腐殖酸對納米氧化鋅致斑馬魚毒性的緩解作用

秦春怡，杜青平，羅宏威，林俊熙，李美君，許燕濱

廣東工業(yè)大學環(huán)境科學與工程學院，廣州 510006

金屬納米顆粒被大量使用在抗菌劑、襪子、枕頭、口罩、清潔劑和洗發(fā)水等個人護理產品中[1]。納米氧化鋅(ZnO-NPs)在消費產品使用的金屬納米顆粒中排名前3位，估計全球年產量在550～33 400 t之間[2]。這些工程化納米粒子的加速生產和使用可能導致其在環(huán)境中釋放，并促進與生態(tài)系統(tǒng)中生物和非生物成分的頻繁相互作用，具有潛在的生物毒性效應[3]。據(jù)報道，ZnO-NPs顆粒與細菌細胞壁或甲殼類動物腸道之間的緊密接觸會導致接觸區(qū)域附近的微環(huán)境發(fā)生變化，生成可能損壞細胞膜的活性氧自由基(ROS)[4]。ZnO-NPs能進入大型溞的基底質膜和腸道肌肉中，且可與大型溞的質膜相互作用，并能穿過上皮屏障進入大型溞細胞內[5]。斑馬魚胚胎暴露在ZnO-NPs中，會造成胚胎孵化率降低，魚鰾缺損，引起斑馬魚的氧化應激，還會通過影響細胞發(fā)育周期過程抑制斑馬魚的正常生長發(fā)育和其他生命活動，甚至導致其死亡[6-7]。然而目前許多研究都是針對納米粒子的單一因素影響，未考慮自然水體中各種非生物因素對納米粒子的遷移轉化及生物毒性的影響。

天然有機物(natural organic matter,NOM)是在水體中廣泛存在的有機混合物，其豐富的羧基和酚羥基等官能團可作為金屬、納米顆粒和其他有機污染物結合的活性位點[8]，增強溶液中納米粒子的分散性和穩(wěn)定性[9]。水體中的NOM大部分是由腐殖酸(humic acid,HA)組成的。HA是天然水體和供水系統(tǒng)中可溶性有機物的主要成分[10]，在水體中的濃度比納米粒子的濃度高出幾個數(shù)量級，可從幾毫克到數(shù)百毫克每升[11-12]，對水體中納米粒子的遷移轉化、生物利用度和毒性起著重要作用[13]。Shang等[14]發(fā)現(xiàn)NOM的存在使細胞內ROS生成濃度降低，從而降低MoS2NPs對大腸桿菌的光毒性。Dai等[15]證實HA可以吸附到ZnO-NPs表面，從而減輕ZnO-NPs對大型溞抗氧化系統(tǒng)的損害。Kteeba等[16]表明加入HA不僅可降低ZnO-NPs誘導的斑馬魚孵化率和存活率降低等毒性效應；而且會緩解ZnO-NPs誘導的發(fā)育毒性[17]。但目前許多研究并未對HA加入后，HA-ZnO-NPs雜化物的物化性質改變及HA緩解ZnO-NPs致斑馬魚毒性效應的作用機理做出系統(tǒng)的解釋。

斑馬魚作為一種模式物種，其胚胎有著體積小，透明度高，易于獲取和維護以及與哺乳動物基因高度同源的優(yōu)點，被廣泛用于藥物和化學物質的生態(tài)毒理學測試的研究中[18]。因此，本研究選用斑馬魚胚胎作為模型生物，以ZnO-NPs及HA作為研究對象，研究了斑馬魚胚胎的存活狀況，并從ZnO-NPs與HA-ZnO-NPs的物化性質和斑馬魚胚胎抗氧化酶活性變化等方面來闡釋ZnO-NPs對斑馬魚的毒性效應及HA對ZnO-NPs致斑馬魚胚胎毒性的緩解機理。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 斑馬魚培養(yǎng)及胚胎收集

