可移植人髓母細(xì)胞瘤PUMC-MBT1瘤株的建立與鑒定

王世尊，張 丹，葛 明，馮海涼，劉玉琴*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 1.病理學(xué)系; 2.細(xì)胞中心，北京 100005； 3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院 國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心 神經(jīng)外科， 北京 100045)

髓母細(xì)胞瘤(medulloblastoma)是一種常見(jiàn)的后顱窩惡性胚胎性腫瘤，好發(fā)于兒童[1]。由于中國(guó)小兒神經(jīng)外科起步較晚，全國(guó)范圍內(nèi)能開(kāi)展小兒神經(jīng)外科的醫(yī)院較少[2]，因此兒童神經(jīng)腫瘤組織標(biāo)本十分珍貴。另外目前對(duì)髓母細(xì)胞瘤生物學(xué)行為的認(rèn)識(shí)和治療方法的探索仍存在較大的困難，其主要原因在于髓母細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展等內(nèi)在機(jī)制研究尚不充分，且髓母細(xì)胞瘤可用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ洼^少，因此建立更多的髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞和動(dòng)物模型顯得尤為重要[3]。目前用于研究髓母細(xì)胞瘤的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭饕獮榧?xì)胞模型和動(dòng)物模型，其中細(xì)胞模型主要包括連續(xù)傳代細(xì)胞系[4]和類(lèi)器官培養(yǎng)[5]，動(dòng)物模型主要包括細(xì)胞系來(lái)源的異種種植腫瘤(cell-line-derived xenograft, CDX)[6]、患者來(lái)源的異種種植腫瘤(patient-derived xenograft, PDX)[7]以及基因編輯模型小鼠(genetically enginee-red mouse models, GEMMs)[8]等。其中連續(xù)傳代細(xì)胞系、CDX模型和PDX模型應(yīng)用較為廣泛。PDX模型雖較CDX模型更接近患者情境，如腫瘤細(xì)胞的多樣性等，但構(gòu)建過(guò)程相對(duì)CDX模型更加繁瑣，成功率較低并且較難獲得穩(wěn)定的株系[3]。本研究通過(guò)接種人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系PUMC-MB1，構(gòu)建了一個(gè)可在小鼠體內(nèi)連續(xù)穩(wěn)定傳代的可移植瘤模型——PUMC-MBT1瘤株，旨在為髓母細(xì)胞瘤研究提供易于構(gòu)建、特征穩(wěn)定的體內(nèi)研究工具。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系

SPF級(jí)SCID雄性和雌性小鼠，4～5周齡，體質(zhì)量16～18 g(北京華阜康生物科技有限公司[SCXK(京)2019-0008])。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)遵循中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物倫理要求及福利飼養(yǎng)，環(huán)境采用12 h/ 12 h光照/黑暗條件，小鼠自由飲水、采食，并遵循“3R”原則[減量化(reducing)]，再利用(resusing)和再循環(huán)(recycling)三種原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系PUMC-MB1為本課題組自建髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，經(jīng)鑒定為經(jīng)典型髓母細(xì)胞瘤。本研究使用的為自液氮復(fù)蘇的第40代細(xì)胞[PUMC-MB1(P40)]。腫瘤CDX模型構(gòu)建和傳代均在生物安全柜中進(jìn)行。

1.2 試劑與儀器

一抗：anti-NeuN(貨號(hào)：#ABN78)(Millipore公司)；anti-Syn(貨號(hào)：#36406)、anti-H2K27M(貨號(hào)：#74829)、anti-MUC1(貨號(hào)：#4538)(CST公司)；anti-Ki-67(貨號(hào)：ab16667)、anti-GFAP(貨號(hào)：ab7260)、anti-CK(AE1/AE3) (貨號(hào)：ab80826)、anti-S100(貨號(hào)：ab52642)(Abcam公司)；二抗：通用二步法檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：PV-9000)、抗體稀釋液、DAB顯色試劑盒及蘇木精-伊紅(HE)染料(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 髓母細(xì)胞瘤移植瘤瘤株建立

