不同條件下四種脫鈣液脫鈣效果的對(duì)比分析

姚馨悅，吉佳樂，葉雙慧，趙慶寧，何志承

在病理制片過程中常會(huì)遇到骨組織或鈣化組織，由于其含有豐富的骨鹽，導(dǎo)致制片效果不佳，需使用脫鈣液進(jìn)行脫鈣預(yù)處理。在日常工作中，對(duì)脫鈣液的要求包括：脫鈣時(shí)間短，能較好地保存骨組織形態(tài)以及各類抗原等。目前，各實(shí)驗(yàn)室常用的脫鈣液效果參差不齊，影響病理診斷的準(zhǔn)確性。因此，迫切需要一種較為理想的脫鈣條件應(yīng)用于日常骨組織的處理。根據(jù)以往研究結(jié)果[1-3]，本實(shí)驗(yàn)將10%EDTA、5%鹽酸氯化鈉、5%硝酸甲醛、5%鹽酸甲醛4種脫鈣液進(jìn)行對(duì)比，分別在室溫靜置、超聲、微波條件下對(duì)脫鈣時(shí)間及效果進(jìn)行分析，以期摸索出更為適合日常骨組織處理的脫鈣液及使用條件。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本選取陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院送檢的骨組織8例，每例分別用骨鋸切成大小1 cm×1 cm×0.3 cm的骨塊12個(gè)，經(jīng)10%中性福爾馬林固定24 h，用于后續(xù)脫鈣實(shí)驗(yàn)。

1.2 脫鈣液10%EDTA脫鈣液：購于赫特生物公司。5%鹽酸氯化鈉脫鈣液：5 mL HCl，15 g NaCl，蒸餾水加至100 mL。5%硝酸甲醛脫鈣液：10%中性福爾馬林10 mL，硝酸5 mL，蒸餾水加至100 mL。5%鹽酸甲醛脫鈣液：10%中性福爾馬林10 mL，濃鹽酸5 mL、蒸餾水加至100 mL。

1.3 主要儀器Leica 2245石蠟切片機(jī)，Leica AacadiaH全自動(dòng)包埋機(jī)，Leica ASP300S脫水機(jī)，Leica Autostainer XLST5010自動(dòng)染色機(jī)，昆山KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器，格蘭仕P70D20TL-D4型微波爐。

1.4 方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)分組 將所有組織標(biāo)本分為三組，并按照不同條件進(jìn)行脫鈣：第一組為室溫靜置脫鈣；第二組為微波脫鈣；第三組為超聲脫鈣。

1.4.2脫鈣方法 (1)第一組：室溫下將標(biāo)本分別放入裝有4種脫鈣液的燒杯中靜置，每隔12 h換1次脫鈣液，直至脫鈣終點(diǎn)。(2)第二組：將標(biāo)本分別置于4個(gè)試管內(nèi)，再分別加入4種脫鈣液。將試管放入裝有250 mL蒸餾水的500 mL燒杯中，并將微波爐調(diào)至最低檔(輸出功率120 W)，脫鈣5 min后取出，更換燒杯中的水，室溫條件下降溫2 min，再重復(fù)上述步驟脫鈣5 min，震蕩混勻脫鈣液，每隔30 min換1次脫鈣液，直至微波處理累積90 min，最后靜置至脫鈣終點(diǎn)。(3)第三組：將標(biāo)本分別放置于裝有4種脫鈣液的燒瓶中，并放入超聲波清洗器中進(jìn)行超聲脫鈣(超聲頻率40 KHZ)，脫鈣5 min，靜置2 min(脫鈣時(shí)間與微波組相同)，繼續(xù)置入超聲儀中處理5 min，每隔30 min換1次脫鈣液，直至超聲累積處理90 min，再靜置至脫鈣終點(diǎn)。

1.4.3脫鈣終點(diǎn)判斷 脫鈣處理后，每隔12 h更換1次脫鈣液，每隔1 h觀察脫鈣情況，以大頭針能輕松刺進(jìn)骨皮質(zhì)作為脫鈣終點(diǎn)標(biāo)志。

1.4.4脫鈣后處理 脫鈣后標(biāo)本流水沖洗30 min，常規(guī)脫水，切片，行HE染色和免疫組化EnVision法染色檢測SATB2的表達(dá)，鏡下觀察組織的結(jié)構(gòu)及染色情況。

2 結(jié)果

2.1 脫鈣時(shí)間比較4種脫鈣液脫鈣時(shí)間：5%硝酸甲醛脫鈣液<5%鹽酸甲醛液脫鈣液<5%鹽酸氯化鈉脫鈣液<10%EDTA脫鈣液。比較同一脫鈣液中的三種脫鈣處理?xiàng)l件：微波條件下耗時(shí)最短，超聲條件次之，室溫靜置最慢。結(jié)合以上兩種結(jié)果初步得出以下結(jié)論：工作中可選用5%硝酸甲醛脫鈣液，利用微波條件進(jìn)行脫鈣，耗時(shí)最短(表1)。

