例Fig. 3 Dietary proportion of 5 shellfish species among residents of different ages in Jiaozhou Bay

表3 膠州灣地區(qū)居民5種貝類每日平均膳食量Table 3 Daily average intake of 5 shellfish species in Jiaozhou Bay (kg·kg-1·d-1)

2.4 風(fēng)險(xiǎn)商值的計(jì)算

風(fēng)險(xiǎn)商值根據(jù)1.6中的公式進(jìn)行計(jì)算，RfD選用小鼠中的數(shù)值，0.33 μg·kg-1·d-1[26]。青島市居民平均體質(zhì)量為60 kg左右。綜上，經(jīng)研究，膠州灣地區(qū)貝類中的PFOA風(fēng)險(xiǎn)商值較小，HR均<1，數(shù)量級在10-3～10-5之間(表4)。

表4 膠州灣地區(qū)5種貝類的PFOA風(fēng)險(xiǎn)商值(HR)Table 4 The harzard ratio (HR) of PFOA from 5 shellfish species in Jiaozhou Bay

3 討論(Discussion)

膠州灣是典型的半封閉型海灣，其灣口有多條河流匯入，并直接進(jìn)入黃海。因此，膠州灣也是各類陸源排放物的入海必經(jīng)途徑之一。2019年青島市貝類產(chǎn)量達(dá)73.4 t，膠州灣是最大的主產(chǎn)區(qū)之一。然而，近年來，人類活動(dòng)日益增加，部分河口污染嚴(yán)重，膠州灣海域養(yǎng)殖能力趨于下降。貝類的質(zhì)量安全與品質(zhì)亟待評價(jià)。鑒于此，基于前期的研究數(shù)據(jù)[26]，開展了典型經(jīng)濟(jì)貝類中的PFOA健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)。

在本次研究中，沿膠州灣沿線，選擇了6個(gè)不同區(qū)域的采樣點(diǎn)，并確認(rèn)采樣點(diǎn)的樣品均來自附近海域。樣品采集范圍覆蓋面廣，采集量大，保證了樣品數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。本研究表明，菲律賓蛤仔和扇貝中的PFOA蓄積量相對較高，明顯高于其他品種，這與崔文杰等[27]的研究結(jié)果相似。然而，多年來的研究表明，貽貝對于海洋中的污染物具有較突出的富集能力，已被多個(gè)國家用于海洋污染監(jiān)測的指示品種。在本研究中，貽貝中的PFOA含量并沒有特別突出。推測主要可能是貽貝對于PFOA并沒有特異性的富集效應(yīng)，同時(shí)對于此類物質(zhì)具有相對突出的解毒能力[28-29]，由于本次采集樣品均為市場購買，樣品均經(jīng)海水短暫凈化，體內(nèi)的PFOA具有一定的代謝及清除，因此導(dǎo)致貽貝體內(nèi)的PFOA含量并未十分突出。此外，近年來的研究表明，無論在植物、哺乳動(dòng)物或是在魚類體內(nèi)，均發(fā)現(xiàn)對PFOA的蓄積能力與生物體本身的蛋白質(zhì)含量和游離脂肪酸含量有關(guān)。蛋白質(zhì)含量低則意味著和PFOA結(jié)合的概率也降低，因此蓄積能力也下降。而游離的脂肪酸是通過競爭結(jié)合位點(diǎn)的方式影響外源物質(zhì)和內(nèi)源物質(zhì)的結(jié)合，進(jìn)而影響PFOA的蓄積。貝類中是否也存在如此機(jī)制，亦或是海水的污染是否對貝類的品質(zhì)產(chǎn)生了一定程度的影響，降低了游離脂肪酸和蛋白質(zhì)的含量，進(jìn)而導(dǎo)致其污染物的蓄積能力下降，還有待于進(jìn)一步的探究[30-31]。此外，由表1可知，同一種貝類不同農(nóng)貿(mào)市場來源之間的PFOA累積量也有較大區(qū)別，這可能與不同水質(zhì)和養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān)，將進(jìn)一步展開研究。在本次膳食調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)消費(fèi)者的性別對于飲食習(xí)慣沒有明顯的影響，而年齡的不同使得攝食喜好略有差別。然而，調(diào)查亦發(fā)現(xiàn)，膠州灣地區(qū)不同海域的居民飲食習(xí)慣本就有地域性差異。如紅島地區(qū)盛產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牡蠣，本地區(qū)居民的牡蠣攝食量明顯高于其他品種。另外，海產(chǎn)品尤其是貝類的攝食量或攝食頻率具有季節(jié)性差異，貝類生長繁殖的旺季其市場銷量明顯上升。本次膳食調(diào)查開展時(shí)間為4—6月，為貝類銷售的淡季轉(zhuǎn)入旺季的時(shí)期，收集到的數(shù)據(jù)相對客觀、準(zhǔn)確。