成年斑馬魚(來自廣東省實驗動物研究所)在實驗室中馴養(yǎng)超過2個月，自循環(huán)水箱中的水溫控制在(28±2) ℃，光照周期為14 h/10 h，每日喂食2次豐年蝦。產卵前一天停止喂食，將健康的雌、雄魚挑出放在產卵盒中，第2天上午去除隔板并開啟光照，使雌雄成魚在光刺激下產卵受精。受精過程結束后立即收取魚卵，剔除未受精的魚卵后用培養(yǎng)液清洗胚胎。健康魚卵放在培養(yǎng)液中培育，用于實驗。

1.2 實驗藥品的制備及表征

1.2.1 培養(yǎng)液的制備

準確稱取KCl 0.23 g、MgSO4·7H2O 4.93 g、CaCl2·2H2O 11.76 g和NaHCO32.59 g(天津市大茂化學試劑廠，分析純)。用超純水溶解并稀釋至1 L儲備。培養(yǎng)液參照文獻[7]制備，使用前取25 mL，用純水稀釋至1 L作為培養(yǎng)液。培養(yǎng)液取用前充分曝氣，并調節(jié)pH值至7.8±0.2。

1.2.2 ZnO-NPs懸浮液的配制與表征

ZnO-NPs(上海麥克林公司，純度99.9%)，干燥粉末狀，粒徑為(30±10) nm。稱取ZnO-NPs 0.01 g 加入100 mL培養(yǎng)液中，攪拌并超聲(SB-5200，寧波新芝生物科技股份有限公司)30 min，獲得0.1 g·L-1的ZnO-NPs懸浮液，現(xiàn)配現(xiàn)用，并按需要稀釋懸浮液。用納米粒度及Zeta電位分析儀(Zetasizer NANO ZS，英國Malvern)測定ZnO-NPs的分散狀況與Zeta電位值。

1.2.3 HA-ZnO-NPs雜化物的物化性質檢測

HA(上海源葉生物公司)，干燥黑色粉末狀，用傅里葉紅外光譜儀(Nicolet IS50，美國Thermofisher)對其進行表征。0.1 g的HA粉末溶于500 mL pH 11.4的純水中，攪拌2 h。用0.45 μm的聚四氟乙烯濾膜過濾，將溶液pH調至7.8±0.2，定容至1 L后得到0.1 g·L-1的HA儲備液，用總有機碳分析儀(TOC-L CPH，日本島津)檢測得到其有機碳含量為60 mg·L-1，即HA儲備液濃度為60 mg·L-1(以碳計)。

取HA儲備液100 mL，加入ZnO-NPs粉末0.01 g，超聲30 min，攪拌24 h。3 500g離心30 min，真空抽濾泵過0.22 μm的濾膜抽濾。抽濾后用純水沖下濾膜上的粉末，冷凍干燥，得到HA與ZnO-NPs的雜化物(HA-ZnO-NPs)，并用傅里葉紅外光譜儀(FTIR)表征，用納米粒度及Zeta電位分析儀測定其水動力直徑及Zeta電位值。

1.3 胚胎染毒及指標觀察

在六孔板中放置健康胚胎，每孔20枚，每組3組平行，暴露周期為0～96 hpf。用體視顯微鏡(SMZ-745T，尼康)觀察胚胎的生長狀況，并記錄存活率等指標。實驗所用稀釋液均為培養(yǎng)液，暴露實驗分為以下組別。(1)ZnO-NPs暴露：超聲處理后的ZnO-NPs懸浮液按照濃度梯度法，稀釋為1、5、10和20 mg·L-1，并以配制好的培養(yǎng)液作為對照組暴露，以探究ZnO-NPs對斑馬魚胚胎的毒性影響。(2)ZnO-NPs和HA暴露：選擇20 mg·L-1的ZnO-NPs懸浮液與0、3、6、12和24 mg·L-1(以碳計)的HA對胚胎進行聯(lián)合暴露，以探究HA對ZnO-NPs毒性的緩解作用。

