保鮮膜中微塑料和鄰苯二甲酸酯浸出行為及斑馬魚胚胎毒性評價

高宇，許霞,*，施昕瀾，張玲，郭俊，張秋亞，彭明國，薛銀剛,#

1.常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，常州 213164

2.江蘇省常州環(huán)境監(jiān)測中心，常州 213001

食品接觸材料(food contact material,FCMs)，也稱食品包裝材料，指在食品生產(chǎn)、加工、運輸和使用過程中可能直接或間接接觸食品的所有材料[1-3]。常見的FCMs包括塑料、玻璃、陶瓷和金屬等[4]。塑料制品因為成本低廉、輕便耐用占據(jù)了FCMs市場的“半壁江山”[5]。據(jù)統(tǒng)計，在2015年全球生產(chǎn)的3.8億t塑料中，塑料包裝獨占1.52億t，其中60%的塑料包裝被用于食品和飲料[6-7]。我國食品包裝材料尤其是塑料包裝的用量持續(xù)增長，塑料包裝用量已經(jīng)超過總用量的50%[8]。

塑料包裝為人類生活提供了極大的便利，但也對環(huán)境和生物健康帶來了挑戰(zhàn)。一方面，大量塑料包裝材料不當(dāng)?shù)幕厥张c處置加劇了環(huán)境負(fù)擔(dān)，并被認(rèn)為是環(huán)境中微塑料(<5 mm的塑料)污染的主要來源[9-11]。近些年來，在塑料包裝中也發(fā)現(xiàn)了微塑料的存在。例如，瓶裝飲料被發(fā)現(xiàn)含有來自瓶子本身的微塑料[12]，食鹽和茶包中發(fā)現(xiàn)了來自包裝的微塑料[13-14]。現(xiàn)有研究表明，微塑料可以被不同層級的生物攝食，生物體在攝入微塑料后，消化系統(tǒng)會出現(xiàn)堵塞和磨損痕跡，導(dǎo)致食欲下降[15-16]。與生物體接觸后，微塑料引起的氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致代謝紊亂和神經(jīng)毒性[17]。

另一方面，除了微塑料污染外，F(xiàn)CMs中所含添加劑通過食品接觸遷移到食品中也引起了廣泛關(guān)注[18-21]。由于難以與聚合物形成牢固的化學(xué)鍵，它們很容易在與食品接觸過程中遷移出來[22]。值得注意的是，從包裝材料中遷移出的化學(xué)物質(zhì)可能是食品污染的最大來源，浸出量可能比農(nóng)藥殘留高2～3個數(shù)量級[23]。鄰苯二甲酸酯(phthalic acid ester,PAEs)作為最具代表性的塑化劑，普遍用于保鮮膜的制造[24]。它們的存在可以幫助塑料分子分散更均勻，使保鮮膜具有足夠的柔韌性[25]。PAEs被認(rèn)為是內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals,EDCs)[26]，可導(dǎo)致細(xì)胞毒性以及生殖和發(fā)育缺陷[27]。以往的研究主要集中在塑料食品接觸材料中PAEs遷移量的測定[28-29]，有關(guān)浸提液中微塑料和PAEs的浸出及其對斑馬魚胚胎毒性效應(yīng)的研究卻鮮見報道。

目前市售產(chǎn)品大多宣稱在耐溫范圍內(nèi)使用不會產(chǎn)生危害，本研究以聚乙烯(polyethene,PE)和聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)保鮮膜為測試對象，選取3種食品模擬物(水、50%乙醇和正己烷)進(jìn)行遷移實驗，以早期發(fā)育敏感階段的斑馬魚胚胎(Daniorerio)作為毒性受試生物，通過歸納浸出液中微塑料和PAEs的浸出行為，并探究浸出的PAEs對斑馬魚胚胎的發(fā)育影響，為塑料食品接觸材料的風(fēng)險評估和健康安全評價提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

