雙酚芴對斑馬魚神經(jīng)行為的影響及毒性作用機制

張鵬宇，王寶堃，劉可春，靳夢,*

1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物研究所山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點實驗室，濟南 250103

2.華北理工大學(xué)心理與精神衛(wèi)生學(xué)院，唐山 063200

雙酚芴(9,9-bis(4-hydroxyphenyl)fluorine,BHPF)是雙酚A(BPA)的替代物之一，現(xiàn)已廣泛用于塑料產(chǎn)品的生產(chǎn)。因為BHPF能夠較好地替代BPA，所以常用在與食物接觸的材料或容器中，包括飲水瓶、奶瓶和嬰兒水瓶等[1-2]。2018年加拿大聯(lián)邦水質(zhì)指南將BPA水中安全濃度規(guī)定為3 500 ng·L-1[3]。研究發(fā)現(xiàn)，加拿大淡水樣本的BPA濃度范圍為3.05～1 888.51 ng·L-1，五大湖流域中BPA含量最高的3個流域中，其濃度分別為309.4、217.6和184.2 ng·L-1。另有研究發(fā)現(xiàn)[4]，慢性低劑量BPA(50 ng·L-1和500 ng·L-1)暴露能夠影響斑馬魚對復(fù)雜環(huán)境的適應(yīng)能力。考慮到BHPF在食品容器加工中的廣泛應(yīng)用，特別是兒童用品，因此人們格外關(guān)注其對環(huán)境和健康的潛在影響。在長期使用BHPF飲料瓶的飲水人群血清中檢測到了BHPF，說明BHPF可以從塑料瓶釋放到飲用水中從而進入人和動物體內(nèi)。此外，Zhang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，即使在BPA無毒劑量下，BHPF仍可以干擾內(nèi)分泌，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗雌激素效應(yīng)。以上研究表明，BHPF可以進入動物和人體內(nèi)，對生物體健康產(chǎn)生潛在影響，并且BHPF可能具有強于BPA的毒性效應(yīng)。Jiao等[1]研究發(fā)現(xiàn)，BHPF能夠抑制小鼠和豬卵母細胞減數(shù)分裂進程，造成卵母細胞內(nèi)紡錘體組裝異常、微絲構(gòu)建紊亂、線粒體功能異常、能量水平下降、過氧化物水平升高和早期凋亡發(fā)生等。另外還發(fā)現(xiàn)BHPF可以通過改變卵母細胞內(nèi)組蛋白修飾水平和皮質(zhì)顆粒分布影響卵母細胞質(zhì)量。

近些年，隨著我國經(jīng)濟的不斷發(fā)展，水環(huán)境污染問題日趨嚴(yán)重。環(huán)境中各種污染物在水體中的積累不僅會對水生生物的生存構(gòu)成威脅，同時也會對人類的健康造成直接或間接的影響[6]。諸多研究表明[7]，環(huán)境污染物可以對生物體的行為以及神經(jīng)系統(tǒng)造成不同程度的影響。斑馬魚因其體型小、繁殖快、胚胎透明和對水環(huán)境的變化十分敏感等特點，被廣泛用于水體環(huán)境中污染物毒性的檢測。還因其具有與人類神經(jīng)系統(tǒng)高度相似的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能[8]，而被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)毒性研究。在神經(jīng)發(fā)育方面，斑馬魚發(fā)育至第5天就能夠自主運動，便于對其行為活動進行實時監(jiān)測，這一優(yōu)勢是其他脊椎動物不能替代的。值得注意的是，斑馬魚對于毒性的敏感性在一定程度上高于哺乳動物，表明斑馬魚對于檢測一些低毒或者毒性表現(xiàn)不明顯的物質(zhì)具有重要意義[9]。本課題組前期基于斑馬魚模型的研究發(fā)現(xiàn)[10]，BHPF對下丘腦-垂體-甲狀腺軸產(chǎn)生毒物興奮效應(yīng)，破壞髓鞘形成。在此基礎(chǔ)上，本論文以斑馬魚成魚為模型，開展黑白箱測試、新型水槽測試和T迷宮測試并對神經(jīng)發(fā)育、自噬和凋亡相關(guān)基因進行檢測，探究BHPF的神經(jīng)毒性和作用機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