1.4 氧化應激酶活性測試

將收集洗凈的胚胎放入培養(yǎng)皿中(每個培養(yǎng)皿100枚胚胎)，按實驗組別分別加入ZnO-NPs和HA試驗液，每個濃度設置3組平行。待暴露24 h后，每個培養(yǎng)皿取60枚左右的胚胎，加入生理鹽水中冰勻漿，8 000 r·min-1離心10 min取上清液，并按照試劑盒(南京建成工程研究所)所述試驗方法測定超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

在體式顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育，拍照記錄，統(tǒng)計胚胎存活率等毒理學終點指標。使用SPSS 20.0進行回歸計算，得出LC50；組間比較采用單因素方差分析法(One Way ANOVA)分析，并以Tukeys做多重比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01；并用Origin 8.5進行作圖。

2 結果(Results)

2.1 ZnO-NPs與HA的相互作用的FTIR光譜圖

HA具有豐富的親水基團，易于被納米材料吸附，使得納米材料在水中穩(wěn)定性得到提高。使用傅里葉紅外光譜儀對HA、ZnO-NPs和HA-ZnO-NPs的表面官能團進行檢測，結果如圖1所示。

圖1 ZnO-NPs、HA和HA-ZnO-NPs的FTIR光譜圖注：ZnO-NPs表示納米氧化鋅；HA表示腐殖酸；HA-ZnO-NPs表示HA與ZnO-NPs的雜化物。Fig.1 FTIR spectra of ZnO-NPs,HA and HA-ZnO-NPsNote:ZnO-NPs stands for ZnO nanoparticles;HA stands for humic acid;HA-ZnO-NPs stands for mixed compound of HA and ZnO-NPs.

2.2 HA-ZnO-NPs的穩(wěn)定性分析

動態(tài)光散射是通過測量樣品散射光強的變化來分析樣品顆粒大小和穩(wěn)定性信息的一種技術，常應用于表征懸浮液中納米顆粒的尺寸。對不同濃度的ZnO-NPs和HA-ZnO-NPs進行Zeta電位及DLS測試，結果如圖2所示。

研究證實Zeta電位絕對值的大小與懸浮液的穩(wěn)定性和分散性相關，當Zeta電位絕對值>30 mV時認為懸浮液具有良好的穩(wěn)定性[21]。ZnO-NPs的Zeta電位值均為負值，表明ZnO-NPs帶有一定的弱負電荷。由圖2(a)可知，懸浮液的Zeta電位絕對值隨著ZnO-NPs濃度的增加而減少，且Zeta電位絕對值均低于22 mV。這表明ZnO-NPs懸浮液穩(wěn)定性較差。從懸浮液中ZnO-NPs的水動力直徑可見，隨著ZnO-NPs濃度增大，其水動力直徑增大，表明ZnO-NPs在溶液中有聚集傾向，呈現(xiàn)一定的劑量-效應關系。聚集到一定程度懸浮液的穩(wěn)定性降低，這與Zeta電位的結果一致。

由圖2(b)可知，在20 mg·L-1的ZnO-NPs中加入HA后，ZnO-NPs表面負電荷增加，懸浮液Zeta電位絕對值均增大，且隨著HA濃度增大Zeta電位絕對值增大。當HA濃度>3 mg·L-1時，各組的Zeta電位絕對值均>30 mV。從水動力直徑與HA濃度之間的關系可見，隨著HA濃度增大，懸浮液顆粒物的水動力直徑減少。由結果可知，在ZnO-NPs溶液中加入HA后，懸浮液中大顆粒數(shù)量減少，Zeta電位絕對值增大，ZnO-NPs的分散性良好，表明HA增加了ZnO-NPs懸浮液的穩(wěn)定性。

圖2 不同暴露組水動力直徑與Zeta電位變化注：(a) ZnO-NPs；(b) ZnO-NPs (20 mg·L-1)+HA。Fig.2 Hydrodynamic diameters and Zeta potential change of different exposure groupsNote:(a) ZnO-NPs;(b) ZnO-NPs (20 mg·L-1)+HA.