購買PE和PVC這2種材質(zhì)的保鮮膜；受試魚種為中國科學(xué)院水生生物研究所國家斑馬魚資源中心培育的AB系斑馬魚，實驗室條件下馴化2周。飼養(yǎng)期間嚴(yán)格控制養(yǎng)殖系統(tǒng)的水質(zhì)衛(wèi)生條件及光照時間，每天用實驗室人工孵化的鹽水蝦(豐年蝦)作為活飼料定時投喂2次，后期用于暴露試驗的胚胎均為其后代。

1.2 試劑與儀器

試劑：遷移試驗用水采用全玻璃裝置重蒸餾的超純水，標(biāo)準(zhǔn)稀釋水(5.5 mg·L-1KCl，63.0 mg·L-1·NaHCO3，123.3 mg·L-1MgSO4·7H2O，294.0 mg·L-1CaCl2·2H2O)用于斑馬魚的相關(guān)試驗，鄰苯二甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)配品純度為99%(德國Dr.Ehrenstorfer公司)，其余試劑均為色譜純(上海阿拉丁，中國)。

儀器：傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR，Nicolet IS5，美國)；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 7890B/5977B，美國)；超高清測量顯微鏡(SGO-KK203，深圳光谷，中國)；循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(定制，上海海圣，中國)；生化培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z，上海博迅，中國)；循環(huán)水式真空泵(SHZ-D(Ⅲ)，上海邦西，中國)；離心機(jī)(TDL-60C，上海安亭，中國)；渦旋振蕩器(UMV-1，北京優(yōu)晟，中國)；油浴鍋(DF-101S，上海力辰，中國)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)皿(RE-52AA，上海亞榮，中國)；回流冷凝裝置(四川蜀玻，中國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 遷移試驗

浸出液的制備參考《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品接觸材料及制品遷移試驗通則》(GB 31604.1—2015)[30]。不同類別食品對應(yīng)的食品模擬物如表1所示。PE和PVC保鮮膜的試驗溫度分別為110 ℃和80 ℃，試驗時間均為0.5 h。接觸面積與食品模擬物體積比(S/V)采用0.06 m2對應(yīng)1 L食品模擬物。采用全浸沒法，由于試樣厚度≤0.5 mm，實驗中浸沒面積均取單面計算。實驗中取0.006 m2保鮮膜樣品，100 mL食品模擬物加入接收瓶，于油浴鍋中加熱回流冷凝。

表1 不同食品類別下的食品模擬物及遷移試驗條件Table 1 Simulants and migration test conditions used for different food categories

1.3.2 微塑料的分離與鑒別

浸出液在真空泵下通過纖維素濾膜(直徑47 mm，孔徑1 μm)進(jìn)行抽濾，過程中用超純水反復(fù)沖洗容器內(nèi)壁。濾膜放入潔凈的培養(yǎng)皿中，待干燥后置于顯微鏡下觀察。每組樣品包括3個平行和1個空白對照(玻璃器皿)。記錄可疑微粒的個數(shù)、粒徑和形貌特征(形狀、顏色)，用FTIR進(jìn)行官能團(tuán)分析。FTIR采用衰減全反射模式，采集時間為3 s，光譜范圍為4 000～500 cm-1，測試結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)光譜庫對比，匹配度≥70%方可被接受[31]。

1.3.3 暴露試驗

斑馬魚胚胎實驗參考《水質(zhì) 急性毒性的測定 斑馬魚卵法》(HJ 1069—2019)[32]。選取二甲亞砜(DMSO)作為助溶劑，用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水稀釋至0.05%(V/V)。浸出液按本文1.4.1節(jié)的前處理方法揮干后，加入助溶劑。對照組和實驗組的試驗布局如圖1所示，陰性對照即為空白對照，溶劑對照中的溶液為0.05%(V/V) DMSO。取各組溶液加入石英玻璃微孔，每孔2 mL。受精卵在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置45 min，顯微鏡下挑選64-細(xì)胞期～128-細(xì)胞期的胚胎放入石英玻璃微孔中進(jìn)行暴露，每孔1個胚胎。每種浸出液設(shè)置3個平行，每個平行包含10個胚胎。暴露完的胚胎轉(zhuǎn)入生化箱，26 ℃下培養(yǎng)，記錄48 hpf、72 hpf(hours post fertilization，受精后小時數(shù))胚胎相關(guān)形態(tài)學(xué)指標(biāo)[33-34]。

圖1 斑馬魚胚胎試驗微孔板布局圖 注：DMSO表示二甲基亞砜。Fig.1 Layout of the microplate for the zebrafish embryo testNote:DMSO stands for dimethyl sulfoxide.

