腎上腺皮質(zhì)癌中CENPF基因的表達(dá)及對患者治療和預(yù)后的影響

王 莉，李 丹，唐 凱，黃育剛

腎上腺皮質(zhì)癌(adrenocortical carcinoma,ACC)是一種發(fā)生于腎上腺皮質(zhì)的較為罕見的惡性腫瘤，易發(fā)生局部浸潤和轉(zhuǎn)移，約占原發(fā)性腎上腺瘤的14%[1]。ACC患者預(yù)后較差，有局部晚期疾病的ACC患者5年生存率為35%～50%，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的5年生存率為0～28%[2]。目前，外科手術(shù)或基于米托坦-鉑的化學(xué)療法仍然是唯一有效的治療策略[1-3]。因此，提高ACC的早期診斷率、發(fā)現(xiàn)評估預(yù)后的新指標(biāo)和抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)已成為ACC研究的焦點(diǎn)。著絲粒蛋白F(centromere protein F,CENPF)是細(xì)胞周期相關(guān)核抗原，參與細(xì)胞周期的調(diào)控[4-5]。研究表明，CENPF參與多種腫瘤的發(fā)生，包括肝癌[6]、乳腺癌[7]、前列腺癌等[8]；但國內(nèi)外鮮有CENPF在ACC中表達(dá)的報(bào)道。本文根據(jù)腫瘤基因相關(guān)公共數(shù)據(jù)庫對ACC中CENPF的表達(dá)、預(yù)后的相關(guān)性及生物學(xué)功能進(jìn)行初步分析，以提高臨床與病理醫(yī)師對ACC的認(rèn)識水平，為ACC的預(yù)后或治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2011年1月～2021年5月湖北省十堰市太和醫(yī)院/湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院病理科ACC 6例、腎上腺皮質(zhì)腺瘤12例及正常腎上腺皮質(zhì)12例(對照組)，患者均有完整的臨床病理資料，術(shù)前均未行放、化療。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，患者或家屬均知情同意。

1.2 免疫組化手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)HE、免疫組化EnVision兩步法染色。兔抗人CENPF一抗(Abcam公司，稀釋比1 ∶500)37 ℃孵育60 min，HRP二抗(福州邁新公司)37 ℃孵育30 min，蘇木精復(fù)染30 s。光鏡下觀察CENPF蛋白的表達(dá)，每個(gè)組織隨機(jī)選擇3個(gè)視野(400×)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算CENPF陽性細(xì)胞百分比，即CENPF陽性細(xì)胞率=CENPF陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)/腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)×100%。所有切片均經(jīng)兩位病理醫(yī)師采用雙盲法閱片。

1.3 細(xì)胞系RNA干擾實(shí)驗(yàn)及RT-PCR設(shè)計(jì)干擾性小分子RNA(siCENPF)，探討CENPF在人ACC細(xì)胞系SW13細(xì)胞中的功能。用50 nmol/L的CENPF-siRNA(siCENPF組)或?qū)φ誷iRNA(siNC)分別轉(zhuǎn)染人SW13細(xì)胞48 h。siCENPF引物：5′-GACCCA GAAACUAGCUUAUTT-3′；siNC引物：5′-UUCUCCGA ACGUGUCACGUTT-3′。使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)從SW13細(xì)胞中提取總RNA。利用Oligo(dT)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶生成的cDNA，運(yùn)用QuantiTect-SYBR-Green-PCR-Master-Mix試劑盒(德國Qiagen公司)和ABI-Prism 7000分析儀(美國Applied Biosystems公司)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測。CENPF：正向引物5′-AGCACTGATCACCTGTTAGC-3′，反向引物5′-ACCCACATACAAACAGAGATTG-3′；內(nèi)參基因GAPDH：正向引物5′-CGGAGTCAACGGATTTG GTCGTAT-3′，反向引物5′-AGCCTTCTCCATGGTG GTGAAGAC-3′。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，使用2-ΔΔCt法計(jì)算siCENPF組和對照組中CENPF mRNA水平，引物均由上海生工生物公司合成。

1.4 Western blot法用siCENPF和siNC分別轉(zhuǎn)染人SW13細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞，提取蛋白。加入CENPF一抗(Abcam公司，稀釋比1 ∶500)，4 ℃孵育細(xì)胞膜過夜；與HRP二抗結(jié)合的IgG抗體室溫下孵育1.5 h。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色。

