C5a/C5aR1通過促γδ T細(xì)胞IL-17A表達(dá)介導(dǎo)IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮炎

鄭權(quán)友，梁申菊，舒 勇，周 山，鐘 渝，盛 芬，唐銘君*

(1.中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué) 陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 中國人民解放軍陸軍第九五八醫(yī)院 腎病泌尿科，重慶 400020；2.中國人民解放軍陸軍特色醫(yī)學(xué)中心 風(fēng)濕免疫科，重慶 400042)

銀屑病(psoriasis)是一種免疫反應(yīng)介導(dǎo)的慢性炎性皮膚疾病，全球范圍內(nèi)發(fā)病率約2%～3%[1]。其典型病理表現(xiàn)為表皮角質(zhì)細(xì)胞異常增殖、角質(zhì)細(xì)胞分化不良、免疫炎性細(xì)胞浸潤及真皮毛細(xì)血管增生紊亂[2]。補(bǔ)體系統(tǒng)是天然免疫的重要組分，是由30多種可溶性蛋白和膜結(jié)合蛋白構(gòu)成的復(fù)雜調(diào)控體系[3]。補(bǔ)體異常激活產(chǎn)生炎性介質(zhì)補(bǔ)體5a (complement 5a, C5a)，其與C5a受體1(C5a receptor 1, C5aR1)結(jié)合后，參與調(diào)節(jié)天然免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答，促進(jìn)多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如膿毒血癥、缺血/再灌注損傷及慢性腎盂腎炎等[4-5]。前期研究結(jié)果表明，補(bǔ)體C5a/C5aR1參與銀屑病病理過程[6]。然而，其具體作用及其機(jī)制尚不明確。

咪喹模特(imiquimod, IMQ)乳膏可誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮膚炎性反應(yīng)，是一種常用的銀屑病研究動物模型[7]。小鼠耳部或者背部皮膚涂抹5～6 d后出現(xiàn)具有臨床特征的銀屑病樣皮膚炎性反應(yīng)，如鱗屑、紅斑及表皮增厚等；機(jī)制研究表明IL-17A在IMQ誘導(dǎo)銀屑病樣皮炎病理過程中扮演重要角色，已成為銀屑病治療的新靶點(diǎn)[7-8]。然而，銀屑病病理過程中補(bǔ)體C5a/C5aR1通路是否參與調(diào)節(jié)IL-17A應(yīng)答，尚無相關(guān)報(bào)道。因此，本研究擬建立IMQ誘導(dǎo)銀屑病皮炎模型及體外實(shí)驗(yàn)以探討C5a/C5aR1通路在銀屑病病理過程中的作用及其對IL-17A應(yīng)答的影響。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 動物：C5aR1-/-小鼠(BALB/C背景, 美國Jackson實(shí)驗(yàn)室)；對照野生型C5aR1+/+小鼠(北京華阜康生物技術(shù)有限公司)。所有小鼠繁殖于SPF動物房，選擇8～12周齡健康雌性小鼠用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)操作及動物倫理嚴(yán)格遵守陸軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會制定動物倫理規(guī)范。

1.1.2 試劑及試劑盒：咪喹模特乳膏(IMQ，四川明欣藥業(yè)公司)；C5aR1阻斷多肽(C5aR1a, Ac-Phe-Orn-Pro-dCha-Trp-Arg; 1 mg/kg;吉爾生物技術(shù)公司)；抗小鼠CD3、Ly-6G及TNF-α抗體(Abcam公司)；抗小鼠IL-17A抗體(Santa Cruz公司)；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗及DAB顯色液(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；Ⅳ型膠原酶、Pyromellitic acid、Ionomycin及DNA酶Ⅰ(Sigma-Aldrich公司)；TruStain fcX antibody、重組小鼠IL-23、熒光標(biāo)記抗小鼠C5aR1、CD3、γδ TCR及IL-17A流式抗體(BioLegend公司)；Brefeldin A及Fixation-Permeabilization Kit (eBioscience公司)；1640完全培養(yǎng)基 (Hyclone公司)；重組小鼠C5a(rmC5a, Peprotech公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理：取8～12周齡雌性C5aR1+/+及C5aR1-/-小鼠5～6只，實(shí)驗(yàn)前1 d用刀片仔細(xì)刮除小鼠背部毛發(fā)(約為2.0 cm×3.0 cm)，實(shí)驗(yàn)組(IMQ組)用50 mg 5% IMQ乳膏均勻涂抹小鼠背部皮膚，連續(xù)涂抹6 d；對照組(control組)用凡士林(Vasline)乳膏涂抹相同部位6 d。C5aR1阻斷實(shí)驗(yàn)中，C5aR1+/+小鼠于涂IMQ乳膏2 h前，腹腔注射C5aR1a。每次涂藥前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照，雙盲法分析小鼠銀屑病樣皮膚炎性反應(yīng)。