2.3 ZnO-NPs和HA-ZnO-NPs對斑馬魚胚胎的存活率的影響

用不同濃度的ZnO-NPs和HA-ZnO-NPs對斑馬魚胚胎進行暴露，96 hpf內的存活率如圖3所示。

由圖3(a)可知，ZnO-NPs對斑馬魚胚胎暴露染毒后，胚胎的存活率隨著ZnO-NPs的濃度升高而下降，且暴露時間越長，胚胎存活率越低。根據(jù)概率單位法計算得到，ZnO-NPs對斑馬魚的半數(shù)致死濃度(LC50)約為3.86 mg·L-1。除1 mg·L-1組外，各實驗組96 hpf的胚胎存活率均低于40%，與對照組相比，有顯著的統(tǒng)計學下降(P<0.01)，尤其ZnO-NPs為20 mg·L-1處理組的胚胎96 hpf存活率僅3%左右。由圖3(b)可知，在ZnO-NPs中加入HA后，斑馬魚胚胎存活率升高，且在相同ZnO-NPs(20 mg·L-1)的處理下，斑馬魚的存活率隨著HA濃度增高而增高。在HA濃度達到6 mg·L-1以上，各實驗組的96 hpf胚胎存活率高于80%，當24 mg·L-1時，斑馬魚胚胎存活率幾乎與對照組相當。這表明HA對ZnO-NPs引起的胚胎存活率影響有一定的緩解作用。

圖3 不同濃度組斑馬魚胚胎存活率注：(a) ZnO-NPs，(b) ZnO-NPs (20 mg·L-1)+HA；*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig.3 Survival rate of zebrafish exposed to different concentrations of ZnO-NPs and HANote:(a) ZnO-NPs,(b) ZnO-NPs (20 mg·L-1)+HA;*represents P<0.05,**represents P<0.01.

2.4 HA對ZnO-NPs致斑馬魚胚胎表面附著情況的影響

對ZnO-NPs和HA-ZnO-NPs培養(yǎng)液中斑馬魚胚胎的表面結構進行顯微鏡觀察，結果如圖4所示。

由圖4可知，暴露在ZnO-NPs懸浮液中的斑馬魚胚胎(圖4(a)～4(c))表面絨毛膜上附著了許多團聚物，這些團聚物隨著時間的增長而有所增多，在48 hpf的胚胎絨毛膜上各實驗組幾乎都發(fā)現(xiàn)了附著超過1 μm的團聚物。而在HA-ZnO-NPs處理組中，懸浮液中ZnO-NPs分布均勻，在斑馬魚胚胎的表面也未看見明顯的團聚物附著(圖4(d)～4(f))，在48 hpf后的斑馬魚胚胎表面絨毛膜上只有少量的聚集粒子。在劉倩等[22]的研究中，發(fā)現(xiàn)ZnO-NPs在大型溞表面的附著，并造成了大型溞體表的損傷。納米顆粒在生物體表面的粘附對其毒性起著至關重要的作用[23]。在斑馬魚胚胎發(fā)育早期，胚胎尚未從絨毛膜中孵化，主要沉于容器的底部。由于ZnO-NPs在水中的易沉聚特性導致了納米顆粒團聚物在容器底部聚集，增加了胚胎與納米顆粒的接觸概率，增強了其毒性。在加入HA后，ZnO-NPs的Zeta電位絕對值升高至30 mV以上，且水動力直徑減少，表明納米顆粒在水中變得更穩(wěn)定，聚集現(xiàn)象減少，從而減少了納米顆粒在胚胎表面的附著。

圖4 ZnO-NPs在斑馬魚胚胎表面的附著注：(a)～(c) ZnO-NPs 10 mg·L-1；(d)～(f) HA (24 mg·L-1)+ZnO-NPs (20 mg·L-1)。Fig.4 ZnO-NPs adhere on embryo surface of zebrafishNote:(a)～(c) ZnO-NPs 10 mg·L-1;(d)～(f) HA (24 mg·L-1)+ZnO-NPs (20 mg·L-1).

