過表達miR-217調控EZH2促進骨質疏松模型小鼠BM-MSCs成骨分化

阮 鋒，李賀偉*，龔艷琳，劉佳麗，劉 平

(1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院 骨科，湖北 武漢 430077；2.武漢市第一醫(yī)院 內分泌科，湖北 武漢 430030)

骨質疏松癥(osteoporosis, OP)是一種骨代謝紊亂的疾病，在絕經(jīng)女性中高發(fā)，其可增加骨折風險，對絕經(jīng)女性健康構成不利影響[1]。另外，骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)是成骨細胞的前體細胞，其成骨分化能力可影響骨形成，在OP發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[2-3]。因此，尋找影響B(tài)M-MSCs成骨分化的有關機制，對治療OP有積極意義。微小RNA-217(microRNA-217，miR-217)是微小RNA(microRNA, miRNA)的一員，其與血管生成、腎臟疾病、腫瘤、OP發(fā)生發(fā)展等相關[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-217在股骨頭壞死患者的BM-MSCs中表達下調，BM-MSCs成骨分化能力降低，過表達miR-217可通過靶向調節(jié) Dickkopf相關蛋白1表達進而促進BM-MSCs向成骨分化[5]；且miR-217可通過靶向調節(jié)蛋白激酶B γ表達進而影響成骨分化[5]。以上研究表明，miR-217可能通過靶向調控有關基因表達，進而影響成骨分化，為治療OP提供思路。此外，抑制果蠅zeste基因增強子同源物2(enhancer of zeste homolog 2, EZH2)表達可促進祖細胞成骨分化[6]，其可能為改善骨量提供新策略。且有關報道顯示，miR-217可通過靶向調控EZH2表達進而影響胃癌發(fā)展[7]。因此，推測miR-217可通過調控EZH2表達進而影響OP小鼠BM-MSCs成骨分化。因此，本文通過構建OP小鼠模型，分離培養(yǎng)BM-MSCs，觀察miR-217、EZH2在OP小鼠BM-MSCs中的表達情況，初步探究二者對BM-MSCs的作用機制，以期為臨床診治OP提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級24只C57BL/6雌性小鼠，9周齡，體質量(20±2)g]廣東至遠生物醫(yī)藥科技有限公司，許可證號：SCXK(粵)2021-0057。實驗經(jīng)本院動物倫理委員會批準，并遵循《實驗動物的護理和使用指南》。

1.1.2 試劑：α-MEM培養(yǎng)基(BC-M-042-500mL)(南京森貝伽生物科技有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、β-甘油磷酸鈉、地塞米松和抗壞血酸(北京索萊寶科技有限公司)；Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen公司)；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(K1622)(上?？道噬锟萍加邢薰?；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RIPA裂解液(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)；茜素紅S(alizarin red S，ARS)染色試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)；SYBR Green Real-time PCR Master Mix(QPK-201)(TOYOBO公司)；一抗兔源Runt相關基因2(Runt-related transcription gene 2, Runx2)抗體、骨鈣素(osteocalcin，OCN)抗體、Ⅰ型膠原(collagen typeⅠ, collagenⅠ)抗體、GAPDH抗體、EZH2抗體及辣根過氧化物酶綴合的二抗(Abcam公司)；miR-217模擬物陰性對照(miR-NC)、miR-217模擬物(miR-217 mimics)、空載體(pcDNA3.1)、EZH2過表達載體(pcDNA3.1-EZH2)及miR-217、U6、OCN、Runx2、collagenⅠ、EZH2、GAPDH引物、野生型EZH2(wild-type EZH2, WT-EZH2)載體、突變型EZH2(mutant EZH2, MUT-EZH2)載體(上海生工生物工程有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理：將小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，參考文獻[8]方法構建OP模型。經(jīng)腹腔注射給予小鼠戊巴比妥鈉(80 mg/kg，1.5%)麻醉，無菌環(huán)境下俯臥固定，備皮，行雙側卵巢切除術，設置為OP組，其余小鼠僅切除雙側卵巢位置處的脂肪組織并設置為sham組，每組均為12只小鼠，術后所有小鼠均繼續(xù)飼養(yǎng)8周。sham組、OP組小鼠在處死前，均進行micro-CT股骨掃描以確定OP造模成功。麻醉后處死各組6只小鼠，分離雙側股骨，剔除多余組織后，研碎，用于miR-217及EZH2 mRNA檢測。

