LncRNA PVT1 通過調(diào)節(jié)miR-214/STAT6 軸減輕哮喘模型小鼠氣道炎性反應(yīng)

黃 華，周 龍，姚 迪，許 詣

(1.湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學科， 湖北 恩施 445000；2.湖北文理學院附屬醫(yī)院 襄陽市中心醫(yī)院 兒科， 湖北 襄陽 441021)

支氣管哮喘(bronchial asthma)是一種涉及多種細胞和細胞因子的慢性炎性呼吸道疾病，臨床癥狀包括胸悶、氣短、喘息和干咳。哮喘的特征是氣道炎性反應(yīng)和重塑，導致氣道高反應(yīng)性和不可逆性氣流阻塞[1]。慢性炎性損傷是哮喘的主要病理改變，也是哮喘發(fā)作的主要特征，因此抑制炎性反應(yīng)是緩解哮喘癥狀的重要靶點[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)，長非編碼RNA PVT1(long non-coding RNA PVT1，lncRNA PVT1)與炎性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。哮喘患者的原代氣道平滑肌細胞中l(wèi)ncRNA PVT1的表達高于健康人，lncRNA PVT1的表達可能影響氣道平滑肌細胞的增殖和炎性因子的釋放[3]。這一發(fā)現(xiàn)表明，lncRNA PVT1在支氣管哮喘中起關(guān)鍵作用，但需要進一步研究以闡明其下游分子及其相應(yīng)機制。同樣，先前的研究表明microRNAs(miRNAs)的異常表達也可以調(diào)節(jié)炎性因子的水平。例如，上調(diào)miR-214的表達可能降低信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子6(signal transducers and activators of transcription 6，STAT6)的水平，減輕潰瘍性結(jié)腸炎的炎性反應(yīng)[4]。因此，本研究擬通過構(gòu)建哮喘小鼠模型，以探究抑制lncRNA PVT1表達對支氣管哮喘的影響，以及對miR-214/STAT6軸的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級雄性Balb/c小鼠，體質(zhì)量18～22 g[河北醫(yī)科大學，許可證號：SYXK(冀)2020-002]。實驗動物在房間通風良好、溫度(24±2)℃、相對濕度為60%±10%和12∶12明暗周期的條件下飼養(yǎng)。動物自由采食飲水，經(jīng)過一周適應(yīng)性飼養(yǎng)后用于實驗。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準。

1.1.2 細胞與試劑：人小氣道上皮細胞系(human small airway epithelial cells,HSAECs)(中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所)。LncRNA PVT1抑制物及其陰性對照序列、miR-214模擬物及其陰性對照序列(廣州銳博生物科技有限公司合成)。白介素-4(Interleukin-4，IL-4)測試盒、IL-5試劑盒、IL-13試劑盒和卵清蛋白特異性IgE(ovalbumin specific IgE，OVA-sIgE)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。熒光定量PCR試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]。Anti-STAT6抗體及Anti-STAT6(phospho Y641)抗體(Abcam公司)。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京索萊寶生物有限公司)。Lipofectamine 3000試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理：將小鼠隨機分成對照組、模型組(于第1、8、15天腹腔注射100 μg OVA+1 mg氫氧化鋁致敏。最后次致敏后，用1% OVA霧化吸入，每天30 min，連續(xù)7 d[5])、lncRNA PVT1抑制組和lncRNA PVT1 NC組(在OVA霧化吸入前，每天尾靜脈注射lncRNA PVT1抑制物或其陰性對照，持續(xù)7 d)，每組12只。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗液(BALF)的分析：末次干擾24 h后，腹腔注射麻醉處死小鼠，然后暴露氣管切開，注入PBS 3 mL后抽出2 mL支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，4 ℃下400×g離心10 min，上清液保存在-80 ℃中備用。使用血細胞計數(shù)儀計數(shù)BALF中炎性細胞總數(shù)、巨噬細胞數(shù)、中性粒細胞數(shù)和淋巴細胞數(shù)。采用ELISA試劑盒對BALF上清液中白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-13(IL-13)濃度進行檢測。

1.2.3 OVA特異性免疫球蛋白E(IgE)的測定：使用OVA特異性IgE試劑盒對各組小鼠血清中IgE含量進行檢測，具體操作根據(jù)試劑盒說明書進行。

1.2.4 肺組織病理學檢測：取各組小鼠的右肺組織常規(guī)制片染色后，于光學顯微鏡下觀察炎性細胞浸潤情況，并對肺組織的炎性細胞浸潤情況進行評分。評分標準為；0分(無)為肺組織無明顯炎性細胞浸潤；1分(輕度)為輕度炎性細胞浸潤；2分(中度)為中度炎性細胞浸潤；3分(重度)為重度炎性細胞浸潤[6]。

