基于網(wǎng)絡藥理學研究血府逐瘀湯治療中晚期氣滯血瘀型肺癌的作用機制

徐 旭，侯恩存，熊佳惠，趙藝蔓

1 廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530000；2 廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院

近年來，肺癌發(fā)病人數(shù)逐年增高，已成為當今人類所面臨的腫瘤疾病的首要組成部分［1-2］。目前認為腫瘤的發(fā)病機制是由多種因素影響激活原癌基因導致細胞癌變。分子生物學研究表明［3-5］，腫瘤的發(fā)病與表觀遺傳、miRNA、lncRNA 等密切相關。而且不同肺癌患者在治療時常存在特異性。因此，腫瘤基因、靶點、信號通路的研究能對其發(fā)病機制、疾病預防、藥物治療起促進作用。

血府逐瘀湯是王清任《醫(yī)林改錯》中五逐瘀湯中的一首方劑，由桃仁、紅花、當歸、生地黃、牛膝、川芎、桔梗、赤芍、枳殼、甘草、柴胡等11 味藥組成。主要用于冠心病、心肌梗死、腦梗死、高血壓等心血管疾病和骨折、軟組織損傷及多種手術術后治療等，起活血化瘀，行氣止痛作用。彭濤等［6］對90 例肺癌中晚期患者進行隨機對照研究發(fā)現(xiàn)血府逐瘀湯能夠有效改善中晚期肺癌患者血液高凝狀態(tài)，預防靜脈血栓形成。丁志山等［7］通過牛內(nèi)皮細胞實驗表明血府逐瘀湯通過抑制血管生成起抗腫瘤作用。本研究首次采用網(wǎng)絡藥理學方法整合血府逐瘀湯中多種藥物蛋白作用網(wǎng)絡與肺癌網(wǎng)絡，從蛋白、基因角度揭示血府逐瘀湯治療肺癌的相關機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/index.php）；Batman數(shù)據(jù)庫（a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine，http：//www.batman.com）；PharmMapper Server 數(shù)據(jù)庫（http：//pharmmapper/index.php）；String 數(shù)據(jù)庫（http：//www.String-db.org/）；Drugbank 數(shù)據(jù)庫（https：//www.Drugbank.ca/）；GAD數(shù)據(jù)庫（Genetic Association Database，http：//geneticassociationdb.Nih.gov）；在線孟德爾人類遺傳數(shù)據(jù)庫（online mendelian inheritance in man，OMIM，http：//www.omim.org）；CTD 數(shù)據(jù)庫（Comparative Toxicogenomics Database，http：//ctd.mdibl.org/）；GeneCard數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/）；DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david-d.ncifcrf.gov/home.jsp）；KEGG 數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http：//www.kegg.com）；KOBAS 數(shù)據(jù)庫（http：//kobas.cbi.pku.Edu.cn/download.php）；Metascape 數(shù)據(jù)庫（http：//www.matascape.com/）

1.2 血府逐瘀湯有效成分和核對采用TCMSP數(shù)據(jù)庫及Batman 數(shù)據(jù)庫收集血府逐瘀湯方劑中柴胡、生地黃、赤芍、川芎等11 味中藥的化學成分。因血府逐瘀湯通常采用口服用藥，因此以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18 為限定條件對所收集到的化學成分進行篩選［8］。篩選出血府逐瘀湯的活性成分并下載保存為Mol2 格式，結合DrugBank 數(shù)據(jù)庫檢索化合物的詳細信息并進行確認核對，最后得到血府逐瘀湯的有效成分。

