蛋白酶輔助孵育對薏米麩皮抗氧化活性的影響

高 珊， 閆璟圓， 張 倩， 梁乃國， 陳曉明， 徐 磊

(淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，淮安 223003)

薏米又名“菩提子、膠念珠”等，含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、礦物質(zhì)和維生素以及多糖、酚類和三萜類等活性成分，據(jù)統(tǒng)計我國年消耗薏米超過1×109kg[1]。薏米是一種加工價值極高的藥食兩用資源，具有多種生理和藥理活性[2]。薏米麩皮是薏米加工精白過程中的主要副產(chǎn)物，約占薏米籽粒質(zhì)量的25%[3]，研究表明薏米麩皮較薏米籽粒其他部位具有更高的多酚含量[4]，目前主要用作薏米油提取、飼料或者直接丟棄，利用程度較低。

麩皮作為谷物加工的重要副產(chǎn)物，具有較高的營養(yǎng)和生理價值，但其致密結(jié)構(gòu)在一定程度上限制了其功能活性的發(fā)揮[5]。物理、生物等手段可用于麩皮結(jié)構(gòu)改善和功能性成分富集[6, 7]。孵育處理主要通過調(diào)節(jié)植物體的水分含量和溫度的方式激活內(nèi)源酶發(fā)揮作用，目前已被應(yīng)用于多種谷物及其副產(chǎn)物功能活性的改善，具有操作簡便、成本低等優(yōu)點，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。Guo等[8]研究發(fā)現(xiàn)通過激活麥麩內(nèi)源植酸酶可以顯著降低其抗營養(yǎng)因子植酸鹽含量。Oh等[9]研究發(fā)現(xiàn)厭氧孵育可激活谷氨酸脫羧酶，提高大米麩皮中γ-氨基丁酸的含量。Yang等[10]利用孵育處理小麥胚芽，顯著提高了其血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制率和多肽含量。此外，孵育處理可顯著提高小麥麩皮的多酚、γ-氨基丁酸含量及其抗氧化活性，攝食孵育小麥麩皮可更好的改善小鼠高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗[11]。脫脂薏米麩皮中含有大量的內(nèi)源酶，孵育處理可顯著改善其營養(yǎng)組成和抗氧化活性[12]。但單獨孵育處理時仍存在植物體內(nèi)源酶活力低、專一性差等問題，Arte等[7]研究發(fā)現(xiàn)碳水化合物酶輔助孵育可促進小麥麩皮孵育過程中的蛋白質(zhì)降解，然而目前國內(nèi)外關(guān)于蛋白酶輔助孵育處理麩皮的研究鮮有報道。

本研究以脫脂薏米麩皮為原料，在麩皮孵育過程中分別添加酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，考察蛋白酶輔助孵育對脫脂薏米麩皮微觀結(jié)構(gòu)、蛋白分子質(zhì)量分布、總酚、總黃酮、酚酸組成及抗氧化活性的影響，以期闡明蛋白酶輔助孵育對脫脂薏米麩皮抗氧化活性的影響規(guī)律，為薏米加工副產(chǎn)物的開發(fā)利用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏米麩皮于2020年4月采購，麩皮經(jīng)正己烷脫脂，粉碎過篩后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

酸性蛋白酶(10.0×104U/g)、木瓜蛋白酶(10.0×104U/g)、中性蛋白酶(9.5×104U/g)、堿性蛋白酶(9.7×104U/g)；6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸(Trolox)、2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(TPTZ)，分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RXZ-300A人工氣候箱，TGL20M冷凍離心機，SCIENTZ-10N冷凍干燥機，SU8010掃描電子顯微鏡(SEM)，LC-2030液相色譜儀。

1.3 方法

1.3.1 脫脂薏米麩皮孵育處理

準確稱取30 g脫脂薏米麩皮于100 mL燒杯中，按料液比1∶1.5(g/mL)加入去離子水，按1 000 U/g加酶量分別添加酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，充分攪勻，50 ℃水浴鍋中孵育12 h。單獨孵育時不添加任何蛋白酶。孵育結(jié)束后樣品立即進行冷凍干燥，粉碎過篩，于4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 微觀結(jié)構(gòu)表征