1.2.5 RT-qPCR檢測肺組織中miR-214和STAT6 mRNA水平：采用Trizol試劑從左肺組織勻漿中提取總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用Bio-Rad CFX96 Touch q-PCR系統(tǒng)進行RT-qPCR檢測。反應(yīng)混合物包括引物，Taq DNA聚合酶，PCR緩沖液，cDNA模板溶液和DEPC水。擴增過程為：95 ℃預(yù)變性60 s;95 ℃變性5 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸120s，共40個循環(huán)。以U6或Gapdh為內(nèi)參基因，用2-△△Ct法計算miR-214和STAT6 mRNA的相對表達量。本研究中使用的引物序列(表1)。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primers of RT-qPCR

1.2.6 Western blot檢測肺組織中STAT6和p-STAT6蛋白表達：將肺組織用含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的冰冷RIPA裂解緩沖液勻漿化，提取肺組織中總蛋白并檢測含量。使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離總蛋白，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在含有5%牛血清白蛋白的緩沖液中封閉1.5 h，然后在4 ℃下與抗STAT6(1∶1 000)和p-STAT6(1∶500)的一抗過夜孵育。用辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG二抗在室溫下孵育1.5 h后洗膜。膜經(jīng)增強型化學發(fā)光系統(tǒng)試劑處理后，用全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)顯示特異性抗體的結(jié)合情況，并用Image J軟件分析蛋白的相對表達水平。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因的檢測：構(gòu)建PVT1野生型和PVT1突變型的目標片段，并將其克隆到pGL3載體中，分別構(gòu)建了pGL3-PVT1野生型(PVT1-wt)和pGL3-PVT1突變型(PVT1-mut)報告基因。將PVT1-wt或PVT1-mut與miR-214模擬物或其陰性對照共轉(zhuǎn)染到HSAEC細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠BALF中炎性細胞分析

與對照組相比，模型組BALF中炎性細胞總數(shù)、巨噬細胞數(shù)、中性粒細胞數(shù)和淋巴細胞數(shù)顯著增加(P<0.05)；與模型組和lncRNA PVT1 NC組相比，lncRNA PVT1抑制組BALF中炎性細胞總數(shù)、巨噬細胞數(shù)、中性粒細胞數(shù)和淋巴細胞數(shù)顯著回降(P<0.05)(表2)。

表2 小鼠BALF中炎性細胞分析比較Table 2 Comparison of inflammatory cells in BALF of cells/mL，n=12)

2.2 小鼠BALF中炎性因子水平變化

與對照組相比，模型組小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平顯著升高(P<0.05)；與模型組和lncRNA PVT1 NC組相比，lncRNA PVT1抑制組小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平顯著降低(P<0.05)(表3)。

表3 小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平的比較Table 3 Comparison of IL-4, IL-5 and IL-13 levels in BALF of mice

2.3 小鼠血清中IgE水平變化

與對照組相比，模型組小鼠血清中IgE水平顯著升高(P<0.05)；與模型組和lncRNA PVT1 NC組相比，lncRNA PVT1抑制組小鼠血清中IgE水平顯著降低(P<0.05)(表4)。

表4 小鼠血清中IgE水平的比較

2.4 小鼠肺組織形態(tài)學變化

對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，氣道周圍或血管周圍無明顯炎性細胞浸潤。模型組和lncRNA PVT1 NC組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)不規(guī)則，氣道上皮不完整，氣道黏膜水腫，黏膜下層和血管組織周圍可見炎性細胞浸潤。與對照組相比，模型組小鼠肺組織中炎性細胞浸潤程度評分顯著升高(P<0.05)；與模型組和lncRNA PVT1 NC組相比，lncRNA PVT1抑制組小鼠肺組織中炎性細胞浸潤程度評分顯著降低(P<0.05)(圖1，表5)。

圖1 小鼠肺組織形態(tài)學變化Fig 1 Morphological changes of mouse lung tissue(×200)

表5 小鼠肺組織炎性細胞浸潤程度評分的比較

2.5 小鼠肺組織中miR-214水平變化

與對照組相比，模型組小鼠肺組織中miR-214水平顯著降低(P<0.05)；與模型組和lncRNA PVT1 NC組相比，lncRNA PVT1抑制組小鼠肺組織中miR-214水平顯著升高(P<0.05)(表6)。

表6 小鼠肺組織中miR-214水平的比較

2.6 小鼠肺組織中STAT6的mRNA和蛋白表達水平變化

與對照組相比，模型組小鼠肺組織中STAT6 mRNA和蛋白磷酸化水平顯著升高(P<0.05)；與模型組和lncRNA PVT1 NC組相比，lncRNA PVT1抑制組小鼠肺組織中STAT6 mRNA和蛋白磷酸化水平顯著降低(P<0.05)(圖2，表7)。