1.5 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將人SW13細(xì)胞以100 μL(合計(jì)2×103個(gè)細(xì)胞)接種于96孔板，分別轉(zhuǎn)染50 nmol/L的siCENPF和siNC。向每孔中添加10 μL CCK-8試劑(上海碧云天生物公司)。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72和96 h,分別測量各時(shí)間點(diǎn)在450 nm處的吸光度值(OD)。

1.6 劃痕試驗(yàn)將人SW13細(xì)胞接種于DMEM(含10%胎牛血清)的12孔板中，用50 nmol /L siCENPF和siNC分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h。用20 μL移液管尖劃痕；每孔再用PBS沖洗5次，以清除劃痕上的漂浮細(xì)胞，并向每孔中添加3 mL 10%FBS、含1%抗生素的DMEM。在0、48 h拍攝劃痕區(qū)域，48 h內(nèi)細(xì)胞遷移的寬度=0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度。

1.7 腫瘤數(shù)據(jù)庫的信息分析本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GEO數(shù)據(jù)庫查詢與ACC研究相關(guān)的所有數(shù)據(jù)集，研究資料包括人ACC及其鄰近或正常腎上腺皮質(zhì)組織，篩選得到數(shù)據(jù)集：GSE90713。在GEPIA基因數(shù)據(jù)服務(wù)平臺可檢索到 TCGA數(shù)據(jù)庫和GTEx項(xiàng)目的79例ACC和128例正常樣本的RNA測序表達(dá)數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用GEPIA平臺進(jìn)行腫瘤及正常組織中CENPF的差異表達(dá)、病理分期、CENPF相關(guān)的表達(dá)、基因相關(guān)性及患者生存分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用t檢驗(yàn)對正常組織與ACC組織中CENPF的表達(dá)差異進(jìn)行比較。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行多組間比較；應(yīng)用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法分析CENPF表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。采用Kaplan-Meier生存曲線分析CENPF表達(dá)對ACC患者預(yù)后的影響；應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)比較兩組間的生存差異；并用Cox回歸模型分析CENPF表達(dá)對生存期及臨床特征(分期、分級等)的影響。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常腎上腺組織、腎上腺皮質(zhì)腺瘤及ACC組織中CENPF的表達(dá)腎上腺皮質(zhì)腺瘤的結(jié)節(jié)切面呈金黃色、質(zhì)硬(圖1A)；ACC切面的包膜完整或有缺陷，一些區(qū)域呈灰紅色，有壞死(圖1B)。HE染色示：正常腎上腺皮質(zhì)的網(wǎng)狀帶細(xì)胞，胞質(zhì)呈嗜酸性顆粒，細(xì)胞排列無特征性，空泡狀、核仁小(圖2A)。腎上腺皮質(zhì)腺瘤腫瘤細(xì)胞呈巢、團(tuán)狀分布，胞質(zhì)豐富，呈嗜酸性，可見小核仁(圖2B)。ACC細(xì)胞呈片狀或大的巢、團(tuán)狀排列，被纖細(xì)的竇系網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分隔，癌細(xì)胞生長密集，核仁清楚(圖2C)。免疫組化檢測顯示：CENPF在腎上腺皮質(zhì)腺瘤組和正常腎上腺組中均呈低表達(dá)或不表達(dá)(圖3A、B)，在ACC中呈核表達(dá)，且表達(dá)量顯著高于腎上腺皮質(zhì)腺瘤及正常腎上腺組織(圖3C)。CENPF在ACC組織中的陽性率顯著高于正常腎上腺皮質(zhì)、腎上腺皮質(zhì)腺瘤(圖4)。本組6例ACC中CENPF均陽性，其中5例CENPF的陽性細(xì)胞率>10%，1例CENPF的陽性細(xì)胞率約8%。而CENPF在腎上腺皮質(zhì)腺瘤及對照組中大多數(shù)不表達(dá)(陽性細(xì)胞率0～2%)。

圖1 A.腎上腺皮質(zhì)腺瘤的結(jié)節(jié)切面呈金黃色、質(zhì)硬；B.腎上腺皮質(zhì)癌切面的包膜完整或有缺陷，一些區(qū)域呈灰紅色，有壞死