1.3 血府逐瘀湯化學成分靶點預測將初步篩選出的活性成分進行文獻檢索，將Mol2 格式的全部文件上傳至Pharmmapper服務器［9］，并設定返回標準。將得到的返回靶點結果在Uniprot數(shù)據(jù)庫、String數(shù)據(jù)庫中進行核對，選擇物種為人類（Homo.sapiens），蛋白質(zhì)ID轉化為基因名稱（Gene Symbol）并剔除不規(guī)范、非特定指代命名靶點，以確保靶點的可獲得蛋白互作網(wǎng)絡圖，并將相關數(shù)據(jù)保存為TSV格式。將TSV格式文件導入Cytoscape 3.6.1軟件，并設計圖形參數(shù)，進行分析。其中節(jié)點表示成分和靶點，邊表示成分與靶點之間的相互作用，進一步設置節(jié)點大小與顏色反映Degree 值大小，邊的粗細反映Combined score 大小，最終獲得蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡。

1.4 肺癌相關靶點獲取從OMIM 數(shù)據(jù)庫［10］、GAD數(shù)據(jù)庫［11］、CTD 數(shù)據(jù)庫［12］中獲得肺癌相關靶點，以肺癌為關鍵詞進行搜索，獲得與肺癌相關的靶點，并將3個數(shù)據(jù)庫得到的靶點進行對比篩選。

1.5 血府逐瘀湯和肺癌相關靶點分析將血府逐瘀湯化學成分靶點與肺癌靶點進行核查比對，利用Venny分析工具，比對分析兩組靶點。將靶點導入Metascape數(shù)據(jù)庫，設置物種為人類（sapiens），得到相關數(shù)據(jù)和PPI圖。

1.6 血府逐瘀湯治療肺癌預測靶標富集分析將血府逐瘀湯潛在靶點上傳到David 數(shù)據(jù)庫。依次勾 選OFFICIAL GENE SYMBOL、Genelist、Submit list，修改背景為人類（Homo.sapiens），再分別勾選生物過程（biological process，BP）、分子功能（cellular component，CC）、細胞成分（molecular function，MF）。選擇生物使用KOBAS 數(shù)據(jù)庫和metascape 數(shù)據(jù)庫對靶點進行生物途徑富集分析。通過KEGG 數(shù)據(jù)庫查找富集出的生物通路圖，并利用metascape數(shù)據(jù)庫將得到的KEGG生物途徑結果制作成條形圖。

2 結果

2.1 有效成分篩選通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫搜集到226 個化合物，其中柴胡17 個，赤芍29 個，川芎7個，當歸2個，甘草92個，紅花22個，桔梗7個，牛膝20 個，地黃2 個，桃仁23 個，枳殼5 個。其中包括共有化合物11 個：赤芍、當歸、紅花、牛膝、桃仁、枳殼的共有化合物為β-谷固醇，柴胡、赤芍、當歸、紅花、牛膝、生地黃的共有化合物為豆固醇，柴胡、甘草、紅花、牛膝的共有化合物為槲皮素，赤芍、川芎、甘草、生地黃的共有化合物為谷固醇，柴胡、甘草、紅花、牛膝的共有化合物為山柰酚，柴胡、赤芍、紅花、牛膝的共有化合物為黃芩苷，赤芍、紅花、牛膝的共有化合物為黃芩素，赤芍、桔梗、牛膝的共有化合物為菠固醇，紅花、桔梗的共有化合物為木犀草素，柴胡、甘草的共有化合物為異鼠李素，甘草、枳殼的共有化合物為柚皮素。OB值排名前50的化合物見表1。

表1 血府逐瘀湯有效成分（前50名）

續(xù)表1

2.2 血府逐瘀湯化學成分潛在靶點預測及相互作用將得到的各Mol2 結果上傳至PharmMapper數(shù)據(jù)庫，返回的潛在預測靶點共2394 個，對潛在靶點在DrugBank 數(shù)據(jù)庫中篩選和進行去除重復后得到290 個蛋白，并在Uniprot 數(shù)據(jù)庫、String數(shù)據(jù)庫中進行核對后剔除非人類和不規(guī)范、非特定指代命名以及重復的靶點后，共得到262 個靶點，其中不同顏色的節(jié)點代表不同的靶點，共得到262 個靶點，邊線代表兩個靶點間的相互關系，邊線越多，關聯(lián)的靶點越多，共計2112 條。平均節(jié)點為16.1，平均局部聚類系數(shù)為0.464。見圖1。