1.4 鄰苯二甲酸酯類塑化劑的測定

1.4.1 浸出液的前處理

準(zhǔn)確量取(10 mL±0.01 mL)各類模擬物浸出液，對于油性模擬物浸出液，45 ℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干后揮干，加入1 mL正己烷，振蕩3 min，4 000 r·min-1離心5 min；對于水性和含醇模擬物浸出液，先加入4 mL正己烷，振蕩10 min，4 000 r·min-1離心5 min，取上層正己烷層，重復(fù)提取2次，合并提取液，再按照油性模擬物浸出液的操作方法進(jìn)行處理。全部完成后，收集上層清液待氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測。

1.4.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀參數(shù)

色譜條件：色譜柱選取5%苯基-甲基聚硅氧烷石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；不分流進(jìn)樣1 μL；進(jìn)樣口溫度260 ℃；初始柱溫60 ℃，保持1 min，20 ℃·min-1升溫至220 ℃，持續(xù)1 min，5 ℃·min-1升溫至250 ℃，維持1 min，20 ℃·min-1升溫至290 ℃，保持7.5 min；載氣氦氣流速1 mL·min-1。

質(zhì)譜條件：EI電離源，電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃；溶劑延遲7 min。

1.5 質(zhì)量控制與保證

實驗過程中嚴(yán)格執(zhí)行品質(zhì)控制措施，包括使用通風(fēng)櫥、棉衣和乳膠手套以防止外來微粒對結(jié)果產(chǎn)生干擾。所有容器未使用時用鋁箔覆蓋。微塑料過濾前，在顯微鏡下檢查濾膜和培養(yǎng)皿的清潔度。用于暴露的斑馬魚胚胎在培養(yǎng)48 h后，對照組的試驗結(jié)果應(yīng)滿足以下要求：板對照中無胚胎死亡；陰性對照中胚胎存活率≥90%；陽性對照胚胎存活率<10%，否則重新試驗。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式呈現(xiàn)，微塑料豐度單位為“個·(100 mL)-1”；使用Origin Pro 2017進(jìn)行正態(tài)檢驗和單因素方差分析(ANOVA)；*表示P<0.05，**表示P<0.01。

2 結(jié)果(Results)

2.1 浸出液中微塑料的特征

2.1.1 微塑料的類型與豐度

通過FTIR對可疑微粒進(jìn)行表征(圖2)，并與標(biāo)準(zhǔn)譜圖比對以確定樣品的類型。共有79個疑似顆粒被檢測，其中包含一些類似塑料的非塑料顆粒。一些微粒的聚合物成分與保鮮膜相同且顏色也為透明，因此，它們被認(rèn)為是從保鮮膜中剝落的微塑料。在PE和PVC保鮮膜中，自身剝落微塑料分別占總體豐度的21.0%和17.7%。在PE和PVC保鮮膜中也發(fā)現(xiàn)了其他類型的聚合物，PE保鮮膜中其他類型的聚合物占比分別為聚對苯二甲酸乙二醇酯(26.3%)、聚酯(21.1%)、丙烯酸(5.3%)、尼龍(15.8%)和人造絲(31.5%)，PVC保鮮膜中其分別為聚對苯二甲酸乙二醇酯(28.6%)、聚酯(17.9%)、丙烯酸(7.1%)、尼龍(21.4%)和人造絲(25.0%)。

圖2 保鮮膜中微塑料的紅外光譜圖注：PE表示聚乙烯；PVC表示聚氯乙烯；PET表示聚對苯二甲酸乙二醇酯；PES表示聚酯。Fig.2 Infrared spectrum of microplastics in plastic wrapNote:PE stands for polyethylene;PVC stands for polyvinyl chloride;PET stands for polyethylene terephthalate;PES stands for polyester.