圖2 小鼠肺組織STAT6與p-STAT6蛋白條帶Fig 2 Protein bands of STAT6 and P-STAT6 in lung tissues of mice

表7 小鼠肺組織中STAT6的mRNA和蛋白表達 水平的比較

2.7 miR-214與lncRNA PVT1靶向關(guān)系的預(yù)測與驗證

通過Starbase數(shù)據(jù)庫的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-214與lncRNA PVT1 3′ UTR存在連續(xù)結(jié)合位點。miR-214模擬物的轉(zhuǎn)染顯著抑制了PVT1-wt載體的熒光素酶活性(P<0.05)，但對PVT1-mut載體的熒光素酶活性沒有顯著影響(P<0.05)(圖3，表8)。

圖3 生物信息學預(yù)測miR-214與lncRNA PVT1 3′ UTR結(jié)合位點Fig 3 Bioinformatics prediction of miR-214 and lncRNA PVT1 3′UTR binding site

表8 熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-214與lncRNA PVT1的靶向關(guān)系

3 討論

支氣管哮喘是一種慢性炎性氣道疾病，主要表現(xiàn)為氣道炎性、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑。以肥大細胞、中性粒細胞和嗜酸粒細胞浸潤為主要特征的氣道炎性反應(yīng)是哮喘最關(guān)鍵的病理過程[7]。減輕氣道炎性反應(yīng)和減輕氣道上皮損傷是哮喘治療不可缺少的。從輔助性T細胞分泌的IL-4、IL-5和IL-13等細胞因子參與哮喘的發(fā)生發(fā)展，并可促進IgE的產(chǎn)生[8]。在本研究中，OVA誘導哮喘小鼠后發(fā)現(xiàn)，小鼠炎性反應(yīng)明顯，肺組織損傷嚴重，揭示小鼠哮喘模型構(gòu)建成功。

LncRNAs是指長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，越來越多的研究表明，lncRNAs在調(diào)節(jié)呼吸道炎性反應(yīng)和氣道重塑中具有重要作用[9]。哮喘的發(fā)病機制涉及炎性因子的釋放和氣道細胞屏障的損傷，lncRNA也可能參與調(diào)節(jié)哮喘的發(fā)生和發(fā)展。作為免疫調(diào)節(jié)因子的lncRNA MALAT1可以調(diào)節(jié)氣道樹突狀細胞的成熟以及促炎細胞因子的分泌，從而促進炎性免疫的特定氣道微環(huán)境的形成，并加劇氣道炎性反應(yīng)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)[11]，lncRNA PVT1的過表達可以增加炎性細胞因子IL-1β，IL-6和TNF-α的分泌，并促進氣道上皮細胞的凋亡。在本研究中，lncRNA PVT1抑制物干擾哮喘小鼠后發(fā)現(xiàn)，炎性因子及IgE水平降低，肺組織中氣道炎性反應(yīng)減輕，表明lncRNA PVT1調(diào)節(jié)哮喘的炎性反應(yīng)。

據(jù)報道，miRNAs與哮喘的發(fā)病機制有關(guān)。miR-146b、miR-206和miR-720可能參與NF-κB和GSK3/AKT信號通路的激活，并作為預(yù)測兒童哮喘惡化的生物標志物[12]。根據(jù)之前的實驗，lncRNAs可以與miRNAs相互作用來調(diào)控其表達和功能。LncRNA PVT1與miR-214存在連續(xù)結(jié)合位點[13]。因此，本研究推測PVT1可能通過調(diào)節(jié)miR-214的表達影響哮喘進展。已有研究表明，Stat6是miR-214的一個潛在的靶基因。作為在體內(nèi)外誘導巨噬細胞組織蛋白酶活性的關(guān)鍵因子，STAT6在過敏性氣道疾病動物模型的黏液生成和氣道炎性反應(yīng)的進展過程中具有重要意義[14]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠在lncRNA PVT1抑制物干擾后，miR-214水平升高，STAT6磷酸化降低。LncRNA PVT1可能通過調(diào)節(jié)miR-214/STAT6軸減輕哮喘小鼠的炎性反應(yīng)。

綜上所述，抑制lncRNA PVT1表達可減輕哮喘小鼠的氣道炎性反應(yīng)，其作用機制可能是通過miR-214/STAT6軸發(fā)揮作用。本研究有助于闡明哮喘的發(fā)病機制，為哮喘的治療提供新的靶點，但其作用機制仍需進一步研究。