圖1 血府逐瘀湯化學成分潛在靶點預測及相互作用PPI圖

2.3 肺癌相關靶點獲取從OMIM數(shù)據(jù)庫、GAD數(shù)據(jù)庫、CTD 數(shù)據(jù)庫中分別獲得肺癌相關靶點共126820 個，篩選去重后得到37774個不重復靶點，包括血清α-1-B 糖蛋白（A1BG）、α-2-巨球蛋白（A2M）、n-乙酰轉移酶1（NAT1）、n-乙酰轉移酶2（NAT2）、芳基乙酰胺脫乙酰酶（AADAC）等，部分靶點見表2。

表2 肺癌相關部分靶點

續(xù)表2

2.4 血府逐瘀湯與肺癌蛋白互作血府逐瘀湯靶點與肺癌相關靶點相互交集的韋恩圖表明有258個共有靶點。見圖2。

圖2 血府逐瘀湯靶點與肺癌相關靶點相互交集韋恩圖

2.5 血府逐瘀湯治療肺癌的靶點和通路GO 富集將共有靶點258 個輸入DAVID、Metascape、KOBAS 網(wǎng)站進行基因本體論功能富集分析（gene ontology，GO），得到2833 個BP，1521 個細胞組成CC，2886個分子功能MF。綜合P值較高的靶點包括TP53、Bcl-2、Akt1、EGFR、RELA、PTGS2 等。BP、CC、MF的P值前20的靶點見圖3—5。

圖3 血府逐瘀湯治療肺癌的靶點和通路GO富集（BP，P值前20）

圖4 血府逐瘀湯治療肺癌的靶點和通路GO富集（CC，P值前20）

圖5 血府逐瘀湯治療肺癌的靶點和通路GO富集（MF，P值前20）

將KEGG 富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、Gene Pathway、CORUM結果綜合后發(fā)現(xiàn)所有靶點共有通路1893 條，其中以Log10（P值）最大的20 個通路形成條形。見圖6、表3。

表3 部分共有靶點通路

圖6 Log10（P值）最大的20個通路條形圖

結合Metascape 形成對應的富集，見圖7，其中同種顏色的節(jié)點代表在同一個信號通路上的靶點，相應P值對應分布圖見圖8，節(jié)點顏色變化代表P值變化。

圖7 結合Metascape形成的對應富集圖

圖8 同種顏色的節(jié)點代表在同一個信號通路上的靶點及相應P值對應分布

結合MCODE 插件得到血府逐瘀湯和肺癌共同靶點的模塊化分析見圖9—11。圖9 為所有模塊的集成圖像，不同顏色代表不同的模塊。圖10 是部分靶點組合的8 種模塊的細節(jié)結構圖。對每個MCODE模塊通過GO分析，保留其中前3個最佳P值項，得到表4 結果。其中MCODE7 靶點聚類后模塊由sod1、pygm、akr1c1 靶點構成，三者沒有共同通路。將各聚類模塊進行匯總分析得出P值最高的3條通路：（hsa05200Pathways in cancer）Log10（P）=-56.5；hsa05161（Hepatitis B）Log10（P）=-55.8；hsa05215（Prostate cancer）Log10（P）=-38.6。對所有信號通路進行匯總分析得出P值最高的3條：hsa05200（Pathways in cancer）Log10（P）=-61.3；R-HSA-6785807（Interleukin-4 and Interleukin-13 signaling）Log10（P）=-52.0；GO：0010035（response to inorganic substance）Log10（P）=-49.7?？偨YP值較高的通路包括hsa05200：Pathways in cancer；R-HSA-6783783：Interleukin-4 and Interleukin-13 signaling）；GO：0010035（response to inorganic substance）等通路?？傊痧鰷卸鄠€活性成分可能通過(tumor portein p53，TP53)、B 淋巴細胞瘤2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase，Akt1）等靶點通過hsa05200、R-HSA-6783783、GO：0010035 等的多種信號通路起治療肺癌的作用。