1.1.1 試劑

RNA試劑盒(RN2802，北京艾德萊生物科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(近岸蛋白質(zhì)科技有限公司)；熒光定量PCR試劑盒(RR036A、RR091A TaKaRa公司)。

1.1.2 儀器

斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(Z-A-S5，上海海圣公司)；Zebrabox斑馬魚行為分析儀(Viewpoint公司)；實時熒光定量PCR儀器(13720，羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)；C1000 Touch梯度PCR儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)；超微量分光光度計(NDoneC，基因有限公司)。

1.1.3 動物

野生型成年斑馬魚AB由山東省科學(xué)院生物研究所提供，將斑馬魚養(yǎng)殖在水溫28℃的系統(tǒng)中進行培養(yǎng)，每天給予14 h照明∶10 h黑暗的光照交替，早晚定點喂食。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及處理

將野生型成年斑馬魚AB隨機分為3組：空白對照組、0.1 μg·L-1BHPF組、1 μg·L-1BHPF組。設(shè)置3個平行組，每組4條，連續(xù)給藥3周，每隔24 h換一次藥，給藥后將斑馬魚放置于恒溫28 ℃，14 h光照∶10 h黑暗的魚房進行培養(yǎng)。

1.2.2 行為學(xué)檢測

1.2.2.1 黑白箱測試

黑白箱是一個長22 cm寬14 cm高14 cm的長方體水箱。水箱一側(cè)用黑色塑料袋在外圍包裹起來，使缸內(nèi)呈現(xiàn)黑暗狀態(tài)，另一側(cè)用白紙包裹起來，使缸內(nèi)呈現(xiàn)較明亮狀態(tài)，之后將水箱放置在LED燈箱上，抽出水箱中間的擋板，將斑馬魚放入水箱中，每次一條。斑馬魚放入水箱中先靜置10 min使其適應(yīng)環(huán)境，當(dāng)斑馬魚游至黑白分界線時開始計時，記錄時間為3 min，觀察和分析成年斑馬魚在黑、白箱中游動的距離和時間。

1.2.2.2 新型水槽測試

新型水槽實驗在一個長22 cm寬14 cm高14 cm的長方體透明水槽中進行，并將其放置在LED燈箱前面。在水箱外壁畫一條中線，將水箱分成上下2個相等的部分，中線以上為上部區(qū)域，中線以下為下部區(qū)域。將斑馬魚放入水槽中，每次一條，斑馬魚在水槽中靜置10 min使其適應(yīng)環(huán)境，之后當(dāng)斑馬魚游至水槽中線時開始記錄，記錄時間為3 min，觀察和分析斑馬魚在上、下區(qū)域游動的時間和距離。

1.2.2.3 T迷宮測試

T迷宮檢測裝置的起始臂21 cm，長臂20 cm，短臂11 cm，同時有4個6 cm3的深水區(qū)，深水區(qū)比其他手臂深4 cm，都是由不透明的塑料板組成，深水區(qū)是一個不透明的黑色區(qū)域，健康斑馬魚更偏好于黑暗深水環(huán)境。將T迷宮放置于LED燈箱上，先對每只斑馬魚進行訓(xùn)練，待斑馬魚游到深水區(qū)時，將其撈出換下一條繼續(xù)訓(xùn)練，所有斑馬魚訓(xùn)練結(jié)束后，開始觀察和分析斑馬魚在起始臂、長臂、短臂和進入深水區(qū)的距離和時間，每條斑馬魚的實驗時間為5 min。

1.2.3 熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)

在行為學(xué)檢測后，將每組成年斑馬魚取腦，魚腦按組別放置EP管中，每組取2個魚腦用PBS沖洗2～3次，加入裂解液，在破碎機中充分研磨，使其完全裂解，然后將研磨后的裂解物放入離心機中離心，取上清液。RNA提取后，利用超微量分光光度計檢測不同組別RNA的濃度，檢測得到的結(jié)果A260/A280應(yīng)在2.0～2.5之間；之后立即使用C1000 Touch梯度PCR儀將RNA進行反轉(zhuǎn)，將反轉(zhuǎn)得到的cDNA進行稀釋，然后加入相應(yīng)的引物用實時熒光定量PCR儀對各個基因進行擴增，以rpl13a為內(nèi)參基因(表1)。Real-time PCR擴增結(jié)束后，用2-ΔΔCt相對定量法計算各組基因的相對表達量。