1.2.2 組織病理的分析：涂藥6 d后，收集其背部皮膚組織，4%多聚甲醛固定。組織石蠟包埋切片(4 μm)，HE染色明確各組小鼠皮膚組織病理學(xué)變化。IHC檢測方法：石蠟切片經(jīng)脫蠟水化后于檸檬酸緩沖液中進(jìn)行微波高溫抗原修復(fù)20 min，自然冷卻至室溫后，3% H2O2溶液孵育20 min去除內(nèi)源性過氧化物酶，5% BSA室溫封閉1 h后，加入抗小鼠CD3(1∶100)、Ly-6G(1∶200)、IL-17A(1∶200)及TNF-α抗體(1∶200)于4 ℃冰箱孵育過夜。次日用PBS溶液洗去未結(jié)合抗體，加入HRP標(biāo)記的二抗(1:800)室溫孵育1 h，配制DAB溶液并顯色2 min左右，蘇木精染液復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡(Olympus)下觀察組織中CD3、Ly-6G、IL-17A及TNF-α的陽性染色。隨機(jī)選擇5～6個(gè)高倍鏡視野半定量統(tǒng)計(jì)切片中CD3、Ly-6G、IL-17A及TNF-α陽性染色細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 流式細(xì)胞測量術(shù)(FCM)檢測：涂藥6 d后，收集各組小鼠背部皮膚組織，去除皮下脂肪組織，眼科剪剪碎，以含Ⅳ型膠原酶(2 mg/mL)及DNA酶Ⅰ(200 U/mL)的1640培養(yǎng)基于37 ℃孵育箱中消化1 h，含5% EDTA及1% BSA溶液終止消化，用70目篩網(wǎng)過濾兩次制備皮膚單細(xì)胞懸液備用。腋窩淋巴結(jié)取出后，用70目篩網(wǎng)輕柔碾磨過濾制備單細(xì)胞懸液備用。

細(xì)胞表面染色：取已制備好的細(xì)胞懸液(1×106細(xì)胞/L)，TruStain fcX antibody (2 μL/test)冰上孵育20 min封閉，加入不同熒光標(biāo)記抗小鼠C5aR1、CD3及γδ TCR抗體 (1 μL/test)冰上避光孵育25 min，流式洗液(含1% FBS的PBS)清洗2次后行流式細(xì)胞儀檢測(BD FACS Canto Ⅱ)或進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。

IL-17A 胞內(nèi)因子檢測：制備好的皮膚或淋巴細(xì)胞懸液以含50 ng/mL pyromellitic acid, 500 ng/mL ionomycin和3 μg/mL Brefeldin A的1640 完全培養(yǎng)基37 ℃刺激4 h。表面染色后，用Fixation-Permeabilization kit固定通透細(xì)胞，然后加入抗IL-17A(1 μL/test)抗體冰上染色25 min。流式洗液(含1% FBS的PBS)清洗2次后行流式細(xì)胞儀檢測，用Flow Jo軟件分析所得數(shù)據(jù)。

1.2.4 脾臟淋巴細(xì)胞刺激及IL-17A表達(dá)的檢測：C5aR1+/+小鼠經(jīng)IMQ或凡士林乳膏刺激背部皮膚3 d 后，無菌條件下取其脾臟，用70目篩網(wǎng)過濾制備單細(xì)胞懸液，按1×106個(gè)細(xì)胞/L濃度接種于6孔板加入分別含重組小鼠C5a(200 ng/mL), 重組小鼠IL-23(10 ng/mL)或C5aR1a(200 ng/mL) 的1640完全培養(yǎng)基刺激24 h。收集刺激細(xì)胞，按FCM胞內(nèi)染色方法進(jìn)行細(xì)胞表面及胞內(nèi)IL-17A染色，流式洗液(含1% FBS的PBS)清洗兩次后行流式細(xì)胞儀檢測，用Flow Jo軟件分析所得數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 C5aR1缺陷顯著減輕IMQ誘導(dǎo)銀屑病樣皮膚炎性反應(yīng)