表4 模塊中P值排在前三的通路

圖9 血府逐瘀湯和肺癌共同靶點的模塊集成圖

圖10 部分靶點組合的8種模塊的細節(jié)結構圖

3 討論

肺癌屬中醫(yī)學“肺積”“胸痛”“咯血”“咳嗽”等范疇，《素問·奇病論篇》《靈樞·邪氣臟腑病形》《難經(jīng)》中均有類似記載，《傷寒論》《金匱要略》中提出了最早的治療方法。現(xiàn)代中醫(yī)將肺癌多歸于體虛導致氣滯、血瘀、痰凝、毒聚入內(nèi)致病。其治則也因不同醫(yī)家不同辨證而不同，主要為補氣滋陰、活血化瘀、健脾化痰等，其中劉嘉湘教授［13］提出“扶正治癌”法；蔡小平教授［14］提出“瘀陽論、瘀陰論”，并總結出解毒散結方；馬純政教授［15］認為肺癌多由痰濕所致，主張行氣化痰，調(diào)理脾腎；徐景毅教授［16］強調(diào)扶正與驅邪共進，再因人施治。王淑美等［17］通過評估名家醫(yī)方、孫婕怡［18］通過近30 年中醫(yī)相關文獻數(shù)據(jù)挖掘結果看出活血化瘀是治療肺癌的重要方法之一。血府逐瘀湯是治療氣滯血瘀型肺癌的代表方劑。

血府逐瘀湯的抗癌機制相關研究較少。部分藥理學及臨床研究表明血府逐瘀湯有一定的抗腫瘤作用。葉向榮等［19］通過觀察腹水型肝癌（H22）淋巴管轉移小鼠發(fā)現(xiàn)血府逐瘀湯能有效抑制癌細胞淋巴管轉移。董強等［20］對80 例中晚期小細胞肺癌患者給與EP 方案+血府逐瘀湯的隨機對照研究，結果表明血府逐瘀湯可改善患者血液高凝狀態(tài)，增強化療藥物的療效。

3.1 血府逐瘀湯有效化合物分析本研究共得到226個化合物，其中包括11個共有化合物［β-谷固醇、豆固醇、槲皮素、谷固醇、山柰酚、黃芩苷、黃芩素、菠固醇、木犀草素、異鼠李素。對比孫明謙等［21］采用多級離子阱質(zhì)譜儀對血府逐瘀湯中的化合物進行質(zhì)譜和碎片離子的解析結果，尹愛武等［22］利用色譜學對血府逐瘀湯進行系統(tǒng)分離，并對得到的化合物進行結構鑒定，發(fā)現(xiàn)血府逐瘀湯制劑未有新化合物產(chǎn)生。β-谷固醇作為一種廣泛存在于多種植物的化合物。有研究表明，β-谷固醇能誘導乳腺癌、結腸癌、宮頸癌和前列腺癌細胞DNA發(fā)生細胞凋亡，起抗增殖作用［23-24］。有研究表明，β-谷固醇能抑制a549細胞生長，并通過ROS介導的線粒體失調(diào)引發(fā)非小細胞肺癌細胞凋亡，而不損害肺和PBMC 細胞［25］。實驗結果表明，豆固醇有明確的抗皮膚癌作用并能通過抑制腫瘤血管生成抑制膽管癌生長［26-28］；槲皮素已經(jīng)被較多實驗證實能抑制肺癌細胞生長［29-31］，并且已經(jīng)被用于肺癌的靶向藥物研發(fā)［32］。