將冷凍干燥好的麩皮粉末樣品用雙面膠固定于樣品臺上，進行離子濺射噴金(10 nm)處理，然后將制備好的樣品置于SEM樣品室中，設(shè)置加速電壓為10 kV，放大1 000倍觀察麩皮樣品微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.3 蛋白分子質(zhì)量分布測定

參考Zhao等[13]的方法采用分子排阻色譜進行蛋白分子質(zhì)量分布分析，準確稱取0.1 g麩皮樣品，按料液比1∶40(g/mL)加入0.05 mol/L磷酸鈉緩沖溶液(pH 6.8，含2% SDS)，室溫旋轉(zhuǎn)提取12 h，離心(10 000 g)15 min，上清液過0.45 μm濾膜后進行HPLC分析。HPLC系統(tǒng)使用TSK gel G2000 SWXL凝膠柱(300 mm×7.8 mm)；流動相為含0.2% SDS的磷酸鈉緩沖溶液(0.05 mol/L，pH 6.8)；柱溫和流速分別為30 ℃和0.7 mL/min；進樣體積和檢測器波長分別為20 μL和214 nm。

1.3.4 游離氨基酸組成測定

參考Zang等[14]的方法進行游離氨基酸組成分析，準確稱取1 g麩皮樣品，用5%三氯乙酸定容到25 mL，超聲提取30 min，然后10 000 g離心15 min，取上清液過0.45 μm的微孔濾膜后上氨基酸自動分析儀進行游離氨基酸組成測定，結(jié)果以每1 g麩皮樣品(干基)中氨基酸含量計。

1.3.5 總酚、總黃酮含量測定

參照Min等[15]提取脫脂麩皮中的游離、結(jié)合型酚類物質(zhì)，用80%甲醇定容，-40 ℃儲存待用。

采用福林酚法進行總酚含量測定[16]，取50 μL酚類物質(zhì)提取液，加入3.95 mL去離子水和0.25 mL福林酚試劑混勻，靜置6 min后加入0.75 mL 20% Na2CO3溶液和2.5 mL去離子水，混勻。40 ℃恒溫水浴避光反應(yīng)2 h，于760 nm波長處測定其吸光值，總酚含量以每100 g麩皮樣品(干基)中沒食子酸當(dāng)量計(mg GAE/100g DW)。

總黃酮含量的測定參照Amir等[17]的方法，并略做修改，取0.5 mL稀釋1倍的酚類物質(zhì)提取液，2 mL 30%乙醇溶液和150 μL 5% NaNO2溶液，振蕩混勻，6 min后加入150 μL 10% Al(NO3)3·9H2O溶液，混勻靜置6 min，再依次加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液和0.2 mL去離子水，混勻。置于黑暗處反應(yīng)15 min，于510 nm波長處測定吸光值，總黃酮含量以每100 g麩皮樣品(干基)中蘆丁當(dāng)量計(mg RE/100 g DW)。

1.3.6 酚類物質(zhì)組成測定

參考Chen等[18]的方法對麩皮樣品中的酚類物質(zhì)進行定性和定量分析，色譜條件如下：SunFire C18色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動相A為含有0.1%乙酸的去離子水，流動相B為含有0.1%乙酸的甲醇；柱溫、檢測波長、流速和進樣量分別為35 ℃、280 nm、0.9 mL/min和20 μL。

1.3.7 抗氧化活性測定

參照Benzie等[19]的方法測定鐵離子還原能力(FRAP)，取45 μL樣液于離心管中，依次加入675 μL去離子水和5.4 mL 新鮮配制的FRAP試劑，混勻。室溫避光反應(yīng)30 min，于593 nm波長處測定吸光值，F(xiàn)RAP以每1 g麩皮樣品(干基)中Trolox當(dāng)量計(μmol TE/g DW)。參照Erel等[20]的方法進行ABTS+·清除能力測定，將100 μL稀釋1倍的酚類物質(zhì)提取液與3.9 mL 新鮮配制的ABTS工作液混合，室溫避光反應(yīng)15 min，于734 nm 波長處測定吸光度值，ABTS+·清除能力以每1 g麩皮樣品(干基)中Trolox當(dāng)量計(μmol TE/g DW)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗均重復(fù)測定3次，用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析(P<0.05表示差異顯著)，用Pearson雙側(cè)檢驗法進行相關(guān)性分析，用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶輔助孵育對脫脂薏米麩皮微觀形貌的影響

