高遷移率族蛋白B1 在重型創(chuàng)傷性顱腦損傷患者腸黏膜屏障功能損傷發(fā)生機(jī)制中的作用研究

孫旭日 趙彥萍 劉霞 吳玲 唐恩波 杜春紅

創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)患者常合并腸黏膜屏障功能損傷,使得腸源性毒素和細(xì)菌易位,導(dǎo)致腸源性感染,誘發(fā)全身炎癥反應(yīng),甚至導(dǎo)致多器官功能障礙［1-3］,但TBI 出現(xiàn)腸黏膜屏障功能損傷的機(jī)制并未完全闡明。近年來研究發(fā)現(xiàn)［4-6］,高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)在炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色,其與腸黏膜屏障功能損傷的相關(guān)研究也逐漸引起關(guān)注。為此,本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定重型TBI 患者不同時(shí)間血HMGB1 水平及相關(guān)炎癥反應(yīng)指標(biāo)、腸黏膜屏障功能指標(biāo),分析重型TBI 血HMGB1 水平與炎癥反應(yīng)指標(biāo)及腸黏膜屏障功能指標(biāo)的相關(guān)性,初步探討HMGB1 在重型TBI 患者腸道黏膜屏障功能損傷發(fā)生機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取昌吉州中醫(yī)醫(yī)院2017 年9 月～2018 年8 月收治的30 例重型TBI 患者作為觀察組,另選取同期30 例健康體檢者作為對(duì)照組。觀察組男17 例,女13 例；年齡28～77 歲,平均年齡(55.03±13.98)歲；格拉斯哥昏迷量表(GCS)評(píng)分3～8 分,平均GCS 評(píng)分(6.17±1.53)分。對(duì)照組男18 例,女12 例；年齡27～77 歲,平均年齡(53.67±15.23)歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。所有研究對(duì)象臨床資料完整。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)［7］：①經(jīng)顱腦CT 證實(shí)為創(chuàng)傷性顱腦損傷；②年齡>20 歲；③入院前無感染征象；④單純顱腦外傷(GCS 評(píng)分<9 分)。排除標(biāo)準(zhǔn)［8］：①嚴(yán)重復(fù)合傷患者；②入院前存在其他臟器衰竭；③有免疫缺陷疾病；④兒童和80 歲以上的老年患者。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡20～80 歲,無基礎(chǔ)疾病。本項(xiàng)目經(jīng)昌吉州中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意,并征得患者家屬及健康體檢者知情同意。

1.2 方法 觀察組在給予脫水降顱壓、維持水電解質(zhì)平衡等綜合治療期間采用GCS 評(píng)價(jià)昏迷嚴(yán)重程度,分別在傷后6、24、48 h 抽取外周靜脈血標(biāo)本3 ml。對(duì)照組于健康體檢時(shí)抽血留取外周靜脈血標(biāo)本3 ml。血樣標(biāo)本分別轉(zhuǎn)入生化管及去熱源肝素化處理的內(nèi)毒素專用試管,離心機(jī)3000 r/min 離心分離上清液,留取上清液-70℃保存?zhèn)溆?集中行ELISA 檢測(cè)HMGB1、TNF-α、IL-1β、IL-6、DAO、D-Lac 及LPS 水平。主要試劑與儀器：人HMGB1、TNF-α、IL-1β、IL-6、DAO、D-Lac 及LPS 的ELISA 檢測(cè)試劑盒(上?？道噬锕咎峁?、酶聯(lián)免疫反應(yīng)加速儀(NY/MMJ)、MB580 酶標(biāo)儀(Heales)、恒溫水箱(WSZ-261-71)、離心機(jī)。根據(jù)上?？道使咎峁┑腅LISA 試劑盒說明書實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行,MB580 酶標(biāo)儀(Heales)自動(dòng)分析,讀取檢測(cè)結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo) ①比較觀察組傷后6 h 與對(duì)照組腸黏膜屏障功能指標(biāo)(DAO、D-Lac 及LPS)及血清炎癥反應(yīng)指標(biāo)(HMGB1、TNF-α、IL-1β、IL-6)。②比較觀察組傷后6、24、48 h 腸黏膜屏障功能指標(biāo)和血清炎癥反應(yīng)指標(biāo)。③分析重型TBI 患者傷后6 h 血清HMGB1 與TNF-α、IL-1β 及IL-6 的相關(guān)性 。④分析重型TBI 患者傷后6 h 血清HMGB1 與DAO、D-Lac及LPS 的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ()表示,采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組傷后6 h 與對(duì)照組腸黏膜屏障功能指標(biāo)比較 觀察組傷后6 h DAO、D-Lac 及LPS 水平均高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 觀察組傷后6 h 與對(duì)照組腸黏膜屏障功能指標(biāo)比較()