在血府逐瘀湯所有化合物中桃仁、甘草所含化合物OB 較高，在前50 中占62%。桃仁中的赤霉素在血府逐瘀湯所有化合物中有101.61%的OB。赤霉素是植物生長過程的重要激素。GA-13315作為一種赤霉素的衍生物能對肺腺癌起較好的抗腫瘤作用，并能部分通過阻礙ABCB1的外排功能而使多藥耐藥細胞變得敏感［33-34］。甘草的化合物DL普遍較高，其中最高的是甘草中的Shinpterocarpin。甘草作為中藥方中常見藥物，通常在全方中作為佐使藥，起到引經(jīng)、補益和調(diào)和諸藥的作用。目前已知的甘草成分超過280 種，主要有黃酮類、三萜皂苷類、生物堿類、甘草葡聚糖類等成分，其中部分已經(jīng)被證實對肺癌有積極作用。CHANGLIANG CHEN 等［35］通過各種甘草成分對非小細胞肺癌的H1299、A549、H1975 和H2228 細胞進行Transwell和創(chuàng)傷愈合實驗，證明異甘草素能有效抑制肺癌細胞遷移和生長。CHENYU QIU 等［36］對非小細胞肺癌A549 和H460 細胞的實驗結果表明Licochalcone A（LicA）能通過誘導G2/M 細胞周期阻滯和雌激素受體應激抑制肺癌細胞的增殖。SO YOUNG PARK 等［37］將18β-GA 作用于NCI-H23、NCIH460、A549 和16HBE-T 細胞，結果表明18β-GA 可能通過抑制血栓素的作用抑制肺癌細胞增殖。綜上可知，血府逐瘀湯中成分復雜多樣，部分化合物如β-谷固醇、赤霉素、甘草素可通過抑制癌細胞增殖、遷移等作用治療肺癌，但也有部分化合物（如Shinpterocarpin）缺乏相關實驗證明其作用。而針對血府逐瘀湯成方成分的相關研究較少，不排除有新化合物生成而未被發(fā)現(xiàn)的可能，希望有更多新技術應用于相關研究。

3.2 血府逐瘀湯和肺癌共同靶點分析本研究共得到血府逐瘀湯和肺癌共有靶點258 個，占血府逐瘀湯有效靶點的98.47%，占肺癌靶點的0.7%，說明血府逐瘀湯有相當多的靶點可作用于肺癌，證明血府逐瘀湯可以直接對肺癌起作用。

將靶點經(jīng)過DAVID、Metascape、KOBAS 等多個數(shù)據(jù)庫綜合分析發(fā)現(xiàn)，其中P值較高、關系密切的靶點包括：TP53、Bcl-2、Akt1。隨著基因測序的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和基因密切相關。TP53作為一種抑癌基因，對包括肺癌、食道癌、直腸癌、宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤細胞生長、衰老、凋亡起重要作用。其致癌原因主要是結構和性質(zhì)的改變，可與其他致癌蛋白（例如Ets2、AMPK）或腫瘤抑制蛋白（例如TP63、TP73）結合。目前已知TP53有18個外顯子，而且存在較高的突變率。但是也有較多研究證實，TP53 作為癌基因的同時也有抑癌基因作用［36-40］。TP53 突變（MUTP53）結構的差異性將影響不同腫瘤類型的發(fā)展［41］，通過MUTP53 和EGFR突變可以更準確地預測非小細胞肺癌患者預后［42］。有研究指出TP53 和家族性腫瘤突變密切相關［43］。MUTP53 和吸煙相關，并能增加吸煙后患肺癌的幾率［44］。TP53 不僅為靶向治療和免疫治療的重要靶點，還能調(diào)節(jié)部分藥物如順鉑的化療反應［45］。

Bcl-2 是可以影響癌細胞凋亡的重要基因。Bcl-2 家族中的Bad、Bim、Bax 等基因具有促凋亡作用，而Bcl-2、Bcl-XL 和Mcl-1 等基因有拮抗凋亡的作用。有研究指出，Bcl-2 家族的基因單核苷酸多態(tài)性不僅影響小細胞肺癌的易感性，也與非小細胞肺癌鉑類藥物化療結果相關［46-47］。血府逐瘀湯是通過Bcl-2 靶點拮抗肺癌細胞凋亡，還是抑制Bcl-2 基因的達到抗腫瘤作用，有待進一步研究。

