超薄切片電鏡在肉瘤樣腎細(xì)胞癌病理活檢中的應(yīng)用

武良美，王 璇，程 凱，馬恒輝，陸珍鳳，饒 秋，陳 輝

超薄切片電鏡是生物透射電鏡樣品制備中最經(jīng)典、最基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，該技術(shù)在活檢病理診斷特別是慢性腎臟疾病和肝臟代謝性疾病診斷中應(yīng)用廣泛[1]。隨著免疫組化和分子病理技術(shù)的發(fā)展，其在腫瘤病理診斷中的應(yīng)用已逐漸被邊緣化。盡管如此，該方法在細(xì)胞凋亡、超微結(jié)構(gòu)病理觀察以及腫瘤鑒別診斷方面的研究仍具有廣闊的應(yīng)用前景。肉瘤樣腎細(xì)胞癌(sarcomatoid renal cell carcinoma, sRCC)是指腎癌細(xì)胞發(fā)生肉瘤樣分化的一種特殊病理學(xué)改變，可發(fā)生于所有腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma, RCC)亞型中[2]。其發(fā)生率為1.6%～5.1%，具有典型的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后差[3]。目前，尚未有針對(duì)sRCC內(nèi)超微結(jié)構(gòu)特征觀察的研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用超薄切片電鏡技術(shù)對(duì)sRCC活檢病理診斷進(jìn)行觀察，總結(jié)不同sRCC亞型腫瘤細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的特征，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2021年1～10月中國(guó)人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院存檔的2例術(shù)中冷凍病理診斷為sRCC的標(biāo)本，患者均為男性，年齡47、76歲。根據(jù)WHO/ISUP(2016)泌尿系統(tǒng)腫瘤分類、分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，1例診斷為透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌伴肉瘤樣分化(clear cell renal cell carcinoma with sarcomatoid differentiation, sccRCC)，另1例診斷為嫌色細(xì)胞腎細(xì)胞癌伴肉瘤樣分化(chromophobe renal cell carcinoma with sarcomatoid differentiation, scRCC)，均為WHO/ISUP 4級(jí)。

1.2 方法

1.2.1冷凍切片HE染色 腫瘤新鮮組織均采用OCT包埋、Leica CM1950冷凍切片機(jī)6 μm厚連續(xù)切片、75%乙醇固定的常規(guī)術(shù)中冷凍方式進(jìn)行操作，用于HE染色。

1.2.2電鏡超薄切片 根據(jù)術(shù)中冷凍切片HE染色結(jié)果對(duì)新鮮組織塊進(jìn)行如下操作：(1)取材：分別取sccRCC及scRCC肉瘤樣變區(qū)新鮮組織塊，小于1 mm3。(2)固定：2.5%戊二醛1～2 h，PBS洗15 min×3次；1%餓酸2～3 h，PBS洗15 min×3次。(3)脫水：組織塊依次經(jīng)50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇與90%丙酮(1 ∶1)、90%丙酮及100%丙酮室溫各15～20 min。(4)包埋：純丙酮+包埋液(2 ∶1)室溫3～4 h，純丙酮+包埋液(1 ∶2)室溫過(guò)夜，純包埋液37 ℃ 2～3 h。(5)固化：37 ℃烤箱過(guò)夜，45 ℃烤箱內(nèi)12 h，60 ℃烤箱24 h。(6)切片：超薄切片機(jī)切片，厚約70 nm。(7)染色：3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。(8)JEM-1011透射電鏡觀察，拍片。

2 結(jié)果

2.1 光鏡觀察sccRCC細(xì)胞呈圓形或多邊形，體積較大，胞膜清楚，呈透明狀，胞質(zhì)豐富淡染，少量紅染，核呈粗顆粒狀，略呈空泡狀，核分裂象多見(jiàn)，可見(jiàn)少量透明細(xì)胞，周圍被大小不一的薄壁血管構(gòu)成網(wǎng)狀間隔。局部伴沙礫樣鈣化及間質(zhì)玻璃樣變，鈣化組織中見(jiàn)少量肉瘤樣梭形細(xì)胞(圖1)。scRCC細(xì)胞呈粉紅色顆粒狀細(xì)胞質(zhì)，胞質(zhì)嗜酸、核仁明顯、密集且大小不一，部分瘤細(xì)胞圓形或不規(guī)則形，局部含大量梭形細(xì)胞，呈束狀、編織狀排列，偶見(jiàn)淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2)。

①②③④

2.2 電鏡觀察sccRCC細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)脂滴，線粒體少見(jiàn)，并且糖原含量相對(duì)較少，未見(jiàn)細(xì)胞之間的緊密連接(橋粒)，腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)基膜樣物，少數(shù)還包裹類似吞噬小體(溶酶體)色深均質(zhì)物，微囊泡少見(jiàn)(圖3)。scRCC細(xì)胞內(nèi)未發(fā)現(xiàn)脂滴，伴有多個(gè)腫脹線粒體，并且糖原相對(duì)豐富，細(xì)胞之間可見(jiàn)大小不等的緊密連接，部分有刷狀微絨毛內(nèi)襯的腔隙，絕大多數(shù)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有數(shù)量不等的微囊泡(圖4)。

3 討論

病理醫(yī)師主要在光鏡下進(jìn)行腫瘤診斷，并輔以免疫組化等技術(shù)，但有些疾病或分化較差腫瘤的診斷及鑒別診斷必須依賴電鏡甚至是超薄切片電鏡[4]。超薄切片電鏡的分辨率可達(dá)80萬(wàn)倍以上(0.3～0.4 nm)，能夠觀察到組織內(nèi)各細(xì)胞器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞之間的連接類型，因此其在腫瘤的鑒別診斷中具有較大的優(yōu)勢(shì)。

由于sRCC組織學(xué)結(jié)構(gòu)類似橫紋肌肉瘤，免疫組化同時(shí)表達(dá)上皮和間葉組織抗原的雙向標(biāo)記，在光鏡下對(duì)sRCC亞型進(jìn)行分類較難[5-6]。因此，本實(shí)驗(yàn)首次采用超薄切片電鏡進(jìn)行觀察，sccRCC與scRCC在糖原、脂肪生成、線粒體、微絨毛、微囊泡等超微結(jié)構(gòu)方面差異明顯，說(shuō)明確實(shí)存在特殊的肉瘤樣變的腫瘤微環(huán)境和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性[7-8]，這就使現(xiàn)有的大規(guī)模研究數(shù)據(jù)(包括RNA、全外顯子、單細(xì)胞測(cè)序等)與組織學(xué)表型的聯(lián)系越來(lái)越復(fù)雜化[9-10]。作者猜測(cè)這些復(fù)雜的機(jī)制可能與腫瘤的異常代謝機(jī)制相關(guān)。由于sRCC發(fā)生率較低，其各亞型間也具有差異[3]，導(dǎo)致新鮮病例的收集率較低，今后在實(shí)際工作中要多與臨床醫(yī)師溝通、合作，為接下來(lái)更深入探索RCC細(xì)胞發(fā)生高級(jí)別(肉瘤樣)轉(zhuǎn)變代謝機(jī)制方面的研究準(zhǔn)備好充足的臨床資源。

總之，作為一種在超微結(jié)構(gòu)水平的定位技術(shù)手段，超薄切片電鏡下觀察sRCC結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，為腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)研究及臨床診斷提供有價(jià)值的證據(jù)。近年來(lái)，隨著電鏡光學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，再結(jié)合免疫組化、分子病理技術(shù)等，其將在腫瘤臨床及科研工作中具有更廣泛的應(yīng)用前景，發(fā)揮其更大的作用。