1.2.2 BM-MSCs的分離及培養(yǎng)：按參考文獻[9]提取小鼠BM-MSCs，接種于α-MEM培養(yǎng)液(含10%FBS)中，每3 d更換1次培養(yǎng)液，并在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。至細胞增殖至80%左右，胰蛋白酶消化傳至3～4代，用于miR-217及EZH2 mRNA檢測及成骨誘導分化。

1.2.3 BM-MSCs的成骨誘導分化及細胞的分組及處理：將從OP小鼠分離且培養(yǎng)3～4代的BM-MSCs(2×106細胞)接種于6孔板，待BM-MSCs匯合至80%左右，將細胞分為對照組、miR-NC組、miR-217 mimics組、miR-217 mimics+pcDNA 3.1組和miR-217 mimics+pcDNA 3.1-EZH2組。用Lipofectamine 2000轉染試劑盒分別對各組細胞進行轉染12 h，其中miR-NC 和miR-217 mimics均為20 pmol/L，pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-EZH2質粒4 μg。之后加成骨誘導分化培養(yǎng)液(含0.2%抗壞血酸、0.01%地塞米松、1% β-甘油磷酸鈉、1%青霉素-鏈霉素及10% FBS的α-MEM培養(yǎng)基)，每3 d換1次成骨誘導分化培養(yǎng)液，培養(yǎng)14 d，顯微鏡觀察BM-MSCs細胞形態(tài)變化。

1.2.4 RT-qPCR檢測骨組織/BM-MSCs中miR-217、EZH2、OCN、Runx2、collagenⅠ mRNA表達水平：以Trizol Reagent提取OP組、sham組小鼠骨組織/BM-MSCs(僅用于檢測miR-217、EZH2 mRNA表達)及轉染后各組BM-MSCs總RNA，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit將總RNA反轉錄，收集cDNA，使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix、RT-qPCR儀進行擴增，收集檢測指標循環(huán)閾值(CT值)。擴增參數(shù)：97.6 ℃ 8 min；95.2 ℃ 20 s，64.6 ℃ 20 s，62.5 ℃ 20 s，40個循環(huán)。miR-217以U6為內參，EZH2、OCN、Runx2、collagen Ⅰ以Gapdh為內參，引物序列見表1。miR-217、Ezh2、Ocn、Runx2、collagen Ⅰ 相對表達量以2-△△Ct法計算。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 ALP活性的檢測：細胞按ALP檢測試劑盒說明書進行操作，用酶標儀測定各組BM-MSCs在波長520 nm處的吸光度值，計算各組細胞ALP活性。

1.2.6 ARS染色檢測：將細胞用PBS清洗后，4%多聚甲醛固定10 min，清洗后，加入茜素紅染色液染色20 min，再次清洗后，顯微鏡下觀察各組細胞染色情況。

1.2.7 Western blot檢測成骨分化相關基因及EZH2蛋白表達：低溫條件下用RIPA裂解液裂解各組誘導分化后細胞，BCA法對蛋白進行定量。取50 μg樣品，經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉膜、 封閉后，加入一抗Runx2、OCN、collagenⅠ、EZH2及GAPDH，4 ℃孵育過夜，清洗后，加二抗，室溫孵育2 h后，清洗3次。使用凝膠成像系統(tǒng)和Image Pro Plus軟件對條帶進行分析。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因驗證靶向關系：收集從OP小鼠分離的BM-MSCs，接種于24孔板(密度：2×104個/孔)，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，然后將構建的野生型(WT-EZH2)和突變型(MUT-EZH2)載體與miR-NC或miR-217 mimics共轉染上述BM-MSCs 48 h，分為WT-EZH2+miR-NC組、(WT-EZH2+miR-217 mimics)組、(MUT-EZH2+miR-217 mimics)組和(MUT-EZH2+miR-NC)組。分別收集各組細胞并裂解20 min，離心后檢測各組上清液中熒光素酶活性，并以海腎熒光素酶活性為參照，計算熒光素酶相對活性。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組小鼠骨組織和BM-MSCs中miR-217及EZH2 mRNA表達水平