Akt家族包括Akt1、Akt2和Akt3，在調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、轉移方面有突出作用。一般認為，Akt1影響了胃腸道腫瘤細胞，Akt2作用于乳腺、卵巢等方面。但有新研究發(fā)現(xiàn)［48］，Akt1 的抑制促進了KRAS 或表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)突變的非小細胞肺癌細胞小鼠的腦轉移程度。CHUNLING ZHANG 等［49］通過對不同患者的肺癌樣本中的PICART1 的研究發(fā)現(xiàn)高表達的PICART1 能通過AKT 信號通路抑制非小細胞肺癌細胞生長和侵襲，并誘導細胞周期停滯在G2/M期。血府逐瘀湯可以通過AKT調(diào)節(jié)肺癌細胞的轉移作用。

綜上所述，血府逐瘀湯可能通過TP53 抑制肺癌細胞的生長、衰老、凋亡，通過Bcl-2 靶點調(diào)節(jié)肺癌細胞凋亡，通過AKT調(diào)節(jié)肺癌細胞轉移。

3.3 血府逐瘀湯和肺癌共同信號通路分析血府逐瘀湯和肺癌共同通路中P值較高的有：腫瘤通路（hsa05200：Pathways in cancer）、白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)和白細胞介素13(interleukin-13，IL-13)信號傳導（R-HSA-6783783：Interleukin-4 and Interleukin-13 signaling）、信號傳導（R-HSA-162582：Signal Transduction）、免疫系統(tǒng)（R-HSA-168256：Immune System）、白細胞介素的信號傳遞（R-HSA-449147：Signaling by Interleukins）、免疫系統(tǒng)中的細胞因子信號傳導（R-HSA-1280215：Cytokine Signaling in Immune system）等血府逐瘀湯和肺癌相對重要通路。hsa05200代謝圖包含了CASP3、HER-2、Bcl-2、STAT3、p53 等眾多基因和較多通路，如：cAMP 通路、VEGF 通路、MAPK 通路、PI3K-Akt 通路、PPAR 通路等。MAPK 通路是信號從細胞表面?zhèn)鲗У郊毎藘?nèi)部的重要路徑。中間包括MAPK激酶激酶（MAP kinase kinase kinase，MKKK）、MAPK 激酶（MAP kinase kinase，MKK）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）3 種激酶。有研究發(fā)現(xiàn)，醛固酮、TUC338、fascin-1、Epigallocatechin-3-Gallate 均能通過MAPK 通路調(diào)節(jié)非小細胞肺癌細胞［50-53］。這些研究涉及的激素、非編碼核糖核酸、蛋白不僅幫助我們更好地了解MAPK 通路作用機制，也為相關藥物研發(fā)打好基礎。也有研究指出，環(huán)腺苷酸（camp）信號是抗腫瘤治療的重要靶點［54-55］。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)通路已經(jīng)成為治療肺癌的重要方式，目前抗VEGF藥物貝伐珠單抗被NCCN 指南推薦為治療肺癌的一線藥物。比較VEGF的作用，可以看出血府逐瘀湯在促進血管生長的同時有抑制血管生長的作用［56］。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學證實血府逐瘀湯可以通過TP53、Bcl-2、EGFR、akt1 等靶點及通過hsa05200、R-HSA-6783783、R-HSA-162582、R-HSA-168256、R-HSA-449147 中 的cAMP、VEGF、MAPK、PI3K-Akt、PPAR 等多種信號通路達到抑制腫瘤生長、凋亡、轉移的作用來治療中晚期氣滯血瘀型肺癌。但還存在相關藥理學實驗缺乏、檢索數(shù)據(jù)庫較少、數(shù)據(jù)庫所收文獻不全面、相關化合物和靶點未被數(shù)據(jù)庫收錄等不足。血府逐瘀湯對肺癌的作用復雜，需要有更多的相關研究和臨床試驗來驗證其作用機制。充分利用血府逐瘀湯對中晚期氣滯血瘀型肺癌的作用特點來擴展血府逐瘀湯的治療范圍和研發(fā)更適合中晚期氣滯血瘀型肺癌治療的藥物。