如圖1所示，未孵育的脫脂薏米麩皮結(jié)構(gòu)緊密，淀粉顆粒鑲嵌在蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中，經(jīng)單獨孵育處理后，緊密結(jié)構(gòu)變得松散，蛋白質(zhì)體開始消失，被包裹的淀粉顆粒逐漸暴露出來。添加蛋白酶輔助孵育后，大的蛋白質(zhì)體已基本看不到，淀粉顆粒表面蛋白消失，變得更為光滑，其中中性和堿性蛋白酶組最為明顯。麩皮中主要含有纖維、蛋白質(zhì)和淀粉等物質(zhì)，麩皮孵育過程中激活的多種內(nèi)源酶和外源蛋白酶都可降解這些物質(zhì)，進而改善麩皮的微觀形貌[8]。

2.2 蛋白酶輔助孵育對脫脂薏米麩皮蛋白分子質(zhì)量分布的影響

由圖2可見，未孵育時脫脂薏米麩皮蛋白主要集中在F2區(qū)域(分子質(zhì)量為20.0～97.4 ku)，單獨孵育后位于F2區(qū)域的峰2和峰3面積顯著降低，而位于F3區(qū)域(分子質(zhì)量低于20.0 ku)的峰4～峰6面積升高，與研究報道孵育處理可以降解小麥麩皮蛋白生成多肽和氨基酸的結(jié)果一致[7]。添加蛋白酶后，峰2和峰3面積進一步降低，而峰4～峰6的面積進一步升高，其中堿性蛋白酶組峰2和3已基本消失，表明麩皮在孵育過程中高分子質(zhì)量蛋白發(fā)生降解，生成大量小分子多肽和氨基酸，外源蛋白酶的加入可進一步促進高分子質(zhì)量蛋白的降解。位于F1區(qū)域(分子質(zhì)量高于97.4 ku)的蛋白在蛋白酶輔助孵育處理過程中變化較小。中性和堿性蛋白酶輔助孵育過程中降解脫脂薏米麩皮蛋白質(zhì)的能力顯著高于其他蛋白酶，不同蛋白酶酶解特性的差異導(dǎo)致了麩皮蛋白分子質(zhì)量在輔助孵育過程中變化的不同[21]。多酚和黃酮類物質(zhì)可以共價鍵的形式結(jié)合于蛋白等大分子，脫脂薏米麩皮蛋白酶輔助孵育過程中蛋白的顯著降解可在一定程度上促進麩皮中結(jié)合態(tài)多酚和黃酮的釋放，提高其抗氧化活性[22]。

圖1 蛋白酶輔助孵育后脫脂薏米麩皮微觀形貌的變化(×1 000)

圖2 蛋白酶輔助孵育后脫脂薏米麩皮蛋白分子質(zhì)量分布的變化

2.3 蛋白酶輔助孵育對脫脂薏米麩皮游離氨基酸的影響

如圖3所示，脫脂薏米麩皮經(jīng)孵育處理后總游離氨基酸含量顯著增加(P<0.05)，單獨孵育時較未孵育時增加了5.41倍，這與Oh等[9]和Sang等[11]的研究結(jié)果是一致的。相較于單獨孵育，添加蛋白酶輔助孵育處理后總游離氨基酸含量增加了45.33%～120.01%(P<0.05)，中性蛋白酶和堿性蛋白酶對于總游離氨基酸的提高顯著高于其他蛋白酶(P<0.05)，這與脫脂薏米麩皮孵育過程中蛋白分子質(zhì)量分布的變化是一致的。未孵育時，精氨酸、谷氨酸和丙氨酸是脫脂薏米麩皮中的主要游離氨基酸，單獨孵育處理后各氨基酸含量均顯著增加(P<0.05)。蛋白酶輔助孵育后各游離氨基酸含量進一步增加，其中亮氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸的增加量最多，而天冬氨酸、甘氨酸的增加量最少。脫脂薏米麩皮蛋白酶輔助孵育過程中內(nèi)、外源蛋白酶的共同作用可以促進麩皮蛋白質(zhì)的充分降解，從而生成更多的游離氨基酸[21]。