與sham組相比，OP組小鼠骨組織及BM-MSCs中miR-217表達水平降低(P<0.05)，EZH2 mRNA表達水平升高(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with sham group圖1 各組小鼠骨組織及BM-MSCs中miR-217、EZH2 mRNA表達水平比較

2.2 轉染后各組BM-MSCs中miR-217及EZH2表達情況

與對照組和miR-NC組相比，miR-217 mimics組BM-MSCs中miR-217表達水平升高(P<0.05)，EZH2 mRNA及蛋白表達水平降低(P<0.05)；與miR-217 mimics組、miR-217 mimics+pcDNA 3.1組相比，miR-217 mimics+pcDNA 3.1-EZH2組BM-MSCs中EZH2 mRNA及蛋白表達水平升高(P<0.05)(圖2～3)。

圖2 各組BM-MSCs中EZH2蛋白表達Fig 2 EZH2 protein expression in BM-MSCs of each group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with miR-NC group; △P<0.05 compared with miR-217 mimics group; ▲P<0.05 compared with miR-217 mimics+pcDNA 3.1 group圖3 轉染后各組BM-MSCs中miR-217及EZH2表達情況Fig 3 Expression of miR-217 and EZH2 in BM-MSCs of each group after n=6)

2.3 各組BM-MSCs ALP活性比較

與對照組和miR-NC組相比，miR-217 mimics組BM-MSCs ALP活性升高(P<0.05)；與miR-217 mimics組、miR-217 mimics+pcDNA 3.1組相比，miR-217 mimics+pcDNA 3.1-EZH2組BM-MSCs ALP活性降低(P<0.05)(表2)。

表2 各組BM-MSCs ALP活性比較

2.4 各組BM-MSCs ARS染色情況

ARS染色結果顯示，與對照組和miR-NC組相比，miR-217 mimics組、miR-217 mimics+pcDNA 3.1組、miR-217 mimics+pcDNA 3.1-EZH2組BM-MSCs細胞染色程度較深；與miR-217 mimics組、miR-217 mimics+pcDNA 3.1組相比，miR-217 mimics+pcDNA 3.1-EZH2組BM-MSCs細胞染色程度較淺；對照組和miR-NC組、miR-217 mimics組和miR-217 mimics+pcDNA 3.1組BM-MSCs細胞染色程度無明顯差異(圖4)。

圖4 各組BM-MSCs的茜素紅S(ARS)染色結果Fig 4 Alizarin reds(ARS) staining results of BM-MSCs in each group (×100)

2.5 各組BM-MSCs中成骨分化相關基因OCN、Runx2、collagenⅠ mRNA表達水平比較

與對照組和miR-NC組相比，miR-217 mimics組BM-MSCs中OCN、Runx2、collagenⅠ mRNA表達水平升高(P<0.05)；與miR-217 mimics組、miR-217 mimics+pcDNA 3.1組相比，miR-217 mimics+pcDNA 3.1-EZH2組BM-MSCs中OCN、Runx2、collagenⅠ mRNA表達水平降低(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with miR-NC group; △P<0.05 compared with miR-217 mimics group; ▲P<0.05 compared with miR-217 mimics+pcDNA 3.1 group圖5 各組BM-MSCs中OCN、Runx2、collagenⅠ mRNA表達水平比較Fig 5 Comparison of OCN, Runx2 and collagenⅠ mRNA expression levels in BM-MSCs of each

2.6 各組BM-MSCs中成骨分化相關蛋白OCN、Runx2、collagenⅠ表達水平比較

與對照組和miR-NC組相比，miR-217 mimics組BM-MSCs中OCN、Runx2、collagenⅠ蛋白表達水平升高(P<0.05)；與miR-217 mimics組、miR-217 mimics+pcDNA 3.1組相比，miR-217 mimics+pcDNA 3.1-EZH2組BM-MSCs中OCN、Runx2、collagenⅠ蛋白表達水平降低(P<0.05)(圖6～7)。

圖6 各組BM-MSCs中OCN、Runx2、collagenⅠ 蛋白表達Fig 6 Expression of OCN, Runx2 and collagenⅠ proteins in BM-MSCs of each group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with miR-NC group; △P<0.05 compared with miR-217 mimics group; ▲P<0.05 compared with miR-217 mimics+pcDNA 3.1 group圖7 各組BM-MSCs中OCN、Runx2、collagenⅠ蛋白 表達水平比較Fig 7 Comparison of OCN, Runx2 and collagenⅠ protein expression levels in BM-MSCs of each