由圖3(a)可知，不同模擬物下2種保鮮膜中微塑料的總體豐度，箱線圖中的晶須、中線和小方塊分別代表豐度的最值、中值和平均值。3種模擬環(huán)境下PE保鮮膜中微塑料的豐度在(2.33±0.47) 個·(100 mL)-1到(3.33±0.47) 個·(100 mL)-1之間，平均豐度為(2.67±0.82) 個·(100 mL)-1。PVC保鮮膜中微塑料豐度最高值為(4.33±0.47) 個·(100 mL)-1，最低值為(3.00±0.82) 個·(100 mL)-1，平均為(3.78±0.92) 個·(100 mL)-1。外來源微塑料(非自身剝落)豐度如圖3(b)所示，PE保鮮膜中外來源微塑料的平均豐度為(2.11±0.74) 個·(100 mL)-1，占總體豐度的79.0%，PVC中外來源微塑料的平均豐度(3.11±0.57) 個·(100 mL)-1，占總體豐度的82.3%。

圖3 不同模擬物下2種保鮮膜中微塑料的豐度注：(a) 總體微塑料豐度；(b) 表面附著微塑料豐度(非自身剝落)。Fig.3 Abundance of microplastics in two kinds of plastic wrap under different simulantsNote:(a) Total microplastic abundance;(b) Surface-attached microplastic abundance (non-self flaking).

2.1.2 微塑料的形狀和粒徑

不同模擬物下2種材質(zhì)保鮮膜中檢出的微塑料形狀包括2種：薄膜和纖維，且纖維所占比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于薄膜。在水性、含醇和油脂食品模擬物中，PE保鮮膜中纖維狀塑料百分比分別是86%、71%和80%，薄膜狀為14%、29%和20%(圖4(a))。在PVC保鮮膜中，纖維類分別占比89%、83%和77%，薄膜類比例為11%、17%和23%(圖4(b))。微塑料根據(jù)粒徑分為3組：分別為<500 μm、500～1 000 μm和>1 000 μm。如圖4(c)所示，PE保鮮膜中<500 μm粒徑的微塑料最多(74.1%)，其次是粒徑在500～1 000 μm的微塑料(22.2%)，粒徑>1 000 μm的微塑料最少(3.7%)。由圖4(d)可知PVC保鮮膜中微塑料的粒徑分布情況，500～1 000 μm的微塑料最多(55.9%)，粒徑<500 μm的微塑料次之(29.4%)，>1 000 μm的微塑料依然最少(14.7%)。

圖4 不同模擬物下2種保鮮膜中微塑料的形狀和粒徑注：(a)表示PE保鮮膜中微塑料的形狀分布；(b)表示PVC保鮮膜中微塑料的形狀分布；(c)表示PE保鮮膜中微塑料的粒徑；(d)表示PVC保鮮膜中微塑料的粒徑。Fig.4 Shape and size of microplastics in two kinds of plastic wrap under different simulantsNote:(a) Represents shape distribution of microplastics in PE;(b) Represents shape distribution of microplastics in PVC;(c) Represents size of microplastics in PE;(d) Represents size of microplastics in PVC.

2.2 浸出液中PAEs對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

2.2.1 各組別對胚胎心率的影響

顯著性分析結(jié)果表明空白對照組和溶劑對照組之間不存在明顯差異。PE保鮮膜中各試驗組均未發(fā)現(xiàn)20 s內(nèi)斑馬魚胚胎心跳次數(shù)有明顯變比。PVC水性環(huán)境實驗組毒性最弱，對斑馬魚胚胎的心率幾乎沒有抑制作用。相比之下，含醇和油脂條件實驗組對斑馬魚胚胎20 s內(nèi)心跳次數(shù)均有很強(qiáng)的抑制作用，其中油脂環(huán)境實驗組對胚胎影響最顯著。48 hpf時，含醇試驗組和油脂試驗組中斑馬魚胚胎20 s心跳次數(shù)分別相當(dāng)于溶劑對照組的92.6%和85.9%；72 hpf時，2個試驗組暴露下的胚胎20 s心跳次數(shù)分別為對照組的87.2%和80.4%(圖5)。