注：同一指標不同字母表示數(shù)據(jù)之間存在顯著差異(P<0.05)，下同。圖3 蛋白酶輔助孵育后脫脂薏米麩皮氨基酸含量的變化

2.4 蛋白酶輔助孵育對脫脂薏米麩皮總酚和總黃酮含量的影響

多酚、黃酮類化合物是植物體中重要的次生代謝產(chǎn)物，可以游離型和結(jié)合型的形式存在，具有多種生理和藥理活性[23]。由圖4可見，脫脂薏米麩皮經(jīng)單獨孵育處理后，游離型、結(jié)合型和總多酚、黃酮含量顯著增加(P<0.05)。相較于單獨孵育，添加蛋白酶孵育后游離型多酚含量提高了3.93%～19.21%，結(jié)合型多酚含量未發(fā)生顯著變化(P>0.05)，總多酚含量提高了2.61%～11.51%；游離型黃酮含量提高了21.89%～39.00%，結(jié)合型黃酮含量未發(fā)生顯著變化(P>0.05)，總黃酮含量提高了12.30%～21.68%；中性蛋白酶對于游離型和總多酚、黃酮含量的提高顯著高于其他蛋白酶(P<0.05)，而酸性蛋白酶的效果最差(P>0.05)。脫脂薏米麩皮孵育過程中蛋白酶、纖維素酶等內(nèi)源酶被激活，可水解植物細胞壁促進結(jié)合態(tài)多酚和黃酮類物質(zhì)釋放。與本研究結(jié)果類似，Shang等[11]在小麥麩皮孵育過程中也報道了顯著提高的游離多酚含量。外源酶制劑的加入可進一步促進麩皮中大分子物質(zhì)的降解，提高游離型多酚和黃酮的含量[7]。

圖4 蛋白酶輔助孵育后脫脂薏米麩皮總酚和總黃酮含量的變化

2.5 蛋白酶輔助孵育對脫脂薏米麩皮酚酸組成的影響

如表1所示，脫脂薏米麩皮共檢出6種游離型和5種結(jié)合型酚酸。蛋白酶輔助孵育處理后酚酸種類未發(fā)生改變，但其含量發(fā)生顯著變化。麩皮樣品中原兒茶酸和咖啡酸僅以游離型的形式存在，單獨孵育后含量顯著增加(P<0.05)，蛋白酶輔助處理后進一步提高(P<0.05)。單獨孵育后，游離型、結(jié)合型和總香草酸含量顯著增加(P<0.05)，相較于單獨孵育，蛋白酶輔助處理后除木瓜蛋白酶組外游離型和總香草酸含量均顯著增加(P<0.05)，而結(jié)合型含量未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。香豆酸主要以結(jié)合型的形式存在，單獨孵育后其游離型、結(jié)合型和總量顯著增加(P<0.05)，相較于單獨孵育，蛋白酶輔助處理后游離型香豆酸含量提高了2.60%～13.36%，而結(jié)合型和總量未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。阿魏酸也主要以結(jié)合型的形式存在，單獨孵育后其游離型、結(jié)合型和總量顯著增加(P<0.05)，蛋白酶輔助處理后游離型、結(jié)合型和總阿魏酸含量進一步增加。芥子酸以游離型和結(jié)合型的形式存在，相較于單獨孵育，蛋白酶輔助處理后游離型芥子酸含量均顯著增加(P<0.05)，但不同蛋白酶組間無顯著差異(P>0.05)，而結(jié)合型含量未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。丁香酸僅以游離型的形式存在，單獨孵育后增加了158.33%，而蛋白酶輔助處理后含量未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。蛋白酶輔助孵育過程中由于麩皮內(nèi)源酶和外加蛋白酶的共同作用可釋放脫脂薏米麩皮內(nèi)以結(jié)合狀態(tài)存在的酚酸，改變麩皮的酚酸組成[24]。