2.7 雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)驗證miR-217與EZH2靶向關系

經(jīng)starbase數(shù)據(jù)庫預測顯示，miR-217與EZH2 mRNA 3′UTR區(qū)有結合位點，見圖8。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，與WT-EZH2+miR-NC組比較，WT-EZH2+miR-217 mimics組熒光素酶相對活性降低(P<0.05)；MUT-EZH2+miR-NC組與MUT-EZH2+miR-217 mimics組熒光素酶相對活性差異無統(tǒng)計學意義(表3)。

圖8 miR-217與EZH2 mRNA 3′UTR區(qū)結合位點 預測結果Fig 8 Prediction results of binding sites between miR-217 and EZH2 mRNA 3′UTR region

表3 各組雙熒光素酶報告基因檢測結果

3 討論

微小RNA是一類存在于骨組織、細胞中的非編碼RNA分子，其可調控BM-MSCs向成骨細胞分化[10]。miR-217在人脂肪源間充質干細胞(adipose-derived stem cells, hADSCs)向成骨細胞分化過程中表達水平升高，其可能在hADSCs成骨分化中起重要調控作用[11]；另外，miR-217可通過促進成骨相關基因表達， 進而在hADSCs向成骨細胞分化過程中起促進作用[12]。提示miR-217可能參與OP發(fā)生發(fā)展，過表達miR-217可能改善OP。另外，本研究通過體外實驗檢測了過表達miR-217對OP小鼠BM-MSCs向成骨細胞分化的作用，發(fā)現(xiàn)過表達miR-217后，BM-MSCs中miR-217表達水平升高，ARS染色加深，ALP活性升高，表明過表達miR-217可促進OP小鼠BM-MSCs成骨分化。OCN、Runx2、collagen Ⅰ與成骨分化關系密切，其可作為評估成骨分化能力的標志物[13]。提示過表達miR-217通過促進成骨分化相關基因表達進而促進BM-MSCs成骨分化。

EZH2可參與細胞增殖，影響氧化應激，調節(jié)機體發(fā)育，促進破骨細胞分化，影響骨代謝平衡，與骨代謝疾病關系密切[14]。在炎性反應條件下，人牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)中EZH2表達上調，且EZH2過表達可抑制OCN等成骨標志物的表達，進而抑制PDLSCs成骨分化，可能是治療牙周炎的潛在靶點[15]。提示EZH2可能是OP的治療靶點。進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-217后，BM-MSCs中EZH2 mRNA及蛋白表達水平降低，且過表達EZH2可使BM-MSCs中miR-217表達水平略有降低，OCN、Runx2、collagenⅠ mRNA及蛋白表達水平顯著降低，ARS染色程度、ALP活性降低，提示miR-217可能通過調節(jié)EZH2表達進而影響OCN、Runx2、collagenⅠ等成骨分化相關基因表達，從而在BM-MSCs向成骨細胞分化過程中發(fā)揮調控作用。

本研究利用starbase數(shù)據(jù)庫預測發(fā)現(xiàn)，Ezh2的3’UTR序列中包含了miR-217的靶序列，表明miR-217可能與Ezh2存在調控關系。此外，雙熒光素酶報告基因檢測顯示，miR-217可明顯抑制野生型EZH2熒光素酶活性，而對突變型EZH2熒光素酶活性無明顯影響，表明Ezh2是miR-217的直接靶點，且ALP、ARS染色實驗、RT-qPCR、Western blot實驗也表明了過表達EZH2可部分逆轉過表達miR-217對OP小鼠BM-MSCs成骨分化的促進作用，進一步證實了在OP小鼠BM-MSCs中miR-217可負靶向調控EZH2表達。

綜上，過表達miR-217可通過靶向抑制EZH2表達，從而促進OP小鼠BM-MSCs成骨分化。miR-217、EZH2有望成為診治OP的分子靶點，為防治OP提供新方案。但miR-217、EZH2對OP小鼠BM-MSCs成骨分化的影響機制尚不夠深入，后期可考慮結合臨床實驗加以探究。