圖5 不同模擬物下保鮮膜浸提物對胚胎心率的影響Fig. 5 Effects of the extracts from plastic wrap using different food simulants on the heart rate of embryos

2.2.2 各組別對胚胎的致畸作用

如圖6所示，PVC保鮮膜含醇實驗組和油脂實驗組中暴露的斑馬魚胚胎均出現(xiàn)了脊柱彎曲和心包囊腫。其中脊柱彎曲率分別為6.7%(P<0.01)和13.3%(P<0.01)。心包囊腫率相對較低，分別為3.3%(P<0.01)和6.7%(P<0.01)。相對于48 hpf正常發(fā)育的胚胎(圖7(a))，在實驗組中出現(xiàn)了如心包囊腫(圖7(b))和卵黃腫大(圖7(c))等畸形癥狀；72 hpf暴露后，相比正常發(fā)育的仔魚(圖7(d))，實驗組中發(fā)現(xiàn)了心包囊腫(圖7(e))和脊柱彎曲(圖7(f))的仔魚。

圖6 不同模擬物下保鮮膜浸提物對胚胎的致畸作用Fig. 6 Teratogenic effects of the extracts from plastic wrap using different food simulants on embryos

圖7 異常胚胎顯微照片注：(a) 48 hpf發(fā)育正常的胚胎；(b) 48 hpf心包囊腫的胚胎；(c) 48 hpf卵黃腫大的胚胎；(d) 72 hpf發(fā)育正常的仔魚；(e) 72 hpf心包囊腫的仔魚；(f) 72 hpf脊柱彎曲的仔魚。Fig.7 Micrographs of abnormal embryosNote:(a) Normally developing embryo at 48 hpf;(b) Embryo with pericardial cyst at 48 hpf;(c) Embryo with yolk deformation at 48 hpf;(d) Normally developing larva at 72 hpf;(e) Larva with pericardial cyst at 72 hpf ;(f) Larva with spine curvature at 72 hpf.

2.3 浸出鄰苯二甲酸酯類塑化劑的濃度

通過GC-MS對浸出液中的成分進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)在PVC保鮮膜含醇和油脂模擬物的浸出液中被檢測出，PE保鮮膜3種食品模擬物的浸出液中都未發(fā)現(xiàn)PAEs的浸出。同時，PVC保鮮膜在油脂環(huán)境下的遷移量最大，其次是含醇環(huán)境，2種保鮮膜在水性環(huán)境下都未檢出PAEs。

表2 不同模擬物下2種保鮮膜中鄰苯二甲酸酯濃度Table 2 Phthalate concentrations of two kinds of plastic wrap under different simulants (mg·L-1)

3 討論(Discussion)