表1 Real-time PCR所需引物序列信息Table 1 Primer sequence for real-time PCR

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

利用Graphpad prism 7.0軟件對實驗結(jié)果進行One-way ANOVA檢驗，以Correct for multiple comparisons using statistical hypothesis testing.(Bonferroni)進行組間比較，并以Mean±SEM表示。

2 結(jié)果(Results)

2.1 黑白箱測試結(jié)果提示BHPF造成斑馬魚運動能力異常

黑白箱測試結(jié)果顯示健康成年斑馬魚更偏好在黑暗區(qū)域中運動，且運動能力正常。0.1 μg·L-1BHPF處理后的斑馬魚運動能力下降，而1 μg·L-1BHPF組斑馬魚運動能力有所提高，提示低濃度BHPF可能對斑馬魚運動能力產(chǎn)生更加顯著的影響。與空白對照組相比，0.1 μg·L-1BHPF組和1 μg·L-1BHPF組斑馬魚在黑暗區(qū)域的運動距離/總距離、黑暗區(qū)域的運動時間/總時間的比值雖有下降趨勢，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。該實驗結(jié)果提示，BHPF能夠?qū)е掳唏R魚運動能力異常，但對認知能力無顯著影響。

2.2 新型水槽測試結(jié)果提示BHPF引起斑馬魚探索行為異常

新型水槽實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)BHPF處理后的斑馬魚運動軌跡出現(xiàn)了明顯變化，與空白對照組相比，1 μg·L-1BHPF組斑馬魚在水缸上部區(qū)域運動軌跡顯著增加，斑馬魚表現(xiàn)出行為異常(圖2(a))。經(jīng)過數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，1 μg·L-1BHPF組斑馬魚在上部區(qū)域的運動距離/總距離、上部區(qū)域的運動時間/總時間的比值均顯著增加，具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2(b)和(c))。0.1 μg·L-1BHPF組斑馬魚在上部區(qū)域的運動距離/總距離的比值和上部區(qū)域的運動時間/總時間的比值雖都有變化，但均不具有統(tǒng)計學(xué)意義。綜上所述，在新型水槽實驗中，BHPF引起斑馬魚探索行為異常。

圖2 BHPF造成斑馬魚探索行為異常注：(a) 新型水槽測試中斑馬魚的運動軌跡；紅線表示快速運動(v>5 cm·s-1)，綠線表示中速運動(2 cm·s-1≤v≤5 cm·s-1)，黑線表示慢速運動(v<2 cm·s-1)；(b) 不同組斑馬魚在水槽上部區(qū)域運動距離與在整個水槽內(nèi)運動總距離的比值；(c) 不同組斑馬魚在水槽上部區(qū)域運動時間與在整個水槽內(nèi)運動總時間的比值；*表示與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig.2 BHPF induced abnormal exploration behavior of zebrafishNote:(a) Zebrafish swimming path in novel tank diving tests;red line indicates fast movement (v>5 cm·s-1),green line indicates medium speed movement (2 cm·s-1≤v≤5 cm·s-1),and black line indicates slow speed movement (v<2 cm·s-1);(b) The ratio of distance (top/total) of zebrafish in novel tank diving tests;(c) The ratio of duration (top/total) of zebrafish in novel tank diving tests;*P<0.05 indicates significant difference compared with blank control group.