與對照組相比，IMQ能夠誘導(dǎo)小鼠背部皮膚產(chǎn)生銀屑病典型皮損表現(xiàn)，如銀屑、紅斑及硬皮改變等；與C5aR1+/+組相比，C5aR1-/-組小鼠上述銀屑病皮損表型則明顯減輕。用銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程序指數(shù)(psoriasis area and severity index,PASI)來評估嚴(yán)重程度(圖1A)。此外，IMQ刺激后出現(xiàn)銀屑病典型病理改變，如表皮細(xì)胞異常增殖、表皮微膿腫、棘皮征、角化不全及真皮大量炎性細(xì)胞浸潤等，而C5aR1-/-組上述表現(xiàn)較C5aR1+/+組顯著減輕(圖1B)。定量分析表皮細(xì)胞厚度發(fā)現(xiàn)，C5aR1敲除后IMQ誘導(dǎo)的表皮細(xì)胞異常增厚明顯緩解(P<0.01)(圖1B)。

A,B.macroscopic phenotype of back psoriatic lesions and modified PASI scores; B,C.HE staining for psoriatic skin lesions(×40), and quantification for epidermal thickness; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with C5aR1+/+ mice with IMQ treatment

2.2 C5aR1基因缺陷后炎性細(xì)胞浸潤顯著減少及炎性因子表達(dá)明顯下調(diào)

與C5aR1+/+組相比，C5aR1-/-組CD3+T細(xì)胞及Ly-6G+中性粒細(xì)胞浸潤顯著減少(圖2A)；相似的，炎性因子IL-17A及 TNF-α表達(dá)明顯下調(diào)(圖2B)。

A.IHC staining and semi-quantification graphs of CD3 positive T and Ly-6G positive neutrophils; B.IHC staining and semi-quantification graphs of IL-17A and TNF-α positive staining; *P<0.05, **P<0.01 compared with C5aR1+/+ mice with IMQ treatment; scale bar=20 μm; Arrow shows positive cells

2.3 C5aR1敲除下調(diào)IMQ誘導(dǎo)γδ T細(xì)胞IL-17A的表達(dá)

如(圖3A)所示，腋窩引流淋巴細(xì)胞中約80%的IL-17A來源于γδ TCR+CD3+T，表明其為IL-17A的主要分泌細(xì)胞亞群。與C5aR1+/+組相比，C5aR1-/-組腋窩引流淋巴細(xì)胞中IL-17A+CD3+T及IL-17A+γδ TCR+T細(xì)胞百分率明顯降低(圖3BC)。與上述結(jié)果相似，C5aR1基因缺陷后IMQ誘導(dǎo)銀屑病皮損組織局部IL-17A表達(dá)明顯下調(diào)，且IL-17A的主要由γδ TCR+T細(xì)胞分泌(圖3D,E)。

A.flow plots shown the major sources of IL-17A are γδ T cells; B.flow plots and cumulative graphs showing the percentages of IL-17A+ CD3+ T cells; C.flow plots and cumulative graphs showing the percentages and IL-17A+TCR γδ+ T cells; D.representative contour plots of skin-infiltrating IL-17A+ and γδ TCR+cells in skin cell suspensions after 5 days of IMQ treatment; left panel: flow plots and graphs showing the IL-17A+ cells from C5aR1+/+ and C5aR1-/- mice; Right panel: flow plots and quantification of γδ TCR+in IL-17A positive cells;*P<0.05, **P<0.001 compared with C5aR1+/+ mice with IMQ treatment

2.4 C5aR1a阻斷C5a/C5aR1通路后IMQ誘導(dǎo)銀屑病樣皮膚炎性反應(yīng)及IL-17A應(yīng)答顯著減弱

與對照組相比，C5aR1a組IMQ誘導(dǎo)小鼠銀屑病典型皮損表型(銀屑、紅斑及硬皮改變等)明顯減輕(圖4A，B)。此外，C5aR1a阻斷顯著緩解IMQ誘導(dǎo)表皮細(xì)胞異常增殖、表皮微膿腫及真皮炎性細(xì)胞浸潤，且表皮細(xì)胞層數(shù)明顯減少(圖4C)。與之一致的是，C5aR1a組腋窩引流淋巴細(xì)胞中IL-17A+CD3+T及IL-17A+γδ TCR+T細(xì)胞百分率較對照組明顯降低(P<0.05)(圖5A，B)，進(jìn)一步證實(shí)，補(bǔ)體C5a/C5aR1通路促進(jìn)銀屑病病理過程。

A.macroscopic phenotype of back psoriatic lesions on days 6; B.disease severity (PASI) is scored and analyzed; C.HE staining for psoriatic skin lesions, and quantification for epidermal layers(×40)； *P<0.05， **P<0.01 compared with saline(control)