2.5 HA對ZnO-NPs導致的胚胎發(fā)育氧化應激的緩解作用

金屬氧化物納米顆粒通常會誘導生物體內產生過量的ROS，體內產生的ROS若不及時清除，會導致生物體氧化損傷[24]。據(jù)報道，ZnO-NPs除了因在斑馬魚胚胎表面聚集而導致胚胎毒性外，對生物體的另一毒性機制主要是導致生物體內ROS的產生[25]。通常，細胞中ROS的產生和清除處于動態(tài)平衡中，抗氧化酶(CAT、SOD等)對清除體內自由基、維持ROS的平衡和激活生物體氧化應激起著重要的作用[26]。因此對ZnO-NPs和HA-ZnO-NPs暴露條件下斑馬魚胚胎的CAT與SOD酶活性進行測定，結果如圖5所示。

由圖5(a)可知，暴露于ZnO-NPs處理的各組中斑馬魚胚胎體內CAT和SOD酶活性均升高，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。CAT與SOD均在10 mg·L-1的ZnO-NPs組中酶活性最高。與對照組相比，5、10和20 mg·L-1的ZnO-NPs實驗組呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)。由圖5(b)可知，在加入HA的實驗組中，與20 mg·L-1ZnO-NPs處理組相比，CAT和SOD酶活性水平隨HA濃度增加呈下降趨勢，在HA為12 mg·L-1和24 mg·L-1的實驗組中，CAT與SOD酶活水平回落，與對照組相比，無顯著性差異。從實際應用角度出發(fā)，12 mg·L-1的HA為最佳處理濃度。

圖5 斑馬魚胚胎暴露于ZnO-NPs(a)和HA-ZnO-NPs(b)的過氧化氫酶(CAT)與超氧化物歧化酶(SOD)活性注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig.5 Catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) enzyme activities of zebrafish exposed to ZnO-NPs (a) and HA-ZnO-NPs (b)Note:*represents P<0.05,**represents P<0.01.

3 討論(Discussion)

水體中廣泛存在的天然有機物，如HA，含有豐富的羧基和酚羥基等官能團，可與進入水體的各種污染物發(fā)生反應。關于金屬納米粒子與水體中HA反應及作用機理尚不清晰。據(jù)報道，自然界中存在的HA對納米粒子的遷移轉化途徑有著不可忽視的影響，這些影響往往改變了納米粒子的物理化學性質，從而導致其對水生生物的毒性影響發(fā)生改變。本研究證實ZnO-NPs在水中極不穩(wěn)定，易團聚成大顆粒。在ZnO-NPs懸浮液中加入HA后，懸浮液中大顆粒數(shù)量減少，Zeta電位絕對值增大，水動力直徑減少，增加了ZnO-NPs的穩(wěn)定性。