表1 不同脫鈣液與脫鈣條件對(duì)脫鈣時(shí)間的影響

2.2 HE染色效果比較10%EDTA脫鈣液與5%硝酸甲醛脫鈣液處理后的骨組織脫鈣充分均勻，切片完整不易掉片，且切片無皺痕、無刀痕，鏡下見組織結(jié)構(gòu)完整，骨板形態(tài)清晰，細(xì)胞核呈藍(lán)色，核仁清晰，核質(zhì)對(duì)比鮮明(圖1A、B)。5%鹽酸甲醛脫鈣液效果稍次之，鏡下見組織結(jié)構(gòu)完整，但部分核紅染、核質(zhì)對(duì)比不佳(圖1C)。5%鹽酸氯化鈉脫鈣液效果最差，切片過程中部分組織有沙粒感，脫鈣不均勻，鏡下可明顯觀察到核染色發(fā)紅且結(jié)構(gòu)不清(圖1D)。室溫靜置條件下脫鈣效果最好，微波、超聲條件均較好。比較分析4種HE染色結(jié)果顯示：10%EDTA脫鈣液與5%硝酸甲醛脫鈣液處理后的骨組織，HE染色效果最佳。

圖1 微波條件下經(jīng)4種脫鈣液脫鈣的骨組織：A.10%EDTA脫鈣液脫鈣的骨組織；B.5%硝酸甲醛脫鈣液脫鈣的骨組織；C.5%鹽酸甲醛脫鈣液脫鈣的骨組織；D.5%鹽酸氯化鈉脫鈣液脫鈣的骨組織 圖2 微波條件下經(jīng)4種脫鈣液脫鈣的骨組織免疫組化染色：A.10%EDTA脫鈣液脫鈣的骨組織中SATB2的表達(dá)，EnVision法；B.5%硝酸甲醛脫鈣液脫鈣的骨組織中SATB2的表達(dá)，EnVision法；C.5%鹽酸甲醛脫鈣液脫鈣的骨組織中SATB2的表達(dá)，EnVision法；D.5%鹽酸氯化鈉脫鈣液脫鈣的骨組織中SATB2的表達(dá)，EnVision法

2.3 免疫組化SATB2染色效果比較標(biāo)本經(jīng)4種脫鈣液脫鈣后行免疫組化染色，SATB2均陽性，其中10%EDTA脫鈣液(圖2A)與5%硝酸甲醛脫鈣液(圖2B)處理后的骨組織免疫組化染色效果最佳，陽性細(xì)胞表達(dá)明顯且定位準(zhǔn)確，但也存在部分非特異性著色情況。5%鹽酸甲醛脫鈣液脫鈣處理后免疫組化染色掉片較為嚴(yán)重(圖2C)，且存在部分非特異性著色；5%鹽酸氯化鈉脫鈣液脫鈣處理后免疫組化陽性信號(hào)較弱且輕微卷片(圖2D)。微波條件下效果最好，超聲次之，室溫靜置條件下相對(duì)最差。比較4種脫鈣液脫鈣后的免疫組化染色結(jié)果顯示：10%EDTA脫鈣液和5%硝酸甲醛脫鈣液處理后的骨組織SATB2染色效果最佳。

3 討論

組織內(nèi)含有骨質(zhì)或鈣化灶時(shí)，直接脫水包埋后切片質(zhì)量差，故需先進(jìn)行脫鈣處理，軟化組織后再進(jìn)行脫水包埋切片。骨質(zhì)由有機(jī)成分和無機(jī)成分組成，有機(jī)成分由90%膠原纖維和基質(zhì)組成，無機(jī)成分由骨鹽組成，骨鹽是羥基磷灰石結(jié)晶，沉淀于纖維間，主要有鈣、鎂、磷等。脫鈣是指運(yùn)用物理或者化學(xué)方法將骨組織標(biāo)本中有機(jī)成分和骨鹽分離，通過去除鈣鹽從而獲得完整的膠原纖維組織和基質(zhì)[4]，進(jìn)而使組織變軟易于制片染色。在常規(guī)病理切片過程中，如果脫鈣液使用不正確會(huì)嚴(yán)重破壞組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，影響最終病理診斷的準(zhǔn)確性。因此，尋找一種對(duì)組織破壞程度較小且脫鈣效率高的脫鈣液，對(duì)臨床病理診斷工作意義重大。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)5%鹽酸氯化鈉脫鈣液脫鈣后的組織，HE染色示細(xì)胞核發(fā)紅現(xiàn)象明顯，核結(jié)構(gòu)不清，染色對(duì)比度差，且免疫組化染色SATB2表達(dá)效果不佳；而5%鹽酸甲醛脫鈣液脫鈣后組織HE染色效果比5%鹽酸氯化鈉脫鈣液效果佳，結(jié)構(gòu)更為完整。鹽酸是一元無機(jī)強(qiáng)酸，與骨組織中骨鹽結(jié)合可加速脫鈣。曹穎[1]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氯化鈉可降低溶液中離子的活度，導(dǎo)致骨組織中骨鹽(羥基磷灰石結(jié)晶)的溶解度增加、膠原纖維的酸解程度降低，而10%中性福爾馬林是組織固定最常用的試劑，組織滲透力強(qiáng)、收縮小，能夠較好保存多數(shù)的抗原物質(zhì)，由于10%中性福爾馬林中加入磷酸緩沖液，不易被氧化，故對(duì)組織標(biāo)本的固定(特別是長期固定)、染色效果較為有利，在脫鈣液中加入10%中性福爾馬林后加快脫鈣速度的同時(shí)又能保護(hù)細(xì)胞形態(tài)及抗原，且穿透力強(qiáng)，固定均勻[5]。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)延長脫鈣時(shí)間后，10%EDTA脫鈣液脫鈣效果最佳，且免疫組化染色結(jié)果更為穩(wěn)定。由于EDTA是一種相對(duì)較好的螯合脫鈣劑，對(duì)組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)影響較小，且能較好地保存組織中的抗原物質(zhì)和某些酶類的活性[6]，經(jīng)10%EDTA脫鈣液脫鈣后的組織行HE和免疫組化染色效果佳，且不易掉片，但因其脫鈣時(shí)間過長，不推薦用于臨床診斷的骨組織脫鈣；5%硝酸甲醛脫鈣液中，硝酸是一種強(qiáng)氧化性和腐蝕性的強(qiáng)酸，是六大無機(jī)強(qiáng)酸之一，且低濃度的硝酸能較好的保持組織的完整性和細(xì)胞形態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中5%硝酸甲醛脫鈣液脫鈣時(shí)間明顯低于10%EDTA脫鈣液，且兩種脫鈣液HE染色與免疫組化染色效果相差較小，鏡下無皺縮、龜裂、膨脹現(xiàn)象，切片平整，厚薄均勻。綜合以上各種脫鈣液的優(yōu)缺點(diǎn)，聯(lián)合臨床實(shí)際，推薦使用5%硝酸甲醛脫鈣液作為臨床工作中的常用脫鈣液。