表1 蛋白酶輔助孵育后脫脂薏米麩皮酚酸組成的變化/μg/g DW

2.6 蛋白酶輔助孵育對脫脂薏米麩皮抗氧化活性的影響

由圖5可見，脫脂薏米麩皮經(jīng)單獨孵育處理后，游離型、結(jié)合型和總FRAP分別增加了40.08%、13.02%和29.39%，而游離型、結(jié)合型和總ABTS+·清除能力分別增加了13.32%、5.31%和9.34%。相較于單獨孵育，添加蛋白酶孵育后游離型FRAP提高了1.68%～14.61%，結(jié)合型FRAP未發(fā)生顯著變化(P>0.05)，總FRAP提高了1.47%～9.18%；游離型ABTS+·清除能力提高了1.51%～8.93%，結(jié)合型ABTS+·清除能力未發(fā)生顯著變化(P>0.05)，總ABTS+·清除能力提高了0.54%～3.75%；中性蛋白酶對于游離型和總FRAP和ABTS+·清除能力的提高顯著高于其他蛋白酶(P<0.05)，而酸性蛋白酶的效果最差(P>0.05)。研究表明多酚、黃酮類化合物具有較高的抗氧化活性[25]，脫脂薏米麩皮蛋白酶輔助孵育過程中顯著提高的總酚和總黃酮含量都可能在一定程度上促進了其抗氧化活性的提高。與本研究結(jié)果類似，孵育處理被報道可顯著提高小麥麩皮的抗氧化活性[11]。

圖5 蛋白酶輔助孵育后脫脂薏米麩皮FRAP和ABTS+·清除能力的變化

2.7 脫脂薏米麩皮總酚、總黃酮含量和抗氧化活性的相關(guān)性分析

為進一步明確脫脂薏米麩皮總酚、總黃酮含量與FRAP、ABTS+·清除能力之間的關(guān)系，對不同蛋白酶輔助孵育處理后的數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表2?？偡雍颗cFRAP和ABTS+·清除能力均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，總黃酮含量與FRAP和ABTS+·清除能力也均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，說明脫脂薏米麩皮總酚、總黃酮含量越高，其FRAP和ABTS+·清除能力越強，表明酚類、黃酮類物質(zhì)是脫脂薏米麩皮中發(fā)揮抗氧化活性的主要貢獻物質(zhì)[26]。此外，脫脂薏米麩皮的FRAP和ABTS+·清除能力之間存在極顯著正相關(guān)(P<0.01)，這與Thaipong等[27]報道的番石榴提取物不同抗氧化活性測定方法之間存在顯著相關(guān)性的結(jié)果類似。

表2 脫脂薏米麩皮總酚、總黃酮含量與抗氧化活性相關(guān)性分析

3 結(jié)論

蛋白酶輔助孵育后脫脂薏米麩皮微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，蛋白質(zhì)體消失，淀粉顆粒表面變得更加光滑。薏米麩皮蛋白在輔助孵育后發(fā)生更大程度的降解，游離氨基酸含量顯著增加(P<0.05)。與單獨孵育時相比，蛋白酶輔助孵育可顯著提高游離型多酚、黃酮含量(P<0.05)，而對結(jié)合型多酚、黃酮含量無顯著影響(P>0.05)。薏米麩皮中共檢出6種游離型酚酸和5種結(jié)合型酚酸，相較單獨孵育，蛋白酶輔助孵育后游離型酚酸含量顯著增加(P<0.05)，同時游離型FRAP和ABTS+·清除能力顯著增強(P<0.05)。此外，相關(guān)性實驗表明酚類、黃酮類物質(zhì)是脫脂薏米麩皮中發(fā)揮抗氧化活性的主要貢獻物質(zhì)。中性蛋白酶相較于其他蛋白酶具有更好的輔助孵育提高抗氧活性的作用。