復(fù)蘇培養(yǎng)PUMC-MB1(P40)細(xì)胞，于體外培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，收集細(xì)胞，離心并用PBS重懸為5×107個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，于SCID小鼠右側(cè)腋窩皮下接種細(xì)胞懸液0.1 mL，雄性小鼠5只和雌性小鼠5只，待皮下腫瘤(P0)長(zhǎng)徑增長(zhǎng)至1.5 cm時(shí)，麻醉后處死小鼠，取出腫瘤并置于PBS中，剪除外周纖維組織、血管及中心壞死組織，將剩余魚(yú)肉樣腫瘤組織剪碎并充分研磨后用PBS重懸，細(xì)胞濃度為5×107個(gè)/mL，細(xì)胞懸液0.1 mL接種于每只小鼠的右側(cè)腋窩皮下，體內(nèi)移植瘤命名為PUMC-MBT1，并記作P1。重復(fù)上述步驟連續(xù)于體內(nèi)傳代10次，每次雄性小鼠2只和雌性小鼠2只，分別記作P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9，第10代為10只(5只雄性、5只雌性)小鼠。記錄第10代移植瘤模型腫瘤生長(zhǎng)情況、荷瘤小鼠體質(zhì)量以及生存情況，留取腫瘤組織用于后續(xù)病理學(xué)檢查。

1.4 髓母細(xì)胞瘤移植瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的觀察

PUMC-MBT1移植后每3 d觸摸小鼠皮下有無(wú)瘤性結(jié)節(jié)，記錄小鼠體質(zhì)量。如觸及腫瘤，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑(L)和短徑(S)，并按照公式V(mm3)=L(mm)×S(mm)2/2計(jì)算腫瘤體積。

1.5 髓母細(xì)胞瘤移植瘤特性鑒定

PUMC-MBT1(P10) 腫瘤組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，行HE染色，并進(jìn)行Ki-67、Syn、NeuN、GFAP、S-100、H3K27M、MUC1、CK(AE1/AE3)免疫組化染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 髓母細(xì)胞瘤PUMC-MBT1移植瘤模型建立情況

PUMC-MB1細(xì)胞系接種25 d左右可在皮下觸及結(jié)節(jié)，40 d后腫瘤長(zhǎng)徑達(dá)到1.5 cm左右。PUMC-MBT1細(xì)胞株從P1傳至P9，各代雄性小鼠和雌性小鼠成瘤率均為100%，25～35 d傳代1次。第10代雄性小鼠(n=5)和雌性小鼠(n=5)皮下成瘤率見(jiàn)圖1。P10在接種后第14天可在皮下觸及結(jié)節(jié)，29 d后腫瘤長(zhǎng)徑達(dá)到1.5 cm左右。腫瘤生長(zhǎng)曲線可見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)的4個(gè)階段：0～14 d為潛伏期、15～29 d為快速生長(zhǎng)期、30～41 d為死亡前期、42～58 d為死亡期(圖2)。同一時(shí)間點(diǎn)，雄性小鼠和雌性小鼠之間腫瘤體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A)。荷瘤小鼠體質(zhì)量穩(wěn)定增長(zhǎng)，同一時(shí)間點(diǎn)，雄性小鼠和雌性小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 2B)。荷瘤雄性小鼠生存時(shí)間為(46.0±2.8)d (n=5)，荷瘤雌性小鼠生存時(shí)間為(54.8±3.1)d (n=5)，雄雌小鼠荷瘤生存時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 2C)。

The first line: male tumor-bearing mice; the second line: female tumor-bearing mice圖1 PUMC-MBT1細(xì)胞的成瘤性驗(yàn)證Fig 1 Tumorigenicity of PUMC-MBT1 cells(n=5)

A.growth curve of transplanted tumors of male/female mice at passage 10; B.body weight of tumor-bearing male/female mice at passage 10; C.survival curve of tumor-bearing male/female mice at passage 10

2.2 髓母細(xì)胞瘤PUMC-MBT1移植瘤病理形態(tài)學(xué)觀察

PUMC-MBT1移植瘤肉眼觀形態(tài)相對(duì)規(guī)則，呈圓形或橢圓形，腫瘤表面有包膜，與周?chē)M織邊界清晰，周?chē)泄┭?圖3A)，腫瘤實(shí)質(zhì)為魚(yú)肉樣，質(zhì)韌(圖3B)。解剖小鼠腦、肝臟、脾、肺臟、胰腺和腎，肉眼未見(jiàn)轉(zhuǎn)移灶。HE切片觀察可見(jiàn)腫瘤由高度密集的小細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞胞質(zhì)少，核大且深染，呈圓形或卵圓形，高倍鏡下可見(jiàn)多個(gè)核仁以及多核分裂象(圖 3C)，與患者原發(fā)灶組織病理學(xué)一致(圖3D)。

A.general view of transplanted tumor; B.section view of transplanted tumor; C.HE image of transplanted tumor; D.HE image of original tumor (scale bar=100 μm)

