Circ_0032821參與索拉非尼抑制乳腺癌細(xì)胞系T47D增殖、遷移和侵襲

張曉雷，劉 靜，李朝萍

(黃河三門峽醫(yī)院 1.乳腺外科； 2.健康體檢科, 河南 三門峽 472000； 3.鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院 腫瘤中心, 河南 洛陽 471000)

索拉菲尼(sorafenib)是一種廣譜口服多激酶小分子抑制劑，已被美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于治療晚期腎細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性肝癌[1]。研究顯示，在乳腺癌異種移植瘤和轉(zhuǎn)移模型中，索拉菲尼可抑制血管生成、轉(zhuǎn)移，提高環(huán)磷酰胺的抗腫瘤活性[2]。然而，索拉非尼在乳腺癌中的抗癌作用和分子機(jī)制并未闡明。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類在組織和細(xì)胞中廣泛存在的非編碼RNA，通過與微小RNA(microRNA，miRNA)結(jié)合間接調(diào)節(jié)靶mRNA表達(dá)參與多種細(xì)胞過程。目前已證實(shí)，circRNA表達(dá)改變與乳腺癌進(jìn)展的多個(gè)過程相關(guān)[3-4]。研究報(bào)道circ_0032821在胃癌中表達(dá)上調(diào)，可能是胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。敲除circ_0032821可導(dǎo)致細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和遷移受到抑制[5]。然而，circ_0032821在乳腺癌中的表達(dá)和功能尚不清楚。因此，本研究擬通過分析索拉菲尼對乳腺癌細(xì)胞系T47D增殖、遷移和侵襲以及circ_0032821表達(dá)的影響，旨在揭示索拉菲尼在乳腺癌中抗癌作用和潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞：人乳腺癌細(xì)胞系T47D(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)。

1.1.2 試劑和試劑盒：索拉非尼(純度≥98.5%，先用二甲基亞砜配置成母液，后用細(xì)胞培養(yǎng)液液稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度；海南滿方園醫(yī)藥公司)；Circ_0032821小干擾RNA(circ_0032821 small interfering RNA，si-circ_0032821)及其陰性對照(small interfering RNA negative control，si-NC)、circ_0032821過表達(dá)質(zhì)粒(circ_0032821 over-expressed plasmid，pcDNA-circ_0032821)(上海生工生物公司)；SYBR Green Master Mix試劑盒和細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit，CCK-8，南京諾唯贊生物公司)；TRIzol提取(上海碧云天生物公司)；Lipofectamine 2000和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)和分組：將T47D細(xì)胞用含10%胎牛血清的杜爾伯格伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)，于含5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胰蛋白酶消化已達(dá)80%匯合的細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞；按照1∶3比傳代培養(yǎng)。在6孔板中接種2×105個(gè)對數(shù)期T47D細(xì)胞。按照Lipofectamine 2000使用說明將si-NC、si-circ_0032821或pcDNA-circ_0032821分別轉(zhuǎn)染50%匯合的T47D細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染48 h時(shí)，用RT-qPCR檢測T47D細(xì)胞中circ_0032821相對水平以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。實(shí)驗(yàn)分組：用分別含2.5、5或10 μmol/L索拉非尼[6]的培養(yǎng)液孵育T47D細(xì)胞；轉(zhuǎn)染si-NC和si-circ_0032821的T47D細(xì)胞分別記為si-NC組和si-circ_0032821組；用含10 μmol/L索拉非尼的培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染pcDNA-circ_0032821的T47D細(xì)胞，記為索拉非尼+pcDNA-circ_0032821組。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖：在96孔板中接種4×103個(gè)未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染后T47D細(xì)胞。給予含對應(yīng)索拉非尼濃度的培養(yǎng)液孵育48 h，更換為含10% CCK-8的培養(yǎng)液，再孵育2 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度(A)。增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)孔A/對照孔A)×100%

1.2.3 平板集落實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力：在6孔板中接種200個(gè)各組T47D細(xì)胞，輕輕晃動(dòng)平板使細(xì)胞均勻分散，放入培養(yǎng)箱孵育12～15 d，當(dāng)細(xì)胞成為集落時(shí)終止培養(yǎng)。棄去細(xì)胞懸液，分別用4%多聚甲醛固定、0.1%結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下計(jì)數(shù)各組T47D細(xì)胞(大于50個(gè)細(xì)胞)集落數(shù)。

1.2.4 劃痕愈合率實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移：將各組T47D細(xì)胞接種于6孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，用1 mL槍頭垂直于6孔板底部劃傷單層細(xì)胞。替換為無血清培養(yǎng)基，將6孔板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在培養(yǎng)0和24 h時(shí)拍照，ImagJ軟件測量劃痕寬度。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%

1.2.5 Transwell小室法檢測細(xì)胞侵襲：每組取3×103個(gè)T47D細(xì)胞重新懸浮于200 μL無血清培養(yǎng)基中并接種Transwell上室(包被基質(zhì)膠涂層)，將600 μL補(bǔ)充20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入下室。孵育24 h，滅菌棉簽除去Transwell室膜上表面附著細(xì)胞和基質(zhì)膠，4%多聚甲醛固定Transwell室膜下表面細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色。在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)隨機(jī)視野細(xì)胞總數(shù)，取均值表示T47D細(xì)胞侵襲數(shù)量。

1.2.6 RT-qPCR檢測circ_0032821表達(dá)：用TRIzol提取各組T47D細(xì)胞總RNA。其純度和濃度采用分光光度法計(jì)算。為檢測circ_0032821表達(dá)，用M-MLV酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用SYBR Green Master Mix試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。采用2-ΔΔCt法分析circ_0032821相對表達(dá)量。Circ_0032821上游引物：5′-AGGAATCT GAGTTGCAGTGTCTC-3′，下游引物：5′-TGATCCTT GAGCTGCAATCTGG-3′。內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′；下游引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 索拉非尼對T47D細(xì)胞惡性行為的影響