室溫靜置條件下，組織脫鈣時(shí)間較長(24～48 h)，嚴(yán)重影響病理報(bào)告的時(shí)效性；而微波、超聲均可加強(qiáng)試劑對(duì)組織的穿透作用，從而加快脫鈣速度，且抗原保存得更好，同時(shí)微波、超聲過程中需不斷更換脫鈣液，在防止溫度過高的同時(shí)，也可將脫掉的鈣鹽棄掉，增加脫鈣強(qiáng)度[7]。微波電磁場將能量直接作用于脫鈣組織，增大脫鈣液穿透力，使脫鈣液與組織充分接觸，但是由于高溫會(huì)破壞組織細(xì)胞形態(tài)，本實(shí)驗(yàn)使用間歇性微波輻射控制脫鈣液，避免高溫對(duì)組織的影響，以達(dá)到最佳脫鈣效果；超聲波發(fā)射的波長短、頻率高，故傳播方向性好且穿透能力強(qiáng)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)[8]，超聲波可加速脫鈣液中分子運(yùn)動(dòng)，加強(qiáng)對(duì)骨組織的滲透作用，超聲波不能加熱試劑，所以結(jié)合恒溫水浴，控制骨組織在合適的溫度下進(jìn)行處理，既可以避免高溫引起的組織收縮破壞及蛋白抗原變性，又可以加快脫鈣液對(duì)組織的滲透速度，從而縮短脫鈣時(shí)間。

另外，在日常工作中對(duì)骨組織進(jìn)行脫鈣操作時(shí)還應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：(1)對(duì)組織進(jìn)行及時(shí)、充分固定，才能保存好形態(tài)結(jié)構(gòu)和組織細(xì)胞的抗原性，由于固定不充分對(duì)組織的損傷是不可逆性的，所以脫鈣前組織固定尤為重要；(2)脫鈣終點(diǎn)選擇需謹(jǐn)慎，脫鈣不徹底則無法切片，脫鈣過度則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)破壞，影響診斷；脫鈣終點(diǎn)的物理法測定包括手掐、針刺、鉗夾等方法，手輕輕按壓組織柔軟有彈性、不刺手、無粗糙砂粒感，大頭針可以輕松刺入骨皮質(zhì)判斷為達(dá)到脫鈣終點(diǎn)；(3)脫鈣后需用流水徹底沖洗30 min，以避免酸性液體殘存，導(dǎo)致HE染色時(shí)核質(zhì)對(duì)比不清晰，細(xì)胞核著色暗淡[9]。

本組中10%EDTA脫鈣液、5%硝酸甲醛脫鈣液，在不同的處理?xiàng)l件下均能取得較好的脫鈣效果，5%鹽酸甲醛脫鈣液脫鈣后進(jìn)行免疫組化染色易掉片或卷片，5%鹽酸氯化鈉脫鈣液對(duì)組織損傷較大，不宜使用。同時(shí)，微波、超聲條件下均能提高脫鈣速度，相比之下，微波比超聲效果更好，條件更穩(wěn)定。聯(lián)合臨床病理診斷的時(shí)效性，我們推薦在微波條件下使用5%硝酸甲醛脫鈣液，可在較短的時(shí)間內(nèi)獲得最佳的脫鈣效果。