3.1 2種保鮮膜中微塑料浸出行為

PE和PVC保鮮膜中都發(fā)現(xiàn)了微塑料的存在，其中有一部分來源于保鮮膜本身。微塑料可能在塑料制品制造、運輸和日常使用過程中從接觸材料表面脫落。Du等[35]發(fā)現(xiàn)微塑料會在輕微沖洗后從不同類型的外賣容器表面剝落，每人每周通過容器攝入的微塑料可能高達(dá)203個。Fadare等[36]對用于食品配送的圓形、矩形塑料容器和日常飲用的一次性塑料杯浸出的微塑料進(jìn)行了檢測，確定了剝落微塑料的平均質(zhì)量分別為(12±5.12) mg、(38±5.29) mg 和(3±1.13) mg。除了自身剝落的內(nèi)源污染外，包裝材料中也發(fā)現(xiàn)了外來源污染，且以纖維狀的微塑料比例最高。5種外來源微塑料按比例從高到低分別為人造絲、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚酯、尼龍和丙烯酸。衣物上的塑料纖維可能是外來污染的重要來源。研究表明，纖維狀的微塑料主要由服裝纖維的斷裂產(chǎn)生，其主要成分是人造絲和聚對苯二甲酸乙二醇酯，這2種材質(zhì)的聚合物在合成紡織纖維中被大量使用[37]。在與食品接觸材料加工和包裝的過程中，衣物上的塑料纖維可能通過靜電作用沾染到保鮮膜表面。除了衣物來源，大氣中的微塑料污染也可能通過沉降作用進(jìn)入到接觸材料。大氣微塑料污染普遍存在于室內(nèi)外環(huán)境中[38-39]。Cai等[40]對中國東莞市大氣沉降物中微塑料的污染特征進(jìn)行了歸納，發(fā)現(xiàn)每天沉降物中微塑料濃度的范圍為175～313 個·m-3，且纖維是主要的形狀。室內(nèi)環(huán)境的污染更嚴(yán)重，Dris等[41]的研究表明，每天沉降的塑料纖維濃度介于523～3 673 個·m-3之間。本文檢出的外來源塑料微粒以纖維形狀最為豐富，這與Cai等[40]和Dris等[41]的研究結(jié)果相一致。制品在生產(chǎn)、儲存、運輸和使用過程中不可避免地會接觸到空氣，大氣中的微塑料可能通過這些環(huán)節(jié)中進(jìn)入塑料制品中。有研究表明，與攝入大氣微塑料沉降物引起的暴露水平相比，通過貝類攝入微塑料對人類健康的影響甚至可以忽略不計[42]。從豐度上看，PVC保鮮膜中的外來顆粒個數(shù)大于PE保鮮膜；從粒徑分布上看，PVC保鮮膜中含有微塑料的粒徑也是大于PE保鮮膜的，這可能因為PVC保鮮膜具有更大的黏性，更有利于大粒徑的外來微塑料粘附在表面。相關(guān)研究表明，微塑料的存在可能會加劇浸提液的毒性[43-44]，具體的毒性機(jī)制目前尚不明確。除了塑料制品本身遷移添加劑的毒性，剝落的微塑料也有可能對斑馬魚胚胎產(chǎn)生毒性。

3.2 不同模擬環(huán)境下PAEs的遷移量及毒性效應(yīng)

由于PAEs未與聚合物共價結(jié)合，而是通過氫鍵或范德華力與樹脂相連，因此這些化合物很容易從塑料食品接觸材料中遷出[45]。Han等[46]對中國外賣食品容器中的PAEs進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)DEHP的浸出率最高，達(dá)到51.2%。趙電波等[47]發(fā)現(xiàn)聚乙烯包裝袋在包裹完高溫油炸的油條后，包裝材料中檢測到了DBP和DOP的浸出，最大浸出濃度分別為0.79 mg·L-1和0.24 mg·L-1。不同食品模擬物中PAEs的浸出量也呈現(xiàn)出差異性，相比于水性模擬物，有機(jī)模擬物中PAEs有著明顯的浸出，這可能與用來抽提的溶劑極性有關(guān)[48]。塑料食品接觸材料中的添加劑多為非極性化合物，因此難以在極性很強(qiáng)的水溶液中發(fā)生遷移，而與水相比，醇和烷烴的極性要小得多，根據(jù)相似相溶原理，在這類模擬環(huán)境下遷移促進(jìn)了同樣極性較弱的PAEs浸出。PAEs在油脂模擬物中的遷移量大于在含醇環(huán)境下的遷移量，這種差異可能歸因于正己烷和PAEs相似的C—C長鏈結(jié)構(gòu)[49]，此外，遷移量差異也和溶液體系中有機(jī)組分的含量有關(guān)，油脂模擬物中高聚物的溶劑化作用更為明顯，進(jìn)而導(dǎo)致更多的PAEs遷移。