2.3 T迷宮測試結(jié)果提示BHPF造成斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力損傷

通過T迷宮測試，探究BHPF對斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力的影響。與空白對照組相比，0.1 μg·L-1BHPF組斑馬魚在T迷宮中運動軌跡明顯減少，抑制了斑馬魚的運動能力；1 μg·L-1BHPF組斑馬魚運動軌跡顯著增加，出現(xiàn)運動過度活躍現(xiàn)象并且在錯誤臂出現(xiàn)的次數(shù)增多(圖3(a))。通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，0.1 μg·L-1BHPF組斑馬魚在錯誤臂的運動距離/總距離、錯誤臂運動時間/總時間的比值均增加，但不具有統(tǒng)計學(xué)意義；而1 μg·L-1BHPF組斑馬魚在錯誤臂的運動距離/總距離、錯誤臂的運動時間/總時間的比值均顯著增加，具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3(b)和(c))。以上實驗結(jié)果提示，BHPF對斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力造成了損傷。

圖3 BHPF影響斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力注：(a) T迷宮測試中斑馬魚的運動軌跡；紅線表示快速運動(v>5 cm·s-1)，綠線表示中速運動(2 cm·s-1≤v≤5 cm·s-1)，黑線表示慢速運動(v<2 cm·s-1)；(b) 不同組斑馬魚在T迷宮錯誤臂運動距離與在整個水槽內(nèi)運動總距離的比值；(c) 不同組斑馬魚在T迷宮錯誤臂運動時間與在整個水槽內(nèi)運動總時間的比值；*表示與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig.3 BHPF had adverse effects on learning and memory ability of zebrafishNote:(a) Zebrafish swimming path in T-maze tests;red line indicates fast movement (v>5 cm·s-1),green line indicates moderate movement (2 cm·s-1≤v≤5 cm·s-1),and black line indicates slow movement (v<2 cm·s-1);(b) The ratio of distance (wrong direction/whole arena) of zebrafish in T-maze tests;(c) The ratio of duration (wrong direction/whole arena) of zebrafish in T-maze tests;*P<0.05 indicates significant difference compared with blank control group.

2.4 BHPF影響神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的表達

為進一步探究BHPF造成斑馬魚行為異常的神經(jīng)毒性作用機制，本研究利用qRT-PCR從神經(jīng)發(fā)育、自噬和凋亡3個方面對斑馬魚腦內(nèi)相關(guān)基因進行檢測。與空白對照組相比，低、高濃度BHPF處理組c-fos(c-proto-oncogene protein)、syn2a(synchronous2a)、tuba1b(tubulin alpha-1b chain)、mbp(myelin basic protein)和gfap(glial fibrillary acidic protein)的表達顯著上調(diào)，且具有濃度依賴性(圖4)。研究結(jié)果提示，BHPF影響斑馬魚腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因表達。

圖4 BHPF對神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因表達的影響注：與空白對照組相比差異顯著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Fig.4 Effects of BHPF on the expression of neurodevelopment-related genesNote:Compared with blank control group,there is significant difference,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

2.5 BHPF影響凋亡相關(guān)基因的表達

為探究BHPF引起的神經(jīng)毒性是否與凋亡機制相關(guān)，本研究對cytoC(cytochrome C)、apaf1 (apoptotic protease activating factor-1)、bax(bcl2-associated x protein)、caspase8 (cysteinyl aspartate specific proteinase8)、p53 (tumor suppressor gene)、caspase9 (cysteinyl aspartate specific proteinase9)和caspase3 (cysteinyl aspartate specific proteinase3)基因進行檢測(圖5)。與空白對照組相比，0.1 μg·L-1BHPF組apaf1、cytoC、bax、caspase8、p53、caspase9和caspase3表達上調(diào)，但apaf1和bax表達差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。與空白對照組相比，1 μg·L-1BHPF組apaf1、cytoC、bax、caspase8、p53、caspase9和caspase3表達均顯著上調(diào)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果提示，BHPF可以調(diào)控斑馬魚腦內(nèi)凋亡相關(guān)基因，并且隨著濃度增加，BHPF對基因表達的影響越顯著。

圖5 BHPF對凋亡相關(guān)基因表達的影響注：與空白對照組相比差異顯著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Fig.5 Effects of BHPF on the expression of apoptosis-related genesNote:Compared with blank control group,there is significant difference,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