與對照組比較，索拉非尼(2.5、5和10 μmol/L)組T47D細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，集落形成數(shù)、劃痕愈合率及侵襲數(shù)量均顯著降低(P<0.05)，且索拉非尼對T47D細(xì)胞生物行為的抑制作用呈濃度依賴性(表1,圖1)。

表1 索拉非尼抑制T47D細(xì)胞增殖、遷移和侵襲Table 1 Sorafenib inhibited the proliferation, migration and invasion of T47D

A.effect of sorafenib on T47D colony formation; B.effect of Sorafenib on T47D scratch healing(×40); C.effect of sorafenib on the number of T47D invasion cells(scale bar=200 μm)

2.2 索拉非尼對T47D細(xì)胞中circ_0032821表達(dá)的影響

與對照組比較，索拉非尼(2.5、5、10 μmol/L)組T47D細(xì)胞circ_0032821相對水平顯著降低(P<0.05)。且索拉非尼對circ_0032821表達(dá)的抑制作用呈濃度依賴性(表2)。

表2 索拉非尼對T47D細(xì)胞中circ_0032821表達(dá)的影響

2.3 沉默circ_0032821對T47D細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

Si-circ_0032821組T47D細(xì)胞中circ_0032821相對水平顯著低于si-NC組，表明轉(zhuǎn)染si-circ_0032821后circ_0032821的表達(dá)受到抑制。與si-NC組比較，si-circ_0032821組T47D細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)，集落形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)(圖2，表3)。

A.effect of silence circ_0032821 on T47D colony formation; B.effect of silence circ_0032821 on the number of T47D invasion cells(scale bar=200 μm); C.effect of silence circ_0032821 on T47D scratch healing(×40)

表3 沉默circ_0032821抑制T47D細(xì)胞增殖、遷移和侵襲Table 3 Silencing circ_0032821 inhibited the proliferation, migration and invasion of T47D

2.5 過表達(dá)circ_0032821對索拉非尼處理的T47D細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

與對照組比較，索拉非尼組T47D細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)；集落形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲數(shù)量以及circ_0032821相對水平顯著降低(P<0.05)；與索拉非尼組比較，索拉非尼+pcDNA-circ_0032821組T47D細(xì)胞增殖抑制率顯著降低(P<0.05)，集落形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲數(shù)量以及circ_0032821相對水平顯著升高(P<0.05)(圖3，表4)。

A.over-expression of circ_0032821 can reverse the effect of sorafenib on T47D colony formation; B.over-expression of circ_0032821 could reverse the effect of sorafenib on T47D scratch healing(×40); C.over-expression of circ_0032821 could reverse the effect of sorafenib on T47D invasion(scale bar=200 μm)

表4 過表達(dá)circ_0032821可逆轉(zhuǎn)索拉非尼對T47D細(xì)胞惡性行為的抑制作用

3 討論

索拉菲尼通過抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和血管生成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在多種人類癌中表現(xiàn)出抗癌潛力。索拉菲尼可抑制細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶(Janus Kinase，JAK)/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)信號通路，進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖[7]。業(yè)已發(fā)現(xiàn)[8-9]，索拉菲尼在肝癌中的促凋亡、抗血管生成作用與抑制促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MEK)/胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracel-lular regulated kinase，ERK)通路活化有關(guān)。也有研究證實(shí)[10]，索拉菲尼以劑量依賴方式誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。此外，有報(bào)道[11]，索拉非尼和多柔比星聯(lián)用對肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞具有促凋亡作用。本研究探討索拉菲尼對乳腺癌細(xì)胞生物行為的影響，結(jié)果表明，索拉菲尼處理顯著抑制乳腺癌細(xì)胞T47D活力，降低其集落形成、遷移和侵襲能力，這與已有報(bào)道[12]結(jié)論吻合。轉(zhuǎn)移是乳腺癌治療失敗的重要原因，因此索拉非尼通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移具有提高乳腺癌患者生存率潛力。

Circ_0032821表達(dá)異常已被證實(shí)與胃癌進(jìn)展相關(guān)。胃癌組織和細(xì)胞系中circ_0032821表達(dá)上調(diào)。沉默circ_0032821則可抑制胃癌細(xì)胞的體外增殖、轉(zhuǎn)移能力，抑制糖酵解代謝，抑制胃癌發(fā)生[13]。此外，circ_0032821通過靶向下調(diào)miR-515-5p促進(jìn)胃癌細(xì)胞奧沙利鉑耐藥[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，索拉菲尼處理后T47D細(xì)胞中circ_0032821表達(dá)水平顯著下調(diào)。但circ_0032821低表達(dá)是否介導(dǎo)索拉菲尼的抗腫瘤作用并不清楚。本研究結(jié)果顯示，干擾circ_0032821表達(dá)明顯抑制T47D細(xì)胞活力，降低其集落形成、遷移和侵襲能力，這與索拉菲尼的抗腫瘤效果類似。進(jìn)一步的逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)circ_0032821可減弱索拉菲尼對T47D細(xì)胞生物行為的抑制作用，提示下調(diào)circ_0032821可能是索拉菲尼在乳腺癌中發(fā)揮抗腫瘤作用的重要途徑。

總之，索拉菲尼可有效抑制乳腺癌T47D細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其抗腫瘤機(jī)制可能是通過下調(diào)circ_0032821實(shí)現(xiàn)的，提示索拉菲尼是對抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的重要藥物，并為乳腺癌治療提供潛在有效靶點(diǎn)。