表1 觀察組傷后6 h 與對(duì)照組腸黏膜屏障功能指標(biāo)比較()

注：與對(duì)照組比較,aP<0.05

2.2 觀察組傷后6、24、48 h 腸黏膜屏障功能指標(biāo)比較 觀察組傷后24 及48 h DAO、D-Lac、LPS 水平均高于傷后6 h,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；觀察組傷后24 h 與48 h DAO、D-Lac、LPS 水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 觀察組傷后6、24、48 h 腸黏膜屏障功能指標(biāo)比較(,n=30)

表2 觀察組傷后6、24、48 h 腸黏膜屏障功能指標(biāo)比較(,n=30)

注：與傷后6 h 比較,aP<0.05

2.3 觀察組傷后6 h 與對(duì)照組血清炎癥反應(yīng)指標(biāo)比較觀察組傷后6 h HMGB1、TNF-α、IL-1β 及IL-6 水平均高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 觀察組傷后6 h 與對(duì)照組血清炎癥反應(yīng)指標(biāo)比較()

表3 觀察組傷后6 h 與對(duì)照組血清炎癥反應(yīng)指標(biāo)比較()

注：與對(duì)照組比較,aP<0.05

2.4 觀察組傷后6、24、48 h 血清炎癥反應(yīng)指標(biāo)比較觀察組傷后24 及48 h HMGB1、TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于傷后6 h,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；觀察組傷后24 h 與48 h HMGB1、TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 觀察組傷后6、24、48 h 血清炎癥反應(yīng)指標(biāo)比較(,n=30)

表4 觀察組傷后6、24、48 h 血清炎癥反應(yīng)指標(biāo)比較(,n=30)

注：與傷后6 h 比較,aP<0.05

2.5 重型TBI 患者傷后6 h 血清HMGB1 與TNF-α、IL-1β 及IL-6 的相關(guān)性分析 重型TBI 患者傷后6 h血清HMGB1 與TNF-α 呈正相關(guān)(r=0.597,P<0.05)(見圖1),與IL-1β 無相關(guān)性(r=0.210,P>0.05)(見圖2),與IL-6 呈正相關(guān)(r=0.651,P<0.05)(見圖3)。

圖1 重型TBI 患者血清HMGB1 水平與TNF-α 相關(guān)性分析

圖2 重型TBI 患者血清HMGB1 水平與IL-1β 相關(guān)性分析

圖3 重型TBI 患者血清HMGB1 水平與IL-6 相關(guān)性分析

2.6 重型TBI 患者傷后6 h 血清HMGB1 與DAO、D-Lac 及LPS 的相關(guān)性分析 重型TBI 患者傷后6 h血清HMGB1與DAO呈正相關(guān)(r=0.488,P<0.05)(見圖4),與D-Lac 呈正相關(guān)(r=0.407,P<0.05)(見圖5),與LPS呈正相關(guān)(r=0.466,P<0.05)(見圖6)。

圖4 重型TBI 患者血清HMGB1 水平與DAO 相關(guān)性分析

圖5 重型TBI 患者血清HMGB1 水平與D-Lac 相關(guān)性分析

圖6 重型TBI 患者血清HMGB1 水平與LPS 相關(guān)性分析

3 討論

TBI 患者常合并腸黏膜屏障功能損傷,其損傷機(jī)制尚未完全闡明,因此TBI 合并腸黏膜屏障功能損傷的發(fā)病機(jī)制成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)［9］。腸黏膜屏障功能損傷可以從腸道組織形態(tài)學(xué)檢查進(jìn)行反應(yīng),但臨床上獲取腸道黏膜組織標(biāo)本存在較大困難,因此更多的是從血清學(xué)上評(píng)價(jià)腸黏膜屏障功能完整性,常采用DAO、D-Lac 和LPS 間接評(píng)估腸道黏膜屏障功能的損傷嚴(yán)重程度［10-13］。本研究結(jié)果顯示,重型TBI 患者在傷后6 h即出現(xiàn)血清DAO、D-Lac、LPS持續(xù)升高,在24 h達(dá)峰值,維持至傷后48 h 仍無明顯下降趨勢(shì),該現(xiàn)象說明重型TBI 患者在傷后早期即可出現(xiàn)腸黏膜屏障功能損傷,而且能持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。