2.6 BHPF影響自噬相關(guān)基因的表達

為探究BHPF產(chǎn)生神經(jīng)毒性是否與自噬機制有關(guān)，對atg5 (autophagyrelated gene 5)、beclin1、ulk2 (unc-51-like kinase 2)和parkin進行檢測(圖6)。與空白對照組相比，0.1 μg·L-1BHPF組和1 μg·L-1BHPF組的atg5、beclin1、ulk2和parkin基因的表達以濃度依賴方式上調(diào)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果提示，BHPF可以通過影響斑馬魚腦內(nèi)自噬相關(guān)基因從而導(dǎo)致神經(jīng)毒性。

圖6 BHPF對自噬相關(guān)基因表達的影響注：與空白對照組相比差異顯著，**P<0.01，***P<0.001。Fig.6 Effects of BHPF on autophagy related gene expressionNote:Compared with blank control group,there is significant difference,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

3 討論(Discussion)

為探究BHPF對環(huán)境和生物健康的潛在威脅，本研究以斑馬魚成魚為模型，進行了神經(jīng)行為學(xué)和相關(guān)基因檢測，以揭示BHPF誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性和內(nèi)在機制。黑白箱測試主要對斑馬魚的認知能力進行檢測，健康成年斑馬魚更偏好于黑暗環(huán)境，而不喜歡明亮環(huán)境；新型水槽測試對斑馬魚探索能力進行檢測，健康成年斑馬魚的探索欲望更強，在水槽上部運動更加活躍；T迷宮測試檢驗斑馬魚的學(xué)習(xí)記憶能力，健康成年斑馬魚通過訓(xùn)練能夠減少游到深水區(qū)的時間和游到錯誤區(qū)的次數(shù)。3種行為學(xué)測試探究的都是斑馬魚的神經(jīng)損傷情況，三者之間具有相互作用關(guān)系，本研究發(fā)現(xiàn)黑白箱測試中BHPF對斑馬魚運動能力產(chǎn)生影響；新型水槽測試顯示BHPF使斑馬魚探索欲望降低，進一步說明BHPF可以對斑馬魚運動能力產(chǎn)生影響；T迷宮測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BHPF不僅對斑馬魚運動能力產(chǎn)生影響還會對斑馬魚學(xué)習(xí)記憶造成損傷。以往研究利用斑馬魚新型水槽測試揭示了BHPF的抗雌激素毒性[11]。T迷宮測試顯示了BPA另一種替代物雙酚AF(4,4’-六氟-2-二酚，BPAF)使斑馬魚在錯誤臂出現(xiàn)次數(shù)增加，揭示了BPAF對斑馬魚產(chǎn)生神經(jīng)毒性效應(yīng)[12]。Li等[4]研究發(fā)現(xiàn)，健康成年斑馬魚與紅色相比更偏好綠色區(qū)域，50 ng·L-1BPA處理后的斑馬魚對綠色和紅色沒有明顯的偏好，但運動能力降低；當(dāng)BPA濃度達到500 ng·L-1時，雖仍然沒有明顯的顏色偏好，但運動開始恢復(fù)到正常水平。同樣在紅色與藍色偏好測試中發(fā)現(xiàn)，健康成年斑馬魚更偏好紅色區(qū)域，50 ng·L-1BPA處理后的斑馬魚對紅色和藍色沒有明顯的偏好，但運動能力降低；當(dāng)BPA濃度達到500 ng·L-1時，雖然仍然沒有對紅色或藍色的偏好，但運動開始恢復(fù)到正常水平。究其原因可能在于低濃度BPA可使血清素陽性神經(jīng)元數(shù)量減少得更加明顯，從而造成斑馬魚運動能力降低。上述行為學(xué)測試結(jié)果與本研究結(jié)果相似，黑白箱測試和新型水槽測試中低濃度BHPF可以對斑馬魚行為運動產(chǎn)生影響，T迷宮實驗BHPF可以對斑馬魚學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生損傷，提示BHPF誘導(dǎo)斑馬魚成魚的神經(jīng)毒性。研究發(fā)現(xiàn)，BHPF處理組使神經(jīng)發(fā)育、自噬和凋亡相關(guān)基因表達顯著上調(diào)，這與之前有毒化合物暴露對斑馬魚的影響的研究結(jié)果相類似。韓沐汐等[13]研究發(fā)現(xiàn)，氯化銻處理的斑馬魚凋亡和自噬相關(guān)基因表達顯著上調(diào)。又有研究表明[14]，鉛暴露導(dǎo)致斑馬魚神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因過表達。本研究的主要目的是探究BHPF對斑馬魚產(chǎn)生的神經(jīng)毒性及作用機制，但是探討B(tài)HPF和BPA的毒性效應(yīng)差異及內(nèi)在機制對于水生環(huán)境的監(jiān)測和人類健康發(fā)展也是至關(guān)重要的。因此，本課題組今后的研究重點將會詳細比較和分析BHPF和BPA的毒性效應(yīng)差異和內(nèi)在機制。