基于上述結(jié)果，進(jìn)一步計(jì)算了貝類中PFOA的生物可給性及風(fēng)險(xiǎn)商值。其中，選擇可靠的RfD值至關(guān)重要。然而，眾多的環(huán)境保護(hù)機(jī)構(gòu)各自開展毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行建模，最終得出的RfD值差異很大。目前，US EPA的研究數(shù)據(jù)權(quán)威性較高，其針對PFOA的RfD為0.33 μg·kg-1·d-1，已被眾多科研人員采用[32-34]。因此，本研究采用了該RfD值。然而，隨著污染物的日益增多，健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)的結(jié)果愈加需要準(zhǔn)確、客觀。因此，在今后的健康風(fēng)險(xiǎn)調(diào)查中，建議綜合采用多家權(quán)威機(jī)構(gòu)的多套毒理學(xué)數(shù)據(jù)，建立更加精確的數(shù)學(xué)模型，以優(yōu)化RfD值的準(zhǔn)確性。Pachkowski等[35]從免疫毒性這一角度出發(fā)，對PFOS的RfD進(jìn)行推導(dǎo)。Chou和Lin[36]利用PBPK模型和貝葉斯曲線對PFOS的RfD進(jìn)行了修正，修正值介于多家權(quán)威機(jī)構(gòu)給出的建議值之間，該運(yùn)算方式已用于其他全氟烷基類物質(zhì)的RfD推導(dǎo)，PFOA的RfD推導(dǎo)亦可參考。根據(jù)US EPA提供的PFOA的RfD值，對本次調(diào)查樣品進(jìn)行了生物可給性的計(jì)算，發(fā)現(xiàn)其范圍在16.7%～41.9%之間。風(fēng)險(xiǎn)商值均在10-3～10-5數(shù)量級之間，HR值遠(yuǎn)<1，與以往的研究結(jié)果類似[37]?？梢娔z州灣地區(qū)貝類中的PFOA健康風(fēng)險(xiǎn)較低，可以放心食用。

本文僅對貝類中蓄積量相對較高的PFOA進(jìn)行了健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)。海洋環(huán)境中存在著幾十種全氟類化合物的污染。不同類型的全氟類化合物或與其他類型的污染物之間可能會(huì)加強(qiáng)或拮抗污染物的健康風(fēng)險(xiǎn)，這需要進(jìn)一步開展聯(lián)合風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)研究。

面對全球趨于惡化的海洋生態(tài)環(huán)境以及POPs種類的日益增加，建議相關(guān)部門加強(qiáng)管理，開展近海海域環(huán)境及生物樣品中全氟類污染物的定期監(jiān)測，加快推進(jìn)高效、靈敏的防控預(yù)警技術(shù)研發(fā)，加強(qiáng)不同類型污染物的聯(lián)合風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)研究。綜上，本研究對建立全氟類化合物的健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)模型，使得海洋環(huán)境中的全氟化合物污染可防可控，為海洋養(yǎng)殖業(yè)的健康綠色發(fā)展起到一定的積極作用。