2.3 髓母細(xì)胞瘤PUMC-MBT1移植瘤特異性分子表達(dá)情況

腫瘤免疫組化染色可見(jiàn)Ki-67陽(yáng)性(80%～90%)，Syn陽(yáng)性(40%～50%)，NeuN陽(yáng)性(20%～30%)，GFAP、S-100、H3K27M、MUC1、CK(AE1/AE3)陰性(圖4)。

圖4 PUMC-MBT1免疫組化染色Fig 4 Immunohistochemical images of PUMC-MBT1(scale bar=50 μm)

3 討論

隨著神經(jīng)外科和放化療技術(shù)的進(jìn)步，接受多學(xué)科綜合治療的髓母細(xì)胞瘤患者中60%～80%可達(dá)到長(zhǎng)期生存[9]，但是高危組患者預(yù)后仍較差[1]。因此為了更好地支持髓母細(xì)胞瘤的研究，本研究通過(guò)接種人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系PUMC-MB1構(gòu)建了一個(gè)可在小鼠體內(nèi)連續(xù)穩(wěn)定傳代的可移植髓母細(xì)胞瘤模型PUMC-MBT1。

PUMC-MBT1移植瘤與人髓母細(xì)胞瘤的病理特征特性一致，是人髓母細(xì)胞瘤體內(nèi)研究的理想模型。PUMC-MBT1來(lái)源于本課題組自建人髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系PUMC-MB1的CDX模型，經(jīng)過(guò)小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代，很好地適應(yīng)了小鼠體內(nèi)環(huán)境，生長(zhǎng)(潛伏期、生長(zhǎng)速度、荷瘤壽命)特性等已穩(wěn)定，與CDX模型相比，成瘤潛伏期明顯縮短，由25 d縮短至14 d，快速生長(zhǎng)期時(shí)間相近，成瘤率100%。生長(zhǎng)速度適中，荷瘤小鼠存活時(shí)間50 d左右，一批體內(nèi)研究可在30 d左右得到結(jié)果。移植瘤組織病理學(xué)特征與患者原發(fā)灶組織病理學(xué)結(jié)果保持一致，均為經(jīng)典型髓母細(xì)胞瘤，免疫組化染色顯示髓母細(xì)胞瘤特異表達(dá)分子Syn和NeuN為陽(yáng)性，GFAP、S-100、H3K27M、MUC1、CK(AE1/AE3)均為陰性，與星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤和室管膜瘤等可鑒別。表明PUMC-MBT1細(xì)胞可作為髓母細(xì)胞瘤體內(nèi)研究工具。

可移植瘤瘤株建立體內(nèi)腫瘤研究模型比CDX/PDX具有突出的優(yōu)勢(shì)。腫瘤研究中，體外培養(yǎng)連續(xù)細(xì)胞系的優(yōu)勢(shì)在于可以進(jìn)行基因操作，驗(yàn)證信號(hào)通路等分子機(jī)制，可以觀察藥物等影響因素對(duì)腫瘤細(xì)胞直接的作用。與體內(nèi)環(huán)境相比，體外培養(yǎng)環(huán)境簡(jiǎn)單、條件易控。但是，體外培養(yǎng)很難體現(xiàn)真實(shí)發(fā)生在體內(nèi)的腫瘤的方方面面。所以在藥物研究過(guò)程中，利用動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行的藥效學(xué)驗(yàn)證是無(wú)法逾越的階段。CDX在多組體內(nèi)研究時(shí)，比如需要50～60只動(dòng)物接種時(shí)，需要培養(yǎng)大量的細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)且昂貴。根據(jù)腫瘤類(lèi)型和使用小鼠種類(lèi)的不同，PDX模型成功率不同，對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，據(jù)報(bào)道使用SICD小鼠構(gòu)建PDX模型平均成功率僅50%左右[10]。人的腫瘤組織第一次移植到小鼠體內(nèi)，潛伏很長(zhǎng)、且不確定[11]。第一代移植的腫瘤，首先在數(shù)量上往往也不能滿足多組研究的需要，需要多次在動(dòng)物體內(nèi)傳代，才能獲得足量腫瘤；其次，在這個(gè)過(guò)程中腫瘤細(xì)胞多樣性在傳代后能否保留，也是未知數(shù)，缺乏研究[12]。而使用瘤株的移植瘤模型，在動(dòng)物體內(nèi)傳代后，克服了上述種種缺點(diǎn)，保留了腫瘤最主要的特性，獲得了穩(wěn)定的預(yù)期。瘤株可在液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存，使用時(shí)復(fù)蘇建模，是理想的腫瘤實(shí)驗(yàn)研究模型。

綜上所述，PUMC-MBT1細(xì)胞具有穩(wěn)定傳代的特性，是髓母細(xì)胞瘤良好的體內(nèi)研究工具。