PVC保鮮實驗組中的受試胚胎受到不同程度的毒害作用，浸提液中檢測到DEHP、DBP和DOP這3種PAEs類化合物的浸出。Staples等[50]研究發(fā)現(xiàn)DBP、DEHP和DOP可對魚類胚胎產(chǎn)生毒性效應(yīng)，且其毒性的強(qiáng)弱與烷基鏈長度成正相關(guān)。何秀婷等[51]研究了4種不同濃度的PAEs對斑馬魚胚胎發(fā)育的聯(lián)合毒性，計算出DBP和DEHP對斑馬魚胚胎48 h半數(shù)致死濃度(LC50-48 h)分別為0.20 mg·L-1和0.77 mg·L-1，且DBP和DEHP交互暴露時，可能產(chǎn)生的協(xié)同作用會導(dǎo)致毒性加強(qiáng)，對斑馬魚胚胎發(fā)育造成更大影響。含醇和油脂實驗組中部分斑馬魚胚胎表現(xiàn)出心率異常并伴有特征性的心臟缺陷，這些癥狀的產(chǎn)生很可能歸因于浸出的PAEs。Singh和Li[52]借助比較毒理學(xué)數(shù)據(jù)庫對16種PAEs與基因/蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)心臟毒性是PAEs毒性排名最高的類別，其次是肝毒性和腎毒性。相關(guān)研究表明，PAEs對心臟產(chǎn)生毒性的作用機(jī)制可能與Nkx2.5和Tbx5這2種基因的表達(dá)變化有關(guān)。作為重要的心臟轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎心臟發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[53-54]。Nkx2.5和Tbx5協(xié)同參與心肌細(xì)胞分化，促進(jìn)心臟發(fā)育[55]，其在胚胎中的表達(dá)改變可導(dǎo)致嚴(yán)重的心臟分化缺陷和心臟缺陷[56-57]。Sun和Liu[58]證實了鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)會損害斑馬魚胚胎的心臟結(jié)構(gòu)和功能，并通過實時定量PCR技術(shù)深入探究了BBP對斑馬魚胚胎心臟發(fā)育產(chǎn)生不利影響的機(jī)理。Nkx2.5和Tbx5的基因表達(dá)伴隨BBP暴露劑量的上升呈現(xiàn)依賴性下降，這2種基因的改變可能是引起心臟毒性的主要原因。穆希巖等[59]證明了DBP和DEHP可導(dǎo)致胚胎中Nkx2.5蛋白含量降低，這種蛋白含量的減少可能造成胚胎心臟發(fā)育缺陷，引起胚胎心率異常[56-57]。Pfuderer和Francis[60]證明了PAEs對心率有影響，其中DBP和BBP可顯著降低金魚的心率，這些結(jié)果表明心臟缺陷與酞酸酯類化合物之間存在密切的關(guān)聯(lián)。

暴露于含醇和油脂浸提液的斑馬魚胚胎出現(xiàn)脊柱彎曲，這可能和胚胎中與脊索發(fā)育和骨骼發(fā)育的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變有關(guān)。之前的研究表明，PAEs類化合物易對骨骼和脊柱的發(fā)育造成影響[61-62]。Qian等[63]發(fā)現(xiàn)參與脊索發(fā)育的col8a1a基因以及參與骨骼發(fā)育的BMP-2因子的轉(zhuǎn)錄水平在50 μg·L-1DEHP和DBP中顯著下調(diào)，這可能是導(dǎo)致斑馬魚脊柱缺陷的關(guān)鍵原因。Col8a1a被認(rèn)為是斑馬魚脊索發(fā)育過程中的必要因素，該基因功能的缺失或抑制會影響胚胎脊柱和骨骼系統(tǒng)正常發(fā)育，進(jìn)而造成斑馬魚胚胎脊椎畸形[64]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)作為骨形成的誘導(dǎo)劑和胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)劑，直接參與脊椎動物胚胎背腹的早期形成，BMP-2的轉(zhuǎn)錄減少可能對骨骼發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響并進(jìn)一步誘導(dǎo)脊柱變形[65]。既往的研究也有相似的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)暴露于多氯聯(lián)苯(PCBs)和三唑類化合物時，伴隨著BMP-2轉(zhuǎn)錄的減少，斑馬魚胚胎脊柱彎曲率上升[66-67]。斑馬魚胚胎相關(guān)毒性癥狀的產(chǎn)生可能是一系列復(fù)雜毒性機(jī)制綜合作用的結(jié)果，一方面浸提過程中遷移出的塑料添加劑可能通過改變與發(fā)育有關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)斑馬魚胚胎出現(xiàn)毒性效應(yīng)，另一方面浸提液中的微塑料可能會對浸提液的毒性起到促進(jìn)作用，共同影響斑馬魚胚胎發(fā)育。