抗酸分枝桿菌熒光染色與Ziehl-Neelsen法在抗酸分枝桿菌檢測中的應(yīng)用比較

彭 鳳，何 金，李瓊瓊，蔣立人，師曉琴，林 軍

2019年全球約1 000萬人罹患結(jié)核病，其中中國患者占全球感染總?cè)藬?shù)的8.4%[1]。2020年全球結(jié)核病報(bào)告指出結(jié)核病最常見死因是由單一傳染源導(dǎo)致的[2]，結(jié)核分枝桿菌是常見的感染菌之一，可感染全身各器官，其中以肺部最易感染[3-4]。早期診斷對治療和阻斷結(jié)核分枝桿菌傳播具有重要意義。目前，檢測結(jié)核分枝桿菌最常用的方法是Ziehl-Neelsen法，但其對處于潛伏期的結(jié)核分枝桿菌檢出率較低[5-6]。此外，培養(yǎng)法也是一種較為常用的檢測方法，但通常需要2～8周時(shí)間，耗時(shí)較長[7]。PCR技術(shù)可擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌DNA[8]，但不能區(qū)分活菌和死菌以及菌體形態(tài)[9-10]，有假陽性的可能[11]。本科室使用抗酸分枝桿菌熒光染色檢測抗酸分枝桿菌，可縮短檢測時(shí)間，提高效率，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2020年1月～2021年6月上海市第一人民醫(yī)院存檔的91例肉芽腫性病變的常規(guī)石蠟標(biāo)本以及576例體液標(biāo)本，包括肺泡灌洗液、尿液、胸水、痰等。從91例患者石蠟標(biāo)本中各采集3個(gè)樣本，分別行抗酸染色、抗酸分枝桿菌熒光染色和HE染色。

1.2 標(biāo)本處理人體組織離體后，經(jīng)10%中性福爾馬林固定6～48 h，脫水，浸蠟，制成組織蠟塊。組織切片經(jīng)70 ℃烤片2 h后，再放入二甲苯中脫蠟15 min×2次，經(jīng)過100%、95%、70%梯度乙醇脫水，放入自來水中備用。體液樣本處理方法：將肺泡灌洗液、尿液、胸水等樣本倒入50 mL離心管中，2 200 r/min離心5min，去上清后加入10%中性福爾馬林中固定2 h；痰液中加入溶痰試劑，加入10%中性福爾馬林固定2 h。2 200 r/min離心5 min，去上清后加入細(xì)胞清洗液清洗，離心后取沉淀物涂片，55 ℃烤15 min待用。

1.3 Ziehl-Neelsen法Ziehl-Neelsen法用于標(biāo)識抗酸分枝桿菌，購自珠海貝索公司。切片脫蠟后，控干，用流水沖洗，滴加石碳酸復(fù)紅染液于切片上，室溫染色10～15 min，水洗，控干，滴加酸性乙醇脫色1～2 min，重復(fù)至紅色消失，水洗，加亞甲基藍(lán)溶液20～30 s，水洗。濾紙吸干水分，中性樹膠封固。

1.4 抗酸分枝桿菌熒光染色抗酸分枝桿菌熒光染色液，購自江蘇供贏聯(lián)生物公司，抗酸分枝桿菌熒光染色試劑(無苯酚)主要成分由媒染劑、熒光素、鹽酸、乙醇、復(fù)染劑、純水及其他等組成。準(zhǔn)備涂片或石蠟組織切片，水洗后控干待檢；加2滴熒光染色液(A液)，覆蓋樣本，室溫染色15 min，流水沖洗，再滴加脫色液(B液)1～3 min，水洗，直至肉眼觀察無染料顏色，在熒光顯微鏡下觀察，無雜質(zhì)或壞死部位著色，晾干后用中性樹膠封固，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢測結(jié)果一致性分析采用K系數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

91例伴肉芽腫性病變的石蠟包埋組織，分別用抗酸分枝桿菌熒光染色和Ziehl-Neelsen法進(jìn)行抗酸分枝桿菌檢測。經(jīng)兩位病理醫(yī)師閱片后，Ziehl-Neelsen法檢測14例陽性，77例陰性?？顾岱种U菌熒光染色檢測27例陽性，64例陰性?？顾岱种U菌熒光染色法陽性率(29.67%)高于Ziehl-Neelsen法(15.38%)(表1)。

表1 不同方法檢測抗酸分枝桿菌的比較

在91例伴肉芽腫性病變中，有75例t-spot陰性，采用抗酸分枝桿菌熒光染色重新檢測，75例中有10例陽性，占13.33%。其原因可能是由于檢出物為非結(jié)核性抗酸，或是疾病處于潛伏期，t-spot未能有效檢測。Ziehl-Neelsen法檢測77例陰性，采用抗酸分枝桿菌熒光染色重新檢測，17例陽性，占22.07%。其原因之一是由于患者服用藥物破壞了抗酸分枝桿菌的抗酸性，Ziehl-Neelsen法未能檢出，但熒光染色仍存在，用熒光染色可檢出陽性，表明抗酸分枝桿菌熒光染色更靈敏。