以不同濃度的ZnO-NPs對斑馬魚胚胎進行暴露后，斑馬魚胚胎的存活率與ZnO-NPs的濃度存在

一定的劑量-效應關系。經(jīng)計算ZnO-NPs對斑馬魚的LC50約為3.86 mg·L-1。20 mg·L-1的ZnO-NPs處理下胚胎96 hpf存活率僅3%左右。斑馬魚胚胎暴露于ZnO-NPs中，還誘發(fā)了一系列發(fā)育畸形效應，如尾部畸形、脊柱彎曲等，這與Nasrallah等[27]和Suriyaprabha等[28]的研究結果相似。這表明ZnO-NPs對斑馬魚胚胎具有早期階段發(fā)育毒性。以不同濃度的HA加入20 mg·L-1的ZnO-NPs懸浮液中，隨著HA濃度(0～24 mg·L-1)的升高，斑馬魚的存活率升高，當HA濃度>6 mg·L-1，胚胎96 hpf的存活率高于80%。這表明HA可以降低ZnO-NPs對斑馬魚胚胎的毒性。Kteeba等[16]的研究也發(fā)現(xiàn)，不同種類的NOM中，HA對納米粒子致斑馬魚胚胎毒性的緩解作用最明顯。為進一步探討HA緩解ZnO-NPs致斑馬魚胚胎毒性作用的機理，本研究通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)，ZnO-NPs的實驗組中斑馬魚胚胎絨毛膜表面均附著了許多ZnO-NPs的團聚體。納米顆粒的粘附不僅會造成生物有機體的表體損傷，還會堵塞斑馬魚胚胎絨毛膜表面的孔隙，使胚胎內部環(huán)境的氧濃度降低[29]。斑馬魚胚胎絨毛膜的孔隙直徑為0.7 μm左右[30]，這便使得水動力直徑<0.7 μm的ZnO-NPs與HA-ZnO-NPs粒子都有機會通過胚胎絨毛膜的孔隙進入胚胎內部。但是斑馬魚胚胎的絨毛膜具有化學反應活性，可以調控納米粒子進入胚胎的方式[31]，所以不能簡單地視其為胚胎外層的物理屏障。納米粒子附著在胚胎絨毛膜上，會對斑馬魚胚胎絨毛膜造成損傷，進而破壞絨毛膜的調控能力[29]。而加入HA之后，斑馬魚胚胎絨毛膜表面團聚體明顯減少，這與Zeta電位和水動力直徑的研究結果一致，表明HA的加入使ZnO-NPs穩(wěn)定地分散在懸浮液中，減少了其團聚并沉積到容器底部的幾率，進一步減少了沉在容器底部的斑馬魚胚胎與ZnO-NPs的接觸。HA減少了納米粒子在胚胎絨毛膜表面的粘附，則減輕了ZnO-NPs對絨毛膜的損傷，從而使納米粒子的生物利用率降低，毒性得到緩解[32]。

在前期研究中，ZnO-NPs會誘導生物體內產生過量的ROS[33]，導致斑馬魚胚胎的抗氧化酶活性的增加[22]。ROS的增加會對有機體造成傷害，而SOD和CAT是維持體內氧化還原平衡的關鍵抗氧化酶。SOD將體內增加的ROS歧化為過氧化氫，再由CAT催化過氧化氫，降解或還原為水和氧分子[34]。本研究中，ZnO-NPs各實驗組均提高了斑馬魚胚胎的SOD、CAT酶活，除1 mg·L-1的ZnO-NPs實驗組外，各組酶活性與對照組相比均呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)，這表明ZnO-NPs激發(fā)了斑馬魚胚胎產生氧化應激。HA的加入可以使CAT與SOD酶活性水平回落，在加入12 mg·L-1與24 mg·L-1HA的實驗組中，斑馬魚體內的CAT與SOD酶活性水平與對照組相比均無顯著性差異；此時，HA的濃度雖成倍增加，但斑馬魚體內的抗氧化酶活性水平無顯著差異，所以從實際應用角度考慮，12 mg·L-1的HA為最佳處理濃度。當ZnO-NPs導致機體內產生過量ROS時，生物體內CAT與SOD酶活性會升高，以清除過量的ROS[19]。而HA可以作為抗氧化劑與細胞內ROS發(fā)生反應，顯著降低生物有機體內的自由基水平，使生物體內的抗氧化防御系統(tǒng)恢復平衡[29]，因此，氧化應激的SOD與CAT活性逐漸恢復正常，這與Zhang等[19]的研究結果一致。

總之，懸浮液中HA的存在對ZnO-NPs致斑馬魚胚胎毒性有一定的緩解作用，在研究納米粒子的生物毒性時，除考慮濃度的累積效應外，還應把環(huán)境中的其他生態(tài)因子的影響納入考慮，進行全面評估，可避免對其在環(huán)境中的潛在毒性造成過高或過低的評價。