c-fos是斑馬魚神經(jīng)元興奮性的標(biāo)志物[15]；gfap表達上調(diào)可產(chǎn)生神經(jīng)毒性[16]；tuba1b在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用；mbp在斑馬魚胚胎發(fā)育階段的神經(jīng)系統(tǒng)中表達豐富。syn2a是哺乳動物突觸形成的生物標(biāo)志物，在突觸發(fā)生和神經(jīng)遞質(zhì)釋放中發(fā)揮重要作用[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)，BHPF對c-fos、gfap、tuba1b、mbp和syn2a等神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的表達具有調(diào)控作用，上述基因表達上調(diào)提示BHPF可能通過影響神經(jīng)元活動、中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、突觸的發(fā)生和神經(jīng)遞質(zhì)釋放產(chǎn)生神經(jīng)毒性。

細胞凋亡是一種繼發(fā)性程序化死亡過程，多種基因參與調(diào)控，其中bax是啟動凋亡的關(guān)鍵基因[18]，隨著死亡信號的刺激，促凋亡蛋白BAX直接被激活，隨后移位至線粒體并形成同源二聚體通道，促進CYTO C釋放至胞漿導(dǎo)致APAF1活化，從而使CASPASE蛋白激活并誘導(dǎo)細胞凋亡。p53能通過激活促凋亡因子，同時抑制抗凋亡因子增加線粒體通透性并參與凋亡程序[19]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BHPF使apaf1、cytoC、bax、caspase3、caspase8、caspase9和p53凋亡相關(guān)基因表達上調(diào)，提示BHPF可以通過誘導(dǎo)細胞凋亡產(chǎn)生神經(jīng)毒性。

自噬是細胞進化的正常生理過程[20]，正常生理情況下對細胞有利，在應(yīng)激刺激時自噬活性升高以應(yīng)對不利環(huán)境。當(dāng)刺激持續(xù)存在時，將會過度激活自噬活性，從而導(dǎo)致細胞的損傷或死亡。atg5基因參與自噬體的形成，在自噬過程中起關(guān)鍵作用[21]。beclin1是第一個被發(fā)現(xiàn)與自噬調(diào)控相關(guān)的關(guān)鍵因子[22]。parkin作為E3泛素連接酶，能從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體中，泛素化線粒體蛋白，形成自噬體，進而通過自噬降解受損的線粒體[23]。ulk2能阻止不溶性泛素化蛋白聚集物的積累[24]。研究顯示[1]，BHPF可以調(diào)控beclin1表達顯著上調(diào)，說明BHPF可以誘導(dǎo)線粒體自噬，降解線粒體結(jié)構(gòu)蛋白，這與本實驗結(jié)果類似。本研究進一步檢測了atg5、parkin和ulk2自噬相關(guān)基因，提示BHPF可能由于造成過度自噬產(chǎn)生神經(jīng)毒性。

綜上所述，本研究通過行為學(xué)檢測(黑白箱測試、新型水槽測試和T迷宮測試)和基因檢測(神經(jīng)發(fā)育、自噬和凋亡)相結(jié)合的方法，明確了BHPF對斑馬魚成魚的神經(jīng)毒性及作用機制，為水生環(huán)境的監(jiān)測和人類健康發(fā)展提供了理論基礎(chǔ)。