C5aR1+/+ mice were pre-treated with a C5aR1 antagonist (C5aR1a, 1 mg/kg) or 0.9% saline for 2 hours before imiquimod (IMQ) treatment; on day 6, axillary draining lymphocytes were stained with indicated antibodies; A.flow plots and cumulative graphs showing the percentages of IL-17A+ CD3+ T cells; B.flow plots and cumulative graphs showing the percentages of of IL-17A+ CD3+ T cells; *P<0.05 compared with control group

2.5 補(bǔ)體C5a/C5aR1通路促進(jìn)γδ T細(xì)胞IL-17A表達(dá)

與未刺激組相比，C5a單獨(dú)作用不能顯著促進(jìn)γδ T細(xì)胞表達(dá)IL-17A；與IL-23單獨(dú)刺激相比，C5a聯(lián)合IL-23顯著上調(diào)γδ T細(xì)胞表達(dá)IL-17A；而C5aR1a阻斷C5aR1后，γδ T細(xì)胞分泌IL-17A顯著降低(圖6)。

C5aR1+/+ were treated with IMQ on the shaved back for the indicated times; spleen lymphocytes were isolated, stimulated with recombinant mouse C5a (rmC5a, 200 ng/mL), recombinant mouse IL-23 (IL-23, 10 ng/mL), or a C5aR1-antagonizing peptide (C5aR1a, 200 ng/mL) for 24 hours and then stained with indicated antibodies; flow plots of IL-17A expression on CD3+ γδ TCR+T cells are presented

3 討論

本研究結(jié)果顯示，IMQ誘導(dǎo)小鼠背部皮膚炎性反應(yīng)具備表皮角質(zhì)細(xì)胞異常增殖及免疫炎性反應(yīng)反應(yīng)等銀屑病典型病理表現(xiàn)，與已有研究結(jié)果一致[9]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，IMQ誘導(dǎo)小鼠銀屑病皮炎及銀屑病患者中C5a/C5aR1表達(dá)明顯上調(diào)；機(jī)制研究表明，其可促類漿細(xì)胞炎性因子分泌介導(dǎo)銀屑病病理過程[6]。盡管如此，C5a/C5aR1通路在銀屑病中的作用及機(jī)制尚不完全明確。本研究結(jié)果顯示，C5aR1敲除后銀屑病皮炎程度明顯減輕；組織病理學(xué)提示，表皮角質(zhì)細(xì)胞增厚明顯緩解，真皮炎性細(xì)胞浸潤及炎性因子表達(dá)顯著下調(diào)。此外，C5aR1a阻斷C5a/C5aR1通路后，IMQ誘導(dǎo)銀屑病樣皮炎較對照組明顯減輕。進(jìn)一步證實(shí)，補(bǔ)體C5a/C5aR1通路介導(dǎo)銀屑病病理過程，阻斷該通路可能成為銀屑病治療的新策略。

分泌IL-17A的γδ T細(xì)胞是銀屑病進(jìn)展的主要推手之一，并與銀屑病嚴(yán)重程度密切相關(guān)[10-11]。本研究結(jié)果表明，IL-17A主要來源于γδ T細(xì)胞，與已發(fā)表研究結(jié)果一致[12]。進(jìn)一步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C5aR1缺陷后腋窩引流淋巴結(jié)及皮損組織局部IL-17A+細(xì)胞及γδ T cells細(xì)胞百分率明顯減少。C5aR1信號阻斷后(C5aR1缺陷或者C5aR1a阻斷)IL-17A+γδ TCR+Tγδ17 細(xì)胞頻率明顯下降。此外，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C5a單獨(dú)刺激對γδ T細(xì)胞IL-17A表達(dá)無明顯影響，而C5a聯(lián)合IL-23則能顯著上調(diào)γδ T細(xì)胞IL-17A分泌，但C5aR1a阻斷C5aR1后這種協(xié)同刺激作用則明顯減弱。因此，上述結(jié)果表明，補(bǔ)體C5a/C5aR1通路促γδ T細(xì)胞IL-17A表達(dá)介導(dǎo)銀屑病病理過程。然而，該動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否能夠反映臨床銀屑病病理過程尚需后期更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究利用C5aR1敲除及C5aR1a阻斷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體C5a/C5aR1通路介導(dǎo)銀屑病病理過程， 機(jī)制研究表明C5a/C5aR1通路促進(jìn)γδ T細(xì)胞IL-17A分泌，表明C5a/C5aR1通路促γδ T細(xì)胞IL-17A表達(dá)介導(dǎo)銀屑病病理過程。因此，研制特異性阻斷C5a/C5aR1通路的藥物可能成為銀屑病治療的新途徑。