在576例體液樣本中，抗酸分枝桿菌熒光染色檢測抗酸分枝桿菌的陽性率為10.94%。按照陽性率高低排序分別為：灌洗液(13.21%)>痰(9.86%)>胸水(4.16%)>尿液(0)(表2)。

表2 抗酸分枝桿菌熒光染色檢測體液樣本的陽性率

肺組織的Ziehl-Neelsen抗酸染色，抗酸分枝桿菌呈粉色桿狀(圖1)；而熒光染色后呈亮黃色桿狀，更易于識別(圖2)；支氣管活檢組織抗酸分枝桿菌熒光染色呈強(qiáng)陽性(圖3)。另外，對體液樣本進(jìn)行熒光染色呈陽性，如肺泡灌洗液、痰、胸水(圖4～6)。

圖1 肺組織抗酸分枝桿菌檢測：呈粉色桿狀，Ziehl-Neelsen染色法 圖2 肺組織抗酸分枝桿菌檢測：呈亮黃色桿狀，熒光染色 圖3 支氣管活檢組織抗酸分枝桿菌檢測：呈亮黃色桿狀，熒光染色 圖4 痰液抗酸分枝桿菌檢測：呈亮黃色桿狀，熒光染色 圖5 肺泡灌洗液抗酸分枝桿菌檢測：呈亮黃色桿狀，熒光染色 圖6 胸水抗酸分枝桿菌檢測：呈亮黃色桿狀，熒光染色

3 討論

Ziehl-Neelsen法是檢測抗酸分枝桿菌最常用的方法，可用于痰涂片和組織切片染色，其缺點(diǎn)是敏感性低，總陽性率不高，但操作簡單方便。目前，Ziehl-Neelsen法仍是國內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院，用于檢測體液或組織樣本中抗酸分枝桿菌的主要方法。

本實(shí)驗(yàn)對比抗酸分枝桿菌熒光染色和Ziehl-Neelsen法對抗酸分枝桿菌的診斷效能，結(jié)果顯示：抗酸分枝桿菌熒光染色陽性率高于Ziehl-Neelsen法，分析其原因在于抗酸分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量脂質(zhì)包圍在肽聚糖外，導(dǎo)致Ziehl-Neelsen法檢測不易著色，而經(jīng)過熒光染色后，熒光素與樣本中抗酸分枝桿菌細(xì)胞壁相應(yīng)抗原結(jié)合后，在熒光顯微鏡激發(fā)光下呈特異性熒光成像，呈亮黃色，色差明顯，便于識別。Ziehl-Neelsen法檢測操作簡單方便，價(jià)格優(yōu)惠，但受標(biāo)本質(zhì)量、實(shí)驗(yàn)條件以及溫度等影響較大，對相同樣本檢出的陽性率比熒光染色低1.93倍，有一定程度的不足。

另外，對于t-spot檢測為陰性的樣本，重新用抗酸分枝桿菌熒光染色檢測，篩選出部分遺漏的抗酸分枝桿菌陽性樣本。本組還對Ziehl-Neelsen法檢測為陰性的樣本，應(yīng)用抗酸分枝桿菌熒光染色重新檢測，篩出部分遺漏的陽性樣本。上述結(jié)果表明抗酸分枝桿菌熒光染色可在一定程度上降低漏診率，彌補(bǔ)Ziehl-Neelsen法的缺陷，提高準(zhǔn)確率。還可對體液樣本進(jìn)行檢測，如：肺泡灌洗液、尿液、胸水、痰等。體液組織比石蠟組織切片更易獲取，且可以多次、分時(shí)段獲取。576例體液樣本中抗酸分枝桿菌的陽性率為10.94%。

本實(shí)驗(yàn)中抗酸分枝桿菌熒光染色比Ziehl-Neelsen法的抗酸分枝桿菌檢出率高1.93倍，抗酸分枝桿菌熒光染色在低倍鏡下可觀察菌體呈亮黃色，背景黑暗，具有清晰的形態(tài)特征，易于檢測。Ziehl-Neelsen法需先用40×物鏡觀察，再用100×油鏡觀察形態(tài)，每個(gè)標(biāo)本需觀察300個(gè)以上視野，易漏檢。熒光染色法在含菌量低時(shí)能夠顯著提高陽性的檢出率，降低漏診率，結(jié)果判讀快速準(zhǔn)確，可節(jié)省時(shí)間和精力。因此，抗酸分枝桿菌熒光染色具有更高的臨床應(yīng)用價(jià)值，更適用于基層醫(yī)院推廣使用。

綜上所述，抗酸分枝桿菌熒光染色在輔助診斷結(jié)核患者中具有較高的效能和應(yīng)用價(jià)值，但對于小部分較難判斷或有其他未知影響因素的患者需配合其他輔助診斷，以增加結(jié)核患者診斷的準(zhǔn)確性和可靠性。