近年研究發(fā)現(xiàn),HMGB1 具有強(qiáng)大的促炎作用,是器官損傷的關(guān)鍵介質(zhì)之一［14］。在本實(shí)驗(yàn)中,重型TBI患者在傷后6 h 的炎癥反應(yīng)指標(biāo)中HMGB1、TNF-α、IL-1β 及IL-6 較健康體檢者均有不同程度的升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此說明重型TBI 患者傷后即出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。分析這些炎癥反應(yīng)指標(biāo)在傷后6、24 及48 h 時(shí)間點(diǎn)的變化,發(fā)現(xiàn)重型TBI 患者炎癥反應(yīng)早期即出現(xiàn)逐漸加重,在傷后24 h 可以達(dá)峰值,而且持續(xù)至傷后48 h 仍無下降趨勢(shì)。重型TBI 患者傷后炎癥反應(yīng)指標(biāo)的變化與腸道黏膜屏障功能損傷指標(biāo)的變化具有一致性,因此推測(cè)炎癥反應(yīng)可能介導(dǎo)了重型TBI患者腸道黏膜屏障功能的損傷［15,16］。這與國(guó)內(nèi)龐永斌等［17］報(bào)道,一組106 例急性重度閉合性顱腦損傷患者中存在血清HMGB1、TNF-α 和IL-6 高表達(dá)水平的情況相一致。

HMGB1 作為炎癥反應(yīng)的核心因子,其與腸黏膜屏障損傷的相關(guān)研究方面也逐漸引起關(guān)注。研究［18］發(fā)現(xiàn),HMGB1 在急性重癥胰腺炎患者中的表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組,而且與腸道黏膜通透性指標(biāo)DAO、LPS 呈正相關(guān),該研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)HMGB1 與腸屏障功能障礙的嚴(yán)重程度相關(guān),為HMGB1 可能是引起小腸黏膜屏障損傷的關(guān)鍵因素提供了直接證據(jù)。在本次實(shí)驗(yàn)中,重型TBI 患者傷后6 h 血清HMGB1 水平與腸道黏膜屏障功能指標(biāo)DAO、D-Lac、LPS 呈正相關(guān),說明HMGB1 可能與重型TBI 患者腸道黏膜屏障功能損傷具有緊密聯(lián)系。進(jìn)而本課題組分析了重型TBI 患者傷后6 h 血清HMGB1 與血清TNF-α、IL-1β 及IL-6 的相關(guān)性,相關(guān)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HMGB1 與血清TNF-α、IL-6呈正相關(guān)。研究結(jié)果也說明了HMGB1參與了炎癥反應(yīng),可能是非常重要的炎癥介質(zhì),觸發(fā)炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致腸黏膜屏障功能損傷。文獻(xiàn)報(bào)道［19］能解釋本課題組的結(jié)果,在機(jī)體損傷時(shí)應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的致炎因子與細(xì)胞膜表面相應(yīng)受體結(jié)合,觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)HMGB1 的合成和釋放,HMGB1 可與晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)和Toll 樣受體4 相結(jié)合激活核因子-kB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,并產(chǎn)生大量炎癥因子,包含IL-1β、TNF-α 和IL-6 等,導(dǎo)致炎癥反應(yīng),炎癥因子又反過來促進(jìn)HMGB1的分泌,其形成了一個(gè)正反饋,啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

綜上所述,重型TBI 患者在傷后早期即出現(xiàn)炎癥反應(yīng)和腸黏膜屏障功能損傷,炎癥反應(yīng)可能參與了腸黏膜屏障功能損傷的發(fā)生機(jī)制,而HMGB1 可能在炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的腸黏膜屏障功能損傷發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)然,HMGB1 如何介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與重型TBI 患者腸道黏膜屏障功能還需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步闡明。