圖2 A.正常腎上腺皮質(zhì)的網(wǎng)狀帶細(xì)胞，胞質(zhì)呈嗜酸性顆粒，細(xì)胞無特征性排列，空泡狀、核仁?。籅.腎上腺皮質(zhì)腺瘤的腫瘤細(xì)胞呈巢、團(tuán)狀分布，胞質(zhì)豐富，呈嗜酸性，可見小核仁；C.腎上腺皮質(zhì)癌腫瘤細(xì)胞呈片狀或大的巢、團(tuán)狀排列，被纖細(xì)的竇系網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分隔，癌細(xì)胞生長密集，核仁清楚 圖3 A.CENPF在正常腎上腺皮質(zhì)中低表達(dá)；B.CENPF在腎上腺皮質(zhì)腺瘤中不表達(dá)；C.CENPF在腎上腺皮質(zhì)癌中的染色呈核表達(dá)(紅色箭頭)，EnVision兩步法

圖4 不同腎上腺皮質(zhì)組織中CENPF的表達(dá)：***P<0.001，ns為P>0.05

2.2 ACC中CENPF的表達(dá)差異為進(jìn)一步驗(yàn)證CENPF在ACC中的表達(dá)，對GEO數(shù)據(jù)集應(yīng)用GEO2R進(jìn)行表達(dá)差異分析，GSE90713數(shù)據(jù)集包含5例正常腎上腺皮質(zhì)組織和58例ACC組織。在GSE90713研究芯片中，CENPF mRNA在ACC中的表達(dá)量高于正常腎上腺皮質(zhì)組織(P=0.000 7，圖5A)。在GEPIA平臺中，數(shù)據(jù)庫包含128例正常腎上腺皮質(zhì)組織和79例ACC組織。本組結(jié)果顯示：CENPF mRNA在ACC中的表達(dá)量高于正常腎上腺皮質(zhì)(P<0.05，圖5B)。此外，根據(jù)GEPIA平臺的分析顯示，在ACC患者中CENPF mRNA表達(dá)量與臨床分期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)呈正相關(guān)(P=0.000 174，圖5C)。這表明CENPF異常表達(dá)與ACC的惡化程度或疾病進(jìn)展相關(guān)。

圖5 腎上腺皮質(zhì)癌中CENPF表達(dá)的差異：A.GSE90713的分析；B.GEPIA平臺的分析：*P<0.05；C.CENPF mRNA表達(dá)量與TNM分期的分析

2.3 ACC中CENPF 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系根據(jù)TCGA腫瘤數(shù)據(jù)庫中CENPF mRNA表達(dá)的中位值，將79例ACC分為低表達(dá)組(39例)和高表達(dá)組(40例)，分析CENPF表達(dá)與患者性別、年齡、臨床分期、病理分級等相關(guān)性。在ACC中，CENPF表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤發(fā)生位置無關(guān)(P>0.05，表1)。隨著臨床分期升高，CENPF高表達(dá)者顯著多于CENPF低表達(dá)者(尤其是TNM分期 Ⅲ、Ⅳ期，P<0.001)。CENPF高表達(dá)者更易發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)(P<0.001，表1)。腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，CENPF高表達(dá)者明顯多于CENPF低表達(dá)者(P<0.001，表1)。

表1 腎上腺皮質(zhì)癌中CENPF表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

采用Cox單因素、多因素回歸分析，CENPF與患者年齡、性別、分級、TNM分期、發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)等臨床因素對ACC患者預(yù)后的影響。Cox單因素回歸分析顯示：CENPF和TNM分期與ACC患者的預(yù)后相關(guān)(P<0.01，表2)。Cox多因素回歸分析顯示：CENPF和TNM分期可能是ACC患者的獨(dú)立預(yù)后因素(P<0.01，表2)。

表2 腎上腺皮質(zhì)癌中CENPF的Cox單因素、多因素回歸分析

2.4 ACC中CENPF表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系為進(jìn)一步分析CENPF基因表達(dá)與ACC患者預(yù)后的關(guān)系，根據(jù)CENPF mRNA表達(dá)的中位值將ACC患者分為CENPF高表達(dá)組和CENPF低表達(dá)組，應(yīng)用GEPIA平臺繪制生存曲線。結(jié)果顯示：CENPF表達(dá)與患者預(yù)后，即總生存率、無進(jìn)展生存率均呈顯著負(fù)相關(guān)(HR=8.88,P=0.000 24；HR=4.12,P=0.001 7，圖6)。

圖6 腎上腺皮質(zhì)癌中CENPF表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 A.CENPF表達(dá)與腎上腺皮質(zhì)癌患者總生存率的關(guān)系；B.CENPF表達(dá)與腎上腺皮質(zhì)癌患者無進(jìn)展生存率的關(guān)系

2.5 CENPF在細(xì)胞系SW13中的RNA干擾實(shí)驗(yàn)為探索CENPF基因在ACC發(fā)生、發(fā)展中的生物學(xué)功能，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了CENPF的表達(dá)抑制體系，應(yīng)用人SW13細(xì)胞轉(zhuǎn)染siCENPF后，siCENPF組中CENPF mRNA(P<0.01，圖7A)和蛋白(P=0.001 1，圖7B、C)的表達(dá)顯著被抑制，表明CENPF表達(dá)干擾體系構(gòu)建成功。CCK-8細(xì)胞分裂實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與siNC組相比，抑制CENPF表達(dá)(siCENPF)的SW13細(xì)胞生長速度顯著受到抑制(P<0.01，圖8)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與siNC相比，抑制CENPF表達(dá)(siCENPF)后，SW13細(xì)胞的遷移速度顯著受到抑制(P=0.005 3，圖9)。

圖7 CENPF在腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞SW13中的siRNA體系的建立：A.實(shí)時(shí)定量PCR檢測CENPF mRNA相對表達(dá)，**P<0.01；B.Western blot檢測CENPF蛋白的表達(dá)；C.蛋白表達(dá)的灰度值分析

圖8 CCK-8細(xì)胞增殖能力實(shí)驗(yàn)：檢測CENPF對SW13細(xì)胞增殖的影響：**P<0.01，*P<0.05

圖9 劃痕實(shí)驗(yàn)分析CENPF對SW13細(xì)胞遷移能力的影響

3 討論

ACC是一種較為少見的惡性腫瘤，文獻(xiàn)報(bào)道較少[9-10]。目前，外科手術(shù)、化療分別是治療早、晚期ACC的主要方式。近年大量文獻(xiàn)表明：WNT-β-catenin、p53-RB信號通路、錯(cuò)配修復(fù)相關(guān)酶的缺陷和TERT基因表達(dá)異常，與ACC的疾病進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)[11-13]。但這些基因異常表達(dá)或信號異常調(diào)控只存在于ACC少部分患者中[10]，因此尋找ACC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵分子或靶點(diǎn)，對治療ACC具有重要的臨床意義。

近年越來越多的證據(jù)表明，CENPF的過度表達(dá)或激活是惡性腫瘤的常見行為，與肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤的惡化和預(yù)后不良密切相關(guān)。然而，CENPF在ACC患者中的表達(dá)模式和確切作用尚不清楚，其分子機(jī)制和功能也未見報(bào)道。本組通過對臨床樣本及腫瘤數(shù)據(jù)庫(GEO和GEPIA)中CENPF相關(guān)基因信息的分析，發(fā)現(xiàn)CENPF在ACC中顯著高表達(dá)，CENPF基因高表達(dá)與TNM分期呈正相關(guān)、與患者預(yù)后呈顯著負(fù)相關(guān)；表明CENPF表達(dá)可能促進(jìn)ACC的疾病進(jìn)展。此外，在ACC中CENPF表達(dá)與TNM分期、腫瘤復(fù)發(fā)、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.001)；與患者年齡、性別、腫瘤發(fā)病部位無關(guān)(P>0.05)。CENPF表達(dá)、TNM分期與ACC患者的預(yù)后相關(guān)，且可能是ACC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。在ACC中CENPF可能通過調(diào)控細(xì)胞的分裂、遷移，促進(jìn)ACC的發(fā)生或進(jìn)展。以上結(jié)果拓展了ACC的相關(guān)研究，分析CENPF與ACC發(fā)病及進(jìn)展的相關(guān)性，為下一步的分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究提供線索與依據(jù)。本文也存在一定的局限性，由于收集樣本量較少，CENPF與ACC發(fā)病及進(jìn)展的相關(guān)性、預(yù)后信息等皆以生物信息學(xué)分析為基礎(chǔ)，故以上結(jié)論仍需要進(jìn)一步的分子實(shí)驗(yàn)及臨